理肺散提取物乙酸乙酯層的化學(xué)成分及其對(duì)RGC-5細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究*

王鈺君，尹國(guó)平，胡昌華，曾令高，熊有明△

（1.西南大學(xué)藥學(xué)院·黃連開(kāi)發(fā)與利用教育部工程研究中心，重慶 400716；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質(zhì)量監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401121）

理肺散為茜草科耳草屬植物攀援耳草Hedyotis scandensRoxb.的全株，又名涼喉茶、接骨丹等，為我國(guó)白族、傣族、納西族、傈僳族等民間常用藥食兩用植物。理肺散性涼，味苦，歸肺、腎經(jīng)，具有清熱解毒、理肺止咳、潤(rùn)肺化痰、接骨續(xù)筋等功效，主治肺結(jié)核、肺炎、支氣管炎、咽喉腫痛、骨折等［1］。研究表明，耳草屬植物的主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、生物堿類(lèi)等，其主要藥理學(xué)活性為抗腫瘤、抗菌、鎮(zhèn)痛、消炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等［2］。理肺散用途廣泛且資源豐富，其發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)具有巨大的研究?jī)r(jià)值。但目前關(guān)于理肺散化學(xué)成分的研究?jī)H有3篇文獻(xiàn)報(bào)道，從其乙醇提取物中分離鑒定了28 個(gè)化合物，包括黃酮類(lèi)6 個(gè)、三萜類(lèi)6 個(gè)、甾體類(lèi)1 個(gè)、酚酸類(lèi)15 個(gè)［3-5］。本課題組前期對(duì)該植物全株的水提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分和抗結(jié)核活性研究，在此基礎(chǔ)上，本研究中進(jìn)一步對(duì)理肺散提取物乙酸乙酯層的化學(xué)成分進(jìn)行研究，并以丙泊酚誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷為活性評(píng)價(jià)模型，探討各化合物對(duì)RGC-5細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與細(xì)胞

1.1 儀器

400 MHz 核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；LC110 型制備型高效液相色譜儀（賽譜銳思<北京>科技有限公司）；LC-20A 分析型和制備型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；C18制備色譜柱（250 mm×10 mm，日本YMC 公司；250 mm × 20 mm，日本Shimadzu 公司）；Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；MCO-15AC-SC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）。

1.2 試藥

柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；甲醇（色譜純，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；乙酸乙酯、石油醚（分析純，重慶川東化工<集團(tuán)>有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為D2650）；Dulbecco改良的Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）/F12 培養(yǎng)基（批號(hào)為C11330500BT），胎牛血清（批號(hào)為10099-141），均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胰蛋白酶（批號(hào)為C0201），青霉素-鏈霉素溶液（100X）（批號(hào)為C0222），CCK-8 試劑盒（批號(hào)為C0039），均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；丙泊酚（美國(guó)Aspen 公司，批號(hào)為SA084）；理肺散采自云南大理，經(jīng)西南大學(xué)胡昌華教授鑒定為正品。

1.3 細(xì)胞

小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)RGC-5細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)為BNCC359850）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取理肺散干燥全草20 kg，粉碎，用鹽酸水溶液（pH=5）加熱回流提取3 次，每次2 h，濃縮得水提浸膏3 kg。藥渣用95%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，濃縮得醇提浸膏1 kg。將浸膏以1∶2（m∶V）的比例加水混懸，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至9～10，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別得水提浸膏乙酸乙酯層140.0 g 和醇提浸膏乙酸乙酯層171.3 g。

水提浸膏乙酸乙酯層通過(guò)中性氧化鋁色譜柱分離，利用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得7 個(gè)組分（Fr.A1～Fr.A7）。Fr.A1（10.6 g）經(jīng)MCI柱色譜分離，得31個(gè)亞組分（Fr.A1.1～Fr.A1.31）；Fr.A1.13經(jīng)制備液相色譜（93%甲醇）分離，得化合物12（32.5 mg）。Fr.A3（12.1 g）經(jīng)MCI柱色譜分離，得80個(gè)亞組分（Fr.A3.1～Fr.A3.80）；Fr.A3.24 經(jīng)制備液相色譜（27%甲醇）分離，得化合物14（10.2 mg）；Fr.A3.27 經(jīng)制備液相色譜（33%甲醇）分離，得化合物15（12.2 mg）；Fr.A3.64 經(jīng)制備液相色譜（66%甲醇）分離，得化合物11（5.1 mg）；Fr.A3.76經(jīng)制備液相色譜（67%甲醇）分離，得化合物1（6.7 mg）。Fr.A4（6.4 g）經(jīng)MCI 柱色譜分離，得30 個(gè)亞組分（Fr.A4.1～Fr.A4.30）；Fr.A4.13經(jīng)制備液相色譜（41%甲醇）分離，得化合物3（7.4 mg）；Fr.A4.16 經(jīng)制備液相色譜（46%甲醇）分離，得化合物4（7.0 mg）和化合物5（16.0 mg）；Fr.A4.21 經(jīng)制備液相色譜（56%甲醇）分離，得化合物6（4.8 mg）；Fr.A4.23經(jīng)制備液相色譜（51%甲醇）分離，得化合物8（10.3 mg）。

醇提浸膏乙酸乙酯層通過(guò)硅膠色譜柱分離，利用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得10個(gè)組分（Fr.B1～Fr.B7）。Fr.B3（7.2 g）經(jīng)MCI 柱色譜分 離，得34 個(gè)亞組分（Fr.B3.1～Fr.B3.34）；Fr.B3.10經(jīng)制備液相色譜（63%甲醇）分離，得化合物13（6.9 mg）。Fr.B4（13.4 mg）經(jīng)MCI 柱色譜分離，得36 個(gè)亞組分（Fr.B4.1～Fr.B4.36）；Fr.B4.24 經(jīng)制備液相色譜（85%甲醇）分離，得化合物9（8.4 mg）和化合物10（18.4 mg）。Fr.B5（14.39 mg）經(jīng)MCI 柱色譜分離，得60 個(gè)亞組分（Fr.B5.1～Fr.B5.60）；Fr.B5.16 經(jīng)制備液相色譜（48%甲醇）分離，得化合物7（6.7 mg）；Fr.B5.37 經(jīng)制備液相色譜（74%甲醇）分離，得化合物2（9.7 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物1

黃色油狀物。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：6.84（1H，d，J=7.9 Hz，H-5），6.78（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），6.73（1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6），5.34（1H，m，H-14），5.29（1H，m，H-13），4.33（2H，d，J=5.6 Hz，H-7），3.85（3H，s，3-OCH3），2.18（3H，dd，J=9.2，6.0 Hz，H-9，15），1.96（2H，m，H-12），1.63（2H，m，H-10），1.36（2H，m，H-11），0.93（6H，d，J=6.8 Hz，H-16，17）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：130.7（C-1），110.9（C-2），146.9（C-3），145.4（C-4），114.6（C-5），121.0（C-6），43.8（C-7），173.0（C-8），36.9（C-9），25.6（C-10），29.5（C-11），32.4（C-12），126.7（C-13），138.3（C-14），31.2（C-15），22.9（C-16），22.9（C-17），56.2（3-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道基本一致，故鑒定為capsaicin。

2.2.2 化合物2

黃色油狀物。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.16（1H，t，J=5.9 Hz，4-OH），6.79（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），6.68（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.62（1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6），4.13（2H，d，J=5.8 Hz，H-7），3.72（3H，s，3-OCH3），2.09（2H，t，J=7.3 Hz，H-9），1.49（3H，m，H-10，16），1.23（8H，m，H-11，12，13，14），1.12（2H，q，J=6.7Hz，H-15），0.84（6H，d，J=6.6 Hz，H-17，18）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：130.5（C-1），111.6（C-2），147.8（C-3），145.3（C-4），115.1（C-5），119.6（C-6），41.8（C-7），171.9（C-8），35.4（C-9），25.3（C-10），28.7（C-11），28.7（C-12），29.0（C-13），26.7（C-14），38.4（C-15），27.3（C-16），22.5（C-17），22.5（C-18），55.5（3-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道基本一致，故鑒定為 homodihydrocapsaicin Ⅰ。

2.2.3 化合物3

黃色油狀物。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.59（2H，s，4-OH，4'-OH），6.63（4H，d，J=7.9 Hz，H-2，5，2'，5'），6.50（2H，dd，J=7.9，1.9 Hz，H-6，6'），4.50（2H，t，J=5.0 Hz，9-OH，9'-OH），3.68（6H，s，3-OCH3，3'-OCH3），3.38（4H，dd，J=8.2，4.5 Hz，H-9，9'），1.82（2H，m，H-8，8'）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：132.2（C-1，1'），113.0（C-2，2'），147.2（C-3，3'），144.3（C-4，4'），115.0（C-5，5'），121.1（C-6，6'），34.0（C-7，7'），42.5（C-8，8'），60.2（C-9，9'），55.4（3-OCH3，3'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道基本一致，故鑒定為secoisolari-ciresinol。

2.2.4 化合物4

無(wú)色油狀物。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.76（2H，d，4-OH，4'-OH），6.82（1H，d，J=1.7 Hz，H-2'），6.74（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），6.69（1H，s，H-6'），6.67（2H，m，H-5，5'），6.57（1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6），4.64（1H，d，J=6.3 Hz，H-7'），3.86（1H，dd，J=8.2，6.5 Hz，H-9），3.74（3H，s，3-OCH3），3.73（3H，s，3'-OCH3），3.65（1H，dd，J=10.8，7.3 Hz，H-9'），3.54（1H，dd，J=8.2，6.5 Hz，H-9），3.45（1H，dd，J=10.8，7.3 Hz，H-9'），2.82（1H，dd，J=13.5，4.8 Hz，H-7），2.57（1H，m，H-8），2.41（1H，dd，J=13.4，10.9 Hz，H-7），2.18（1H，p，J=6.9 Hz，H-8'）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：131.7（C-1），112.7（C-2），147.3（C-3），144.5（C-4），115.0（C-5），120.5（C-6），32.1（C-7），41.9（C-8），71.8（C-9），134.6（C-1'），110.0（C-2'），147.4（C-3'），145.5（C-4'），115.3（C-5'），118.1（C-6'），81.7（C-7'），52.3（C-8'），58.6（C-9'），55.6（3-OCH3），55.5（3'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道基本一致，故鑒定為lariciresinol。

2.2.5 化合物5

無(wú)色油狀物。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：6.95（1H，s，H-6），6.92（2H，d，J=6.0 Hz，H-2，2'），6.76（2H，s，H-5，6'），6.47（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.21（1H，dt，J=15.9，5.3 Hz，H-8），5.46（1H，d，J=6.6 Hz，H-7'），4.09（1H，d，J=3.8 Hz，H-9），3.80（3H，s，3-OCH3），3.75（3H，s，3'-OCH3），3.66（2H，m，H-9'），3.45（1H，q，J=6.4 Hz，H-8'）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：132.3（C-1），110.4（C-2），147.5（C-3），146.4（C-4），115.3（C-5），118.5（C-6），87.2（C-7），53.0（C-8），62.9（C-9），129.5（C-1'），110.4（C-2'），143.6（C-3'），147.1（C-4'），130.5（C-5'），114.9（C-6'），128.9（C-7'），128.0（C-8'），61.6（C-9'），55.7（3-OCH3），55.6（3'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道基本一致，故鑒定為dehydrodiconiferyl alcohol。

2.2.6 化合物6

白色固體。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：9.23（1H，s，4'-OH），7.96（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），7.03（1H，d，J=1.9 Hz，H-5），6.92（1H，s，H-6'），6.88（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-5'），6.82（1H，d，J=8.1 Hz，H-2'），6.34（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），4.99（1H，d，J=7.9 Hz，H-7'），4.32（1H，m，H-8'），3.78（6H，d，J=2.4 Hz，6-OCH3，3'-OCH3），3.67（1H，m，H-9'）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：160.0（C-2），113.2（C-3），144.8（C-4），100.8（C-5），145.3（C-6），137.1（C-7），131.7（C-8），138.0（C-9），111.2（C-10），126.7（C-1'），112.1（C-2'），147.6（C-3'），147.3（C-4'），115.4（C-5'），120.8（C-6'），76.2（C-7'），77.8（C-8'），59.8（C-9'），55.9（6-OCH3），55.8（3'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本一致，故鑒定為cleomiscosin A。

2.2.7 化合物7

黃色油狀物。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：9.81（1H，s，H-7'），7.39（2H，d，H-2'，6'），6.88（3H，s，H-2，4，6），5.67（1H，d，J=7.1 Hz，H-7），3.97（2H，m，H-9），3.93（3H，s，3'-OCH3），3.85（3H，s，3-OCH3），3.69（1H，m，H-8）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：132.2（C-1），119.7（C-2），147.0（C-3），114.7（C-4），146.3（C-5），109.0（C-6），89.7（C-7），52.9（C-8），64.1（C-9），131.6（C-1'），112.5（C-2'），145.3（C-3'），154.3（C-4'），129.0（C-5'），121.1（C-6'），190.8（C-7'），56.2（3-OCH3），56.3（3'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道基本一致，故鑒定為curcasinlignan B。

2.2.8 化合物8

黃色油狀物。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：6.56（4H，br，s，H-2，2'，6，6'），5.51（2H，br，s，H-4，4'），4.71（2H，br，s，H-7，7'），4.26（2H，m，H-9，9'），3.88（14H，br，s，H-9，9'，11，11'，12，12'），3.07（2H，br，s，H-8，8'）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：132.3（C-1，1'），103.0（C-2，2'，6，6'），147.4（C-3，3'，5，5'），134.5（C-4，4'），86.3（C-7，7'），54.4（C-8，8'），72.0（C-9，9'），56.4（C-11，11'，12，12'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道基本一致，故鑒定為syringaresinol。

2.2.9 化合物9

白色粉末。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：5.15（1H，t，J=3.6 Hz，H-12），4.28（1H，s，H-3），1.08（3H，s，H-27），0.88（3H，s，H-30），0.86（3H，s，H-29），0.84（3H，s，H-25），0.71（3H，s，H-24），0.66（3H，s，H-23）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：38.0（C-1），26.9（C-2），76.8（C-3），38.3（C-4），54.8（C-5），18.0（C-6），32.4（C-7），38.9（C-8），47.1（C-9），36.6（C-10），22.9（C-11），121.5（C-12），143.8（C-13），41.3（C-14），27.2（C-15），23.3（C-16），45.7（C-17），40.8（C-18），45.4（C-19），30.4（C-20），33.3（C-21），32.1（C-22），28.2（C-23），16.0（C-24），15.1（C-25），16.8（C-26），25.6（C-27），178.5（C-28），32.8（C-29），22.6（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道基本一致，故鑒定為oleanolic acid。

2.2.10 化合物10

白色粉末。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：5.13（1H，s，H-12），3.00（1H，dd，J=10.3，5.6 Hz，H-3），2.11（1H，d，J=11.3 Hz，H-18），1.04（3H，s，H-23），0.92（3H，s，H-29），0.90（3H，s，H-27），0.87（3H，s，H-26），0.81（3H，s，H-30），0.75（3H，s，H-24），0.68（3H，s，H-25）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：38.2（C-1），26.9（C-2），76.8（C-3），38.5（C-4），54.8（C-5），18.0（C-6），32.7（C-7），41.6（C-8），46.8（C-9），36.3（C-10），22.8（C-11），124.5（C-12），138.2（C-13），41.6（C-14），27.5（C-15），23.8（C-16），47.0（C-17），52.4（C-18），38.4（C-19），38.3（C-20），30.2（C-21），36.5（C-22），28.2（C-23），15.2（C-24），16.0（C-25），16.9（C-26），23.2（C-27），178.2（C-28），16.9（C-29），21.0（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道基本一致，故鑒定為ursolic acid。

2.2.11 化合物11

白色固體粉末。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：8.21（2H，d，J=7.7 Hz，H-2'，6'），7.63（1H，t，J=7.7 Hz，H-4'），7.50（2H，t，J=7.7 Hz，H-3'，5'），7.10（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），6.96（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），6.90（1H，dd，J=8.1，2.0 Hz，H-6），3.82（3H，s，3-OCH3），3.72（3H，s，8-OCH3），3.64（2H，s，H-7）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：132.8（C-1），113.7（C-2），151.3（C-3），139.2（C-4），122.9（C-5），121.6（C-6），41.1（C-7），171.7（C-8），129.5（C-1'），130.3（C-2'，6'），128.5（C-3'，5'），133.4（C-4'），164.7（C-7'），56.0（3-OCH3），52.1（8-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道基本一致，故鑒定為methyl 4-benzoyloxy-3-methoxybenzeneacetate。

2.2.12 化合物12

無(wú)色油狀物。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：9.38（1H，s，H-20），6.64（1H，d，J=5.7 Hz，H-2），5.90（1H，d，H-3），5.10～4.98（2H，m，H-9，15），2.33（1H，d，J=17.8，1.5 Hz，H-5），2.16（4H，d，J=3.3 Hz，H-7，8），1.99（1H，d，J=17.8，1.5 Hz，H-5），1.92～1.73（3H，m，H-13，14），1.66（3H，s，Me-11），1.62（3H，s，Me-17），1.59（3H，s，Me-12），1.52（3H，s，Me-18），1.39～1.30（1H，m，H-13），1.16（3H，s，Me-19）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：141.5（C-1），145.8（C-2），118.0（C-3），150.8（C-4），42.0（C-5），36.2（C-6），37.8（C-7），25.6（C-8），123.2（C-9），132.3（C-10），17.7（C-11），25.2（C-12），38.4（C-13），25.7（C-14），124.8（C-15），131.1（C-16），25.2（C-17），17.9（C-18），23.9（C-19），193.3（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］報(bào)道基本一致，故鑒定為（R）-6-methyl-4，6-bis（4-methylpent-3-enyl）cyclohexa-1，3-dienecarbaldehyde。

2.2.13 化合物13

黃色固體。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.24（2H，dd，J=5.9，3.3 Hz，H-5，8），8.12（1H，d，J=8.4 Hz，H-4），7.75（2H，m，H-6，7），7.33（1H，d，J=8.5 Hz，H-3），4.02（3H，s，1-OCH3）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：146.9（C-1），155.8（C-2），120.5（C-3），126.0（C-4），127.3（C-5），134.1（C-6，7），127.0（C-8），182.7（C-9），182.3（C-10），133.2（C-11），134.7（C-12），125.9（C-13），127.8（C-14），62.5（1-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］報(bào)道基本一致，故鑒定為2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone。

2.2.14 化合物14

白色固體。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.89（1H，d，J=9.4 Hz，H-4），7.03（1H，s，H-5），7.01（1H，s，H-8），6.23（1H，d，J=9.4 Hz，H-3），3.86（3H，s，Me-11）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：160.7（C-2），112.5（C-3），144.3（C-4），111.9（C-5），143.9（C-6），151.9（C-7），100.0（C-8），148.3（C-9），111.5（C-10），56.1（C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］報(bào)道基本一致，故鑒定為isoscopoletin。

2.2.15 化合物15

白色固體。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：12.18（1H，s，NH-1），9.94（1H，s，CHO-10），8.28（1H，s，H-2），8.10（1H，d，J=7.8 Hz，H-4），7.51（1H，d，J=7.8 Hz，H-7），7.23（2H，m，H-5，6）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：138.4（C-2），118.1（C-3），123.4（C-4），122.1（C-5），120.8（C-6），112.6（C-7），137.1（C-8），124.1（C-9），184.9（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］報(bào)道基本一致，故鑒定為1H-indole-3-carboxaldehyde。

2.3 生物活性評(píng)價(jià)

細(xì)胞毒性篩選：將RGC-5細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，以每孔1×103個(gè)的密度接種于96孔板（每孔100μL），培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和化合物組，棄上清液，化合物組每孔加入100 μL 不同濃度（3.75，7.5，15，30 μmol/L）的待測(cè)化合物，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（OD化合物組-OD空白對(duì)照組）/（OD溶劑對(duì)照組-OD空白對(duì)照組）×100%。重復(fù)試驗(yàn)3 次。結(jié)果溶劑對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100.00%；藥物濃度為15μmol/L 時(shí)，化合物1，5，7-11，15 均表現(xiàn)出較好的細(xì)胞活力，其細(xì)胞存活率均大于86%；其他化合物在濃度為30μmol/L時(shí)也表現(xiàn)出較好的細(xì)胞活力，其細(xì)胞存活率均大于87%。故選擇細(xì)胞存活率不低于85%的藥物濃度對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)的RGC-5 細(xì)胞損傷模型進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，化合物15在30 μmol/L 濃度時(shí)細(xì)胞存活率存在一定差異，故選擇15μmol/L作為化合物15的給藥濃度。詳見(jiàn)表1。

表1 不同濃度化合物對(duì)RGC-5細(xì)胞的毒性（%）Tab.1 Toxic effects of compounds with different concentrations on RGC-5 cells（%）

RGC-5 細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用活性評(píng)價(jià)：將RGC-5 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，以每孔1×103個(gè)的密度接種于96孔板（每孔100μL），培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、模型組（400μmol/L丙泊酚）和化合物組（400μmol/L丙泊酚+15，30 μmol/L 待測(cè)化合物），棄上清液，按分組加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔加入10μL CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（OD化合物組-OD空白對(duì)照組）/（OD溶劑對(duì)照組-OD空白對(duì)照組）×100%。重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果與溶劑對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞出現(xiàn)明顯病理改變，細(xì)胞存活率顯著下降（100.00%比76.27%）；化合物1，4，6-8 對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)的RGC-5 細(xì)胞損傷均表現(xiàn)出一定的保護(hù)活性，其中化合物4，7 最強(qiáng)，分別使RGC-5 細(xì)胞的活力增加15.89%，13.09%。詳見(jiàn)表2。

表2 不同化合物對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷的保護(hù)活性Tab.2 Protective effects of different compounds on propofol-induced RGC-5 cell injury

3 討論

理肺散作為民間常用藥食兩用植物，應(yīng)用廣泛，資源豐富，是重要的民族藥。但目前對(duì)理肺散的研究較少，該資源未能被有效開(kāi)發(fā)與利用。本研究中理肺散提取物的乙酸乙酯層經(jīng)正相硅膠柱和MCI 柱等現(xiàn)代柱色譜技術(shù)進(jìn)行分離，采用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行純化，應(yīng)用核磁共振法對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。最終共分離鑒定出15個(gè)化合物，分別為capsaicin（化合物1）、homodihydrocapsaicin Ⅰ（化合物2）、secoisolariciresinol（化合物3）、lariciresinol（化合物4）、dehydrodiconiferyl alcohol（化合物5）、cleomiscosin A（化合物6）、curcasinlignan B（化合物7）、syringaresinol（化合物8）、oleanolic acid（化合物9）、ursolic acid（化合物10）、methyl 4-benzoyloxy-3-methoxybenzeneacetate（化合物11）、（R）-6-methyl-4，6-bis（4-methylpent-3-enyl）cyclohexa-1，3-dienecarbaldehyde（化合物12）、2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone（化合物13）、isoscopoletin（化合物14）、1H-indole-3-carboxaldehyde（化合物15）。其中，化合物1-7 為首次從耳草屬中分離發(fā)現(xiàn)，化合物9-10，13 為首次從理肺散中分離發(fā)現(xiàn)。以丙泊酚誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷為活性評(píng)價(jià)模型，采用CCK-8 法評(píng)估各化合物對(duì)RGC-5 細(xì)胞的保護(hù)作用，活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，化合物1，4，6-8對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷均表現(xiàn)出一定的保護(hù)活性，其中化合物4、化合物7活性最強(qiáng)，為理肺散的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。