芪地糖腎顆粒對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗、脂代謝及AdipoR1、AMPK蛋白的影響

張 穎,靳亦龍,周立新

(1.衡水市人民醫院內分泌科,河北 衡水 053000;2.衡水市第四醫院,河北 衡水 053000)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)作為臨床中較常見的一類代謝紊亂型疾病具有較高的發病率,而胰島素抵抗不僅是影響T2DM進程的重要因素,也是引起本病中脂代謝紊亂的關鍵誘因[1-2]。T2DM在臨床中常表現為代謝紊亂,而胰島素抵抗可與這類現象相互影響并產生惡性循環[3]。經研究,脂聯素通過與其受體結合可發揮多種生物學作用,而骨骼肌脂聯素受體1(Adiponectin receptor1,AdipoR1)作為其重要受體亞型之一,與脂聯素結合后可通過激活腺苷酸激活蛋白激酶蛋白(AMP-activated protein kinase,AMPK)調節腎小管間質p38激活絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-actvated protein kinase,p38MAPK)及葡萄糖代謝水平,進而參與疾病中脂肪酸氧化反應[4-5]。近年來,隨著中醫藥在疾病研究中的不斷深入,發現部分中藥在糖尿病中具有改善胰島素抵抗的潛能。因此,臨床中可以此作為切入點研制相關治療T2DM的相關藥物。中醫理論認為,糖尿病的病因在于陰虛氣滯、腎瘀精阻,而芪地糖腎顆粒作為中成藥是以明代張景岳提出的“真陰精氣”理論加以補腎填精為主要治療原則的方劑[6]。該方主要以熟地、生黃芪、芡實、山萸肉、水蛭、熟大黃、白花蛇舌草等多種成分組合而成。有學者研究發現,該方不僅可有效降低糖尿病患者蛋白尿水平,還在降低血糖及預防糖尿病腎病等方面具有一定療效[7-8]。本文通過探究芪地糖腎顆粒對T2DM胰島素抵抗、脂代謝及AdipoR1、AMPK等相關蛋白的作用機制,為該藥在相關疾病的臨床治療中提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF清潔級雄性Wistar大鼠50只,6～8周齡,體重160～220 g,購于北京維通利華動物技術有限公司,許可證號SCXK(京) 2018-0006,于我院動物實驗中心進行飼養,濕度50%～60%,溫度16～22 ℃,晝夜交替,自由進食飲水,本次動物實驗均嚴格按照我院動物倫理原則操作。

1.2 藥物與試劑 芪地糖腎顆粒(涿州東樂制藥公司,國藥準字Z20113036);胰島素放免試劑盒(北京科美東雅生物技術有限公司,批號：080829);蛋白檢測試劑盒(美國Sigma公司,批號：201208);ELISA試劑盒(美國R&D公司,批號：201211);p38MAPK、AMPK、AdipoR1抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司,貨號PL0305436、PL0502571、252007)。

1.3 實驗儀器 全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司,型號：AV5421);臺式離心機(武漢愛斯佩有限公司,型號：DM041 Ⅱ);全自動生化分析儀(深圳邁瑞有限公司,型號：BS-200)。

1.4 實驗方法 依據隨機數字表法將大鼠分為健康組、模型組及低、中、高劑量組。除健康組外其余組均參照文獻[9]建立糖尿病模型,高脂高糖喂養1周后腹腔注射2%鏈脲霉素25 mg/kg,取尾靜脈血測血糖>16.67 mmol/L為建模成功。健康組與模型組大鼠均1次/d給予等量0.9%氯化鈉溶液進行灌胃;芪地糖腎顆粒各劑量組給藥依據文獻[10]按中藥出藥率28.16%計算,人用藥量為26.2 g,用羧甲基纖維素液配制成濃度為低劑量1.31 g/kg、中劑量2.62 g/kg、高劑量5.24 g/kg的藥液,均于每日上午9：00前預熱30 min后灌胃1次,連續干預30 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 ELISA檢測大鼠血清中脂質代謝水平：給藥結束后禁食24 h,麻醉抽取腹部靜脈血1 ml,2000 r/min離心20 min,檢測總膽固醇(Total cholesterol,TC),高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C),低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C),甘油三酯(Triglyceride,TG)表達,操作步驟嚴格按照說明書標準進行測定。

1.5.2 酶聯免疫法測定胰島素抵抗：大鼠禁食12 h,用戊巴比妥鈉麻醉后,腹主動脈取血,放免法評估空腹胰島素(FINS),酶聯免疫法評估空腹血糖(FBG),依據文獻[11-12]以FBG與FINS乘積倒數的自然對數來表示,計算胰島素敏感性指數(ISI)=Ln[1/(FINS×FBG)]和胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5。

1.5.3 免疫印跡檢測AdipoR1、AMPK、p38MAPK：用2%戊巴比妥10 ml/kg麻醉處死大鼠,取50 mg骨骼肌組織,提取總蛋白試劑盒檢測濃度,電泳后將蛋白分離,轉PVDF膜,密封2 h,加抗體AdipoR1(1∶500)、AMPK(1∶500)、p38MAPK(1∶1000),4 ℃孵育24 h,洗滌,加二抗(1∶500), β-actin為內參,Image J軟件測得灰度值。

1.5.4 PCR檢測AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA：大鼠全身麻醉后取骨骼肌組織50 mg,液氮研磨,按TRIzol說明書提取并測定總RNA,合成cDNA,取2 μl cDNA行PCR反應,反應體系25 μl,反應條件：95 ℃,5 min預變性,90 ℃,15 s變性,70 ℃,30 s退火,75 ℃延伸30 s,共計40個循環,反應產物行瓊脂糖凝膠電泳分析,引物序列由上海生物工程公司合成,用Image MasterTMTotal La圖像分析系統分析基因表達量,見表1。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C、TG表達比較 見表2。與健康組比較,模型組血清HDL-C降低,LDL-C、TC、TG均升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量組血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清中TC、HDL-C、TG、LDL-C表達比較(mmol/L)

2.2 各組大鼠血清中FBC、FINS表達比較 見表3。與健康組比較,模型組血清中FBC、FINS均升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量組血清FBC、FINS均降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組血清FBC、FINS均降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組血清FBC、FINS均降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清中FBC、FINS表達比較

2.3 各組大鼠HOMA-IR、ISI表達比較 見表4。與健康組比較,模型組ISI降低,HOMA-IR升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量組ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05)。

表4 各組大鼠HOMA-IR、ISI表達比較

2.4 各組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白比較 見表5(圖1)。與健康組比較,模型組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05)。

圖1 各組AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白表達比較

表5 各組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白比較

2.5 各組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA比較 見表6。與健康組比較,模型組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05)。

表6 各組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA比較

3 討 論

臨床對于T2DM的治療常使用胰島素、雙胍類及磺脲類藥物等進行干預,盡管有一定療效,但也在一定程度上引發低血糖及腸道功能紊亂[13-14]。因此,現階段通過充分發揮中醫治療優勢進而尋找有效干預T2DM的方法至關重要。中藥黃芪是糖尿病及相關并發癥的常用治療藥物,對于多種疾病的治療均有明顯的功效。

T2DM在中醫學屬于“消渴”范疇,其病機主要是陰虛津虧與盛炙燥熱相互作用的結果,中醫病理將其總結為“濕炙不濟、腎虛津竭、脾損氣滯”[13-15]。而血脂代謝紊亂不僅是糖尿病產生的關鍵病因,也是誘發相關心血管病變的重要危險因素[16]。在T2DM中持續高血脂所產生的脂毒性不僅可對胰島β細胞產生不良作用,還對增加胰島素抵抗和破壞糖代謝功能具有重要影響[17-18]。文中結果顯示,T2DM大鼠HDL-C偏低,LDL-C、TC、TG偏高,給藥后,各劑量組HDL-C均有所升高,LDL-C、TC、TG也有所降低,其中以高劑量組脂代謝水平改善最為顯著,提示高劑量芪地糖腎顆粒對調節T2DM時期的脂質代謝水平療效確切。芪地糖腎顆粒中的生黃芪成分可以增加胰島素敏感性,通過改善脂肪細胞因子代謝抑制血清游離脂肪酸過度生成,進而改善T2DM時期的脂質代謝異常并調節免疫機制。且有學者在動物研究中發現,芪地糖腎顆粒在改善T2DM大鼠的足細胞損傷方面療效良好,并可通過調節相關信號功能發揮治療效用[19]。

胰島素抵抗是T2DM的病理基礎,可由多種途徑影響其作用環節并參與T2DM進程[20]。文中研究顯示,T2DM大鼠的ISI指數較低而FBC、FINS及HOMA-IR指數均較高,經不同劑量的芪地糖腎顆粒干預后各組大鼠的ISI指數有所升高,FBC、FINS及HOMA-IR指數也有所降低,其中以高劑量組表現最為顯著,提示高劑量芪地糖腎顆粒對改善T2DM大鼠的胰島素水平具有一定積極效用。胰島素抵抗是引起糖尿病及相關并發癥的“動力”根源,常表現為葡萄糖供應障礙,外周及骨骼肌組織的胰島素敏感性大幅度降低等[21]。現代醫學研究表明,腎的病理學機制與胰島素生物學效應相吻合,而腎虛也是胰島素抵抗的眾多因素之一。中藥芪地糖腎顆粒以養精溫補為主要治療原則,方中大黃可通經活絡,黃芪、熟地行氣溫精之效,山萸肉可止遺滋補,芡實固表養內,水蛭養腎通經,白花蛇舌草則有改善下焦濁濕和利于代謝效用。諸藥聯合應用可在補養調和、標本兼治的同時調節機體血糖代謝[22]。有學者在對早期糖尿病腎病的研究中發現,黃芪可參與糖尿病的胰島素抵抗調節過程[23]。由此推測,芪地糖腎顆粒改善T2DM的機制可能與多藥材共同作用相關,使藥物在發揮抑制機體脂肪酸生物合成及提高葡萄糖攝取的同時加快脂肪酸氧化,最終達到降低胰島素抵抗及胰島素敏感性的效用。

骨骼肌是機體重要的能量儲存中心,并在葡萄糖、脂質代謝等方面具有重要干預作用[24]。本文研究表明,T2DM大鼠骨骼肌中的AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均較低,而藥物干預后各組大鼠的AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均有不同程度的升高,其中以高劑量組升高最為顯著。脂聯素作為關鍵脂肪因子可在調節代謝功能的同時促進葡萄糖吸收,并對穩定機體能量平衡有著重要作用。脂聯素與AdipoR1相互作用可使AMPK產生磷酸化反應,進而參與調節外周組織對葡萄糖吸收及糖代謝時期靶分子葡萄糖的跨膜轉運過程,而AMPK能夠通過磷酸化下游靶分子激活p38MAPK進而參與調節脂肪代謝。有學者在研究中發現,黃芪可通過調節糖尿病中AdipoR1、AMPK、p38MAPK相關通路水平改善糖尿病大鼠脂質代謝及反應機制[25]。由此分析,高劑量的芪地糖腎顆粒配伍可能通過發揮中藥降糖及調節脂質代謝等機制,使部分信號發揮調節代謝功能及改善紊亂引發的胰島素敏感性降低現象。

綜上所述,芪地糖腎顆粒可對改善T2DM胰島素抵抗、脂代謝及AdipoR1、AMPK及p38MAPK等蛋白產生有一定調節作用,為臨床該藥治療T2DM提供科學依據。由于中藥成分復雜且在改善疾病中是多途徑的,本次研究對于藥物的具體調節路徑仍未完全闡明,有待進一步深入研究。