東北貫眾提取分離及其有效成分探討

摘要：探討從東北貫眾植物中成功提取并分離具有止血和子宮平滑肌收縮活性的化學成分。采用傳統的滲漉法和聚酰胺色譜技術對東北貫眾的有效成分進行了提純和分析。使用乙醚作為溶劑通過滲漉法將東北貫眾中的活性物質提取出來；然后用聚酰胺柱子進一步分離這些化合物并進行薄層層析鑒別其結構。經檢測發現，在東北貫眾中主要的活性成分為以下3種：東北貫眾素ABBA（質量分數約為4.01%）、綿馬酸ABA（質量分數約為1.78%）和白綿馬素AA（質量分數約為0.05%）。該方法簡便可行且重復性好，成功地將東北貫眾中的多種活性成分進行了有效的分離和鑒定，為進一步研究和開發該植物的藥用價值提供了有力支持。

關鍵詞：綿馬貫眾；提取；分離；有效成分；鑒定貫眾是一種常見的中藥，最早記載于《神農本草經》，其性質偏寒涼且味道苦澀，歸肝和胃經。主要功能有清熱解毒、驅蟲以及止血等。然而貫眾的種類非常繁多，據統計，在中國的9科17屬49種及其變種變型都屬于蕨類植物。而東北貫眾是其中的主流品種之一，源自于鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨（Dryopteris Crassirhizoma Nakai）帶葉柄基的根莖。該植物中主要活性成分的總衍生物具備多種藥效，如驅蟲、抗腸道細菌、抗病毒、抗癌、止血及對子宮平滑肌具有收縮作用。

東北貫眾又叫綿馬貫眾，綿馬貫眾的化學成分非常豐富。主要含間苯三酚衍生物綿馬精（filmarone）。綿馬精性質不穩定，能緩慢分解產生綿馬酸類（fiticic acids），包括綿馬酸；黃綿馬酸類（flaraspidic acids），包括黃綿馬酸；白綿馬素類（albaspidins），包括白綿馬素；去甲綿馬素類（desaspidins），包括去甲綿馬素；及綿馬酚（aspidinol），綿馬次酸（filicinic acid）等。在這些化合物中，綿馬精的驅蟲效力最強，綿馬酸、黃綿馬酸、白綿馬素、去甲綿馬素類次之，綿馬酚及綿馬次酸近于無效，其中東北貫眾素（dryocrassin）為綿馬貫眾的主要成分［1］。總之，不同品種的貫眾可能含有不同的活性化學成分并具有各自的藥理效應。這些化合物的深入研究將有助于進一步開發其在醫藥領域的應用潛力。

1實驗

1.1實驗材料

原藥材：東北貫眾。

儀器：滲漉器、電子天平、電磁攪拌器、分液漏斗、玻板（20 cm×20 cm）、P形管。

試藥：硅膠G（青島海洋化工廠），磷酸氫二鈉，檸檬酸，CMCNa，固蘭B鹽，維生素C，正己烷（分析純），氯仿（分析純），甲醇（分析純），乙醚（分析純），FeCl3試液，乙醇，2%對二甲氨基苯甲醛試液、1%香草醛鹽酸溶液，10%NaOH水溶液，10%鹽酸水溶液。

1.2提取和分離

對綿馬貫眾粗粉的提取和分離過程，可以按照以下步驟進行操作：

（1） 冷浸漬：將綿馬貫眾粗粉（20目）用低沸點的石油醚（30～60 ℃）冷浸泡隔夜，使其與石油醚充分接觸。

（2） 除去浸出液：將浸泡后的終末浸液倒掉，去除石油醚中溶解的目標物。

（3） 溶劑滲漉：使用乙醚作為溶劑，進行滲漉過濾（5 mL/min），將乙醚滲漉液收集至分液漏斗中。

（4） 醚層處理：向分液漏斗中加入10%的NaOH水溶液，使乙醚層逐漸變為無色，而NaOH水液層變黃。可以分次加入較少量的NaOH水溶液并多次反復操作，以達到最佳效果。

（5） 分液：將水溶液與醚層分離開來，得到目標物在乙醚層中。

（6） 中和：將10%的HCl加入水溶液中，中和多余的氫氧化鈉。但是水溶液仍然保持弱堿性（pH 8～9）。

（7） 通入CO2氣：向溶液中通入CO2氣體，這會導致溶液的顏色由橙黃變為草黃，同時溶液呈現出弱酸性（pH 5～6）。

（8） 乙醚提取：收集通入CO2的水液層，通過使用乙醚進行提取。此時可觀察到水液層由渾濁變為澄清，而乙醚層轉為橙色。

（9） 濃縮：棄掉水液層后，將乙醚層在恒溫（40 ℃）條件下在電磁攪拌器上進行濃縮，使其逐漸形成流浸膏。

（10） 沉淀析出：將濃縮后的乙醚溶液放置，可觀察到黃褐色沉淀的析出。

（11） 抽濾：對沉淀進行抽濾，用乙醚洗滌沉淀。

（12） 結晶：得到黃色結晶性粉末，再用乙酸乙酯進行加熱溶解，然后冷析，并通過過濾得到黃色結晶和母液兩部分。

（13） 反復結晶：取得黃色結晶，進行反復結晶操作，以得到綿馬貫眾素ABBA。

（14） 硅膠柱層析：將乙酸乙酯母液部分減壓濃縮至干，然后進行硅膠柱層析。使用環己烷無水乙醇（體積比為95∶5）作為洗脫劑，收集前沿黃色色帶部分濃縮至干。

（15） 再次層析：使用環己烷無水乙醇（體積比為1∶1）進行硅膠柱層析，收集洗脫液，每份20 mL，在第1～4份中得到化合物綿馬酸ABA，在第9～12份中得到化合物白綿馬素AA。

此3種化合物為綿馬貫眾中所含的主要有效活性化合物。提取和分離的過程分為多個步驟，包括浸泡、滲漉、中和、通氣、提取、濃縮、沉淀析出、抽濾、結晶和層析等操作，最終可以得到綿馬貫眾中的主要有效活性化合物。

1.3薄層條件及分析

薄層板制備：

—取硅膠G 10 g

—加磷酸氫二鈉檸檬酸的緩沖液（pH=7）10 mL

—維生素C 100 mg

—0.5% CMC-Na溶液20 mL

—調勻，鋪在20 cm×20 cm的薄層板上

—涼干，于50 ℃活化21 h

展開劑：

—正己烷氯仿甲醇（30∶15∶1）

—先將點上樣的板放在展開缸中飽和2 h后

—展開，展距為18 cm

顯色劑：

—0.2%固蘭B鹽的50%乙醇溶液

—采用2次展開

—多次噴霧

—涼干后，于40 ℃條件下顯色，保持1 h使顯色完全

東北貫眾素ABBA和綿馬酸ABA以及白綿馬素AA分離良好。

1.4聚酰胺柱色譜分離鑒定

原理：聚酰胺柱色譜，其洗脫順序，即吸附強度主要取決于化合物分子中羥基的數目與位置及溶劑與化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小，以及與化合物分子中芳香核共軛雙鍵有關。

因而其洗脫順序為：白綿馬素AA、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA。3種化合物分別用丙酮重結晶和用毛細管法測其熔點得：白綿馬素AA（C21H24O8）：丙酮結晶得無色針狀結晶（m.p.167～169 ℃）；綿馬酸ABA（C32H36O12）：丙酮重結晶得黃色針狀結晶（熔點164～165 ℃）；綿馬貫眾素（C42H48O16）：丙酮重結晶得黃色小板狀結晶（熔點215～218 ℃）。

以上數據與文獻值一致，因此證明以上3種化合物分別為白綿馬素AA、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA［2］。并分別測得其質量分數為0.05%，1.78%和4.01%（見表1）。

1.5理化鑒定

（1） 取本品的乙醚提取液，加入2%對二甲氨基苯甲醛試液，觀察到液體呈現紅棕色，并且隨著時間的推移，放置后逐漸產生沉淀（檢查間苯三酚衍生物）。

（2） 取貫眾的葉柄基部或根莖的橫切面切片，滴加1%香草醛溶液和鹽酸，通過顯微鏡觀察，可以看到間隙腺毛呈現紅色（檢查植物中酚性物質）。

（3） 將本品的乙醚提取液加入試管中，滴加FeCl3水液，并進行振搖。觀察到位于下層的黃色FeCl3水液變為藍色。這證明了樣品中含有酚類化合物。

（4） 將L亮氨酸加入貫眾的乙醇提取液中，可以觀察到棕色絮狀沉淀的形成。這證明貫眾中含有大量鞣質成分。

1.6藥理實驗

在實驗中，選取體重為250～300 g的雌性大白鼠作為研究對象。首先，給這些大白鼠皮下注射劑量0.4～0.6 mg的己烯雌酚。注射后24 h，取出它們的子宮進行觀察。為了測量藥物對子宮收縮的影響，將子宮一側懸掛在離體器官測定儀上，并穩定30 min。然后，描記正常子宮收縮曲線。接下來，加入待測藥物貫眾提取液，觀察和記錄給藥后對子宮平滑肌活動的影響。根據實驗描記的活動曲線分析，發現東北貫眾對大白鼠子宮平滑肌有明顯的收縮作用。

2結果與討論

（1） 在東北貫眾中，檢出了東北貫眾素ABBA、綿馬酸ABA和白綿馬素AA，其含量分別為4.01%、1.78%和0.05%。

（2） 間苯三酚類化合物對光、熱等條件非常敏感，易氧化分解，鋪板時加入適量的維生素C作為抗氧化劑，可以增加顯色斑點的穩定性［3］。

（3） 在薄層展開之前，將點樣好的板飽和2 h，這有助于展開后斑點的集中，并且可以得到較好的分離效果。同時，顯色完全與否對測定結果影響較大，因此，采用多次顯色法以保證顯色完全。

（4） 從其藥理實驗可知，東北貫眾具有明顯的止血作用，并且對大白鼠子宮平滑肌有明顯的收縮作用。

（5） 在提取貫眾中所含化學成分時，不宜像某些文獻資料中所說，使用Na2CO3或NaHCO3，而應使用NaOH作堿水處理成鹽。

（6） 綿馬貫眾中含有揮發性成分，高溫條件下容易揮發，導致取樣不準確。因此，提取方法最好采用滲漉法，冷浸漬法也可，但效果較差。應采用低溫（40～50 ℃）烘烤至恒重的方式取樣進行含量測定，以及薄層的活化和顯色等操作。

（7） 根據文獻報道，不同產地的綿馬貫眾中東北貫眾素和間苯三酚衍生物的含量差異較大。在科研和臨床使用時，建議盡量選擇用含量較高的道地藥材，如東北貫眾、淺裂鱗毛蕨貫眾等。

（8） 提取貫眾時，不宜首先使用堿水提取，因為其主要化學成分是酚類物質，而鞣質也是復雜的多元酚類。以致后實驗不易把鞣質棄除，應該利用鞣質不溶于無水乙醚、氯仿、石油醚等溶劑的特點進行提取。同時，也不建議使用氯仿作為溶劑提取。因為通過實驗證明：一是使用氯仿提取的效果不如使用乙醚好；二是在后實驗中作堿水處理成鹽時在分液漏斗中易發生乳化現象，不易分離有機層和水液層。

（9） 先用低沸點的石油醚（b.p.30～60 ℃）回流提取進行脫脂，以去除油脂、蠟和揮發油等成分。除盡石油醚改用乙醚作溶劑繼續提取。實驗結果表明，使用石油醚預處理的貫眾，其乙醚提取液中檢測出的酚類物質，比未經石油醚預處理的貫眾乙醚提取液中檢測出的酚類物質，與FeCl3反應時呈現出更明顯的鑒定效果。這樣做的優點是既可以去除不必要的雜質，又能夠提高酚類物質的提取效率。

參考文獻：

［1］馬國祥，徐國鈞，金蓉鸞，等.薄層色譜掃描法測定7種貫眾中東北貫眾素及綿馬酸ABA的含量［J］.中國藥科大學學報，1994（6）：376377.

［2］張思巨，艾鐵民，楊立新.綿馬貫眾貯存時間與藥材質量相關性研究［J］.中國中藥雜志，1996（4）：206207，254.

［3］黃玉陽，鄧瑞雪，高嘉嶼等.綿馬貫眾中新間苯三酚類化合物［J］.中國藥學雜志，2022，57（4）：269271.