中藥基于鐵死亡機制防治肝癌研究進展

郭桓博,馬瑞雪,朱正望,朱平生

(河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046)

肝癌是各種慢性肝臟疾病的終末階段,有發病率高、隱匿性高、惡性程度高等特點。目前對于肝癌的治療主要有手術治療和放化療,但預后均不佳,患者治療依從性差。有研究表明,肝癌后期即使經過積極治療也容易復發,5年生存率僅為12.1%[1]。肝癌的發病與HBV的持續性高感染密切相關,我國乙肝患者數量龐大,是肝癌發病率居高不下的原因之一[2-3]。目前,肝癌的發病呈現出低齡化趨勢,由于肝癌易在肝內及肝外轉移的特點,肝癌患者的生活質量及預后常較差。因此,開辟中醫藥防治肝癌的思路,提高肝癌患者的治療效果,積極研究調控肝癌細胞死亡的新方式變得極為重要。

鐵死亡(Ferroptosis)是由DIXON等[4]于2012年首次提出的一種新型調控細胞死亡方式,與之前已知的細胞壞死、凋亡和自噬均有所不同。鐵死亡在肝癌的防治中有積極作用,通過激活肝癌細胞鐵死亡,提高肝癌細胞對鐵死亡的敏感性,可以導致肝癌細胞的壞死從而保護肝臟的正常功能[5-6];與此同時,抑制正常肝細胞鐵死亡,減緩肝纖維化的進展,對于保護肝臟功能和預防肝癌的發生均有積極意義。現有研究表明,鐵死亡與肝癌在細胞層次的病理改變上存在共同點,鐵死亡極有可能成為治療肝癌的下一個有效靶點[7]。中醫藥以整體觀念和辨證論治為特色,其多靶點、多層次、多途徑的作用方式在治療肝癌上有獨特的優勢,中國古代即有對肝癌相關癥狀的描述,并留下許多治療肝癌的經驗用方,效果顯著,且中藥聯合西藥治療,不僅可以降低患者接受化療時的不良反應,還能提高療效和患者的生存率[8-9]。研究發現,中藥對干預鐵死亡具有確切的價值和療效,相關中藥中的活性成分,對于鐵死亡有正負相關性調節作用。

1 鐵死亡發生的機制

與細胞凋亡、細胞壞死和細胞自噬不同,鐵死亡在形態上主要表現為線粒體皺縮、線粒體膜密度增加等改變,其質膜與細胞核無明顯變化[10]。鐵死亡的過程也緊密圍繞鐵代謝紊亂和氧化應激激活兩個方面,下文將從以上兩個方面介紹鐵死亡發生的機制。

1.1 鐵代謝與其中醫內涵 鐵元素是組成人體微量元素中最為重要的其中一種,參與了體內各種蛋白質和酶的合成,負責氧氣的運輸、ATP的生成和DNA的合成等,正常情況下,血漿中幾乎所有的鐵都與轉鐵蛋白結合,從而避免體內鐵含量過多引起組織氧化損傷,當鐵代謝失衡,多余的鐵在體內積累,就會導致鐵死亡的發生。

鐵離子(Fe3+)在鐵死亡過程中發揮至關重要的作用,Fe3+在進入細胞后被還原為亞鐵離子(Fe2+),會被優先形成參與生化反應的各種鐵結合復合物,多余的Fe3+則在細胞中堆積,形成不穩定的Fe3+池(LIP)并增強芬頓反應(Fenton reaction),生成以羥基自由基為代表的活性氧(ROS)復合物,過量的ROS導致細胞脂膜氧化,使細胞喪失功能并死亡[11],而補充Fe3+可以加速erastin誘導的鐵死亡[4]。有研究表明,鐵螯合劑(DFO)能緩解由雙氫青蒿素(DHA)誘導急性髓細胞白血病(AML)細胞發生鐵蛋白重鏈(FTH)自噬降解造成的鐵死亡[12]。研究還發現,熱休克蛋白B(HSPB)通過抑制膜蛋白轉鐵蛋白受體(TFR),阻止Fe2+進入細胞內,從而降低細胞內Fe2+的濃度,抑制細胞鐵死亡,這些結果從正反兩方面驗證了鐵代謝在鐵死亡中的作用[13]。

鐵參與了細胞中的各項生理生化反應,由肝臟合成并分泌的鐵調素在維持鐵穩態中起到了重要作用[14],當因為各種因素導致體內鐵的含量不能維持在一個正常的水平,肝內鐵含量增加,可促進肝硬化患者向肝癌發展[15],此外過量的游離鐵還可能導致免疫系統異常,使得癌化的細胞脫離免疫系統的監視。另外,肝癌細胞中的FTH和鐵蛋白輕鏈(FLH)顯著高于正常肝組織,而去鐵藥物甲磺酸去鐵胺(DFO)可顯著抑制肝腫瘤的增殖能力。

中醫講究萬物平衡,五行之間相生相克,這與人體內鐵元素水平的穩態息息相關。盡管中醫理論中沒有關于鐵穩態的敘述,但中醫的“肝藏血”理論,認為肝臟和血液的關系密不可分,而血液之所以呈現紅色正是因為血細胞中含有的含鐵血紅蛋白;同時,中醫還認為“肝主疏泄”,通過調節全身氣機通暢,維持五臟六腑的正常生理功能不被鐵死亡影響;現代醫學發現肝臟分泌的鐵調素在維持鐵穩態中發揮了重要的作用,從另一個角度闡釋了肝臟在調節鐵代謝平衡中的作用。肝臟與鐵這種復雜關系,表明鐵的含量對肝臟的生理功能有影響,同時也說明鐵死亡在肝臟疾病中扮演了重要的角色。

1.2 氧化應激與其中醫內涵 細胞的正常生理活動是一個氧化與抗氧化相平衡的過程。氧化反應是給細胞提供能量的基本途徑,所有的細胞活動都依賴于正常的氧化反應。氧化應激是異常的氧化反應,ROS增加導致氧化與抗氧化失衡,細胞脂質過氧化,破壞生物膜,是鐵死亡的特征之一。其中線粒體作為合成ATP的場所,其中的氧化還原反應最為頻繁,是ROS生成的主要部位,因此鐵死亡的細胞中線粒體改變最為明顯[16]。一方面細胞依賴于糖、蛋白質和脂肪的氧化反應提供能量進行生命活動;另一方面,當細胞的抗氧化能力失常,細胞中的氧化物堆積,對細胞產生氧化損傷,從而導致鐵死亡,因此鐵死亡的發生與氧化應激密不可分[17]。

研究表明,谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)作為清除脂質過氧化物的一種酶,若抑制GPX4的活性,會使脂質過氧化物堆積,膜脂質雙分子層的穩定性遭到破壞,進而導致鐵死亡的發生[18]。而谷胱甘肽(GSH)是決定GPX4活性的重要物質,缺乏GSH會導致GPX4活性降低甚至直接失活,使細胞抗氧化能力下降,逐漸發生氧化損傷[19]。胱氨酸/谷氨酸反向轉運體(System Xc-)負責等比例運輸細胞內外的胱氨酸和谷氨酸,用于合成GSH,當System Xc-被抑制后,GSH的含量降低,進而影響GPX4的活性。為保證物質的交換,細胞脂質膜由多不飽和脂肪酸(PUFAs)構成[20],PUFAs中疏松的C=C雙鍵間存在極易被氧化的C-H鍵,C-H鍵中的-H被奪取將生成脂質氫過氧化物(L-OOH),因此細胞生物膜對脂質氧化高度敏感[21]。GPX4作為抗氧化物質,它的低活性會將細胞的生物膜暴露在被氧化的風險中。此外,脂氧合酶(LOX)、細胞色素P450氧化還原酶(POR)和環氧合酶(COX)等通過酶促反應也可導致細胞脂質膜過氧化,LOX和POR不能單獨作用于酶促反應,常需與Fe2+共同作用[22]。當游離的PUFA被酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)催化生成PUFA-CoA,并最終在LOX和Fe2+的共同作用下生成脂質過氧化物誘導鐵死亡[23]。

抗氧化與過氧化物就如同中醫理論中的正邪因素,正不壓邪則發病,正如過氧化物增多導致的鐵死亡。同時正邪也有其相對性,肝癌細胞對人體而言就是一種內生的“邪”,氧化應激導致的鐵死亡對肝癌細胞也是“邪”,但肝癌細胞的死亡對機體而言又是一種“正”。中醫益氣扶正的治療方法,在鐵死亡的機制上就是誘導肝癌細胞鐵死亡,即扶正祛邪。正氣足則精神煥發,身強體健,中藥有可能是通過增強機體抗氧化的能力,同時降低肝癌細胞的抗氧化能力,從而在鐵死亡機制上對肝癌起到干預效果。

2 中藥基于鐵死亡機制防治肝癌研究現狀

中藥以其多活性成分、多途徑、多靶點等特點在治療肝癌、改善患者生活質量上發揮了重大的作用。探究中藥在鐵死亡機制上與治療肝癌的關系,有利于更好地發揮中藥的效果。

2.1 中醫對肝癌的認識以及蘊含的鐵死亡機制 古籍中并未出現對“肝癌”的記載,但其癥狀見于“積聚”“黃疸”“鼓脹”“肝積”等疾病,如《靈樞·脹論》記載：“鼓脹何如?腹脹身皆大,大與腹脹等也”,“色蒼黃、腹筋起……,脅下滿而痛引下腹”,病機以虛、毒、瘀為主[24],病性為本虛標實。病理上,過量的鐵可使正常的肝細胞發生鐵死亡,肝受損導致肝疏泄功能失調,疏泄失調則氣血津液運行不暢,進而出現血瘀、水停、氣滯等實證表現。血瘀日久成聚,水停方長為積。積久化熱,煉液成痰,痰瘀互結,復阻疏泄,如此往來,病情重矣。生理上,中醫認為“肝藏血”,鐵蛋白在肝細胞中的含量很高,同時鐵蛋白是機體合成血細胞的重要基礎,這與“肝藏血”理論不謀而合,同時肝臟分泌的鐵調素是調節體內鐵穩態的必要條件,是肝主疏泄的另一種體現。研究表明,酒精可以使肝細胞內脂質過度沉積,從而激發氧化應激和肝纖維化過程,誘導肝細胞鐵死亡[25]。各類因素導致的肝細胞損傷進而纖維化最終發展為肝癌與中醫的本虛標實理論存在共性,因此積極探討中藥干預肝細胞鐵死亡的途徑十分重要。

2.2 中藥及復方在鐵死亡方面對肝癌的防治

2.2.1 單味中藥基于鐵死亡防治肝癌的研究：李艷純等[26]通過提取黃花蒿所含有的青蒿素,分離出其衍生物二氫青蒿素(DHA),監測DHA處理24 h后的SMMC-7721、Huh-7肝癌細胞株,發現細胞內ROS和脂質過氧化物水平均增加,胞內GSH的含量降低;若再使用DFO、鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1)、ROS清除劑(NAC)處理這兩組肝癌細胞,則會使其細胞活性增強。說明DHA可以誘導肝癌細胞發生鐵死亡抑制腫瘤細胞的生長。張楠[27]通過網絡藥理學分子對接篩選出梔子調節肝癌的關鍵靶點血紅素加氧酶1(HMOX1),并發現梔子的關鍵活性成分梔子苷可以作用于HMOX1,通過ERK/Nfr2信號通路,啟動氧化應激反應,進而抑制肝癌細胞的增殖活性。LAN等[28]在研究中藥柴胡治療肝癌的作用中發現,其含有的活性成分柴胡皂苷A(SsA),通過激活轉錄因子3(ATF3)增加肝癌細胞內丙二醛(MDA)和Fe2+的積累,而降低GSH 的水平。葫蘆素B(Cu B)具有多種藥理活性,在腫瘤研究中頗為廣泛,研究表明,Cu B可通過抑制核因子紅系2相關因子2 (Nrf2)/血紅素加氧酶-1(HO-1)抗氧化系統通路降低肝癌細胞的抗氧化能力,同時引起GPX4在環己酰亞胺(CHX)存在下出現泛素化降解[29]。袁靖濤[30]以中藥植物澤蘭抗腫瘤有效成分EChLESs為研究對象,發現EChLES能延緩核受體共激活因子4(NCOA4)的降解,使得大量的Fe2+從靶向鐵蛋白中分解出來,與細胞內的過氧化物促成Fenton反應,進一步使得GPX4失活。劉金麗等[31]通過觀察隱丹參酮對體外培養人肝癌HepG2細胞的作用,發現其可顯著誘導HepG2細胞降低GSH水平,積累ROS,并下調xCT和GPX4表達,導致HepG2細胞鐵死亡。甘草的活性成分異甘草酸鎂在治療肝纖維化上效果顯著,一項對肝纖維化大鼠的研究中顯示,異甘草酸鎂可以通過HO-1介導顯著降低CollagenⅠ的表達,使異常的肝細胞內Fe2+水平增加,提示異甘草酸鎂在引導異常的肝細胞鐵死亡,抵抗肝纖維化的進程[32]。

2.2.2 中藥復方基于鐵死亡防治肝癌的研究：ZAO等[33]研究了中藥復方抗纖抑癌方對肝癌模型大鼠的作用,動物實驗結果表明UDP-葡萄糖 6-脫氫酶(UGDH)、醛酮還原酶1B10(AKR1B10)和SLC7A11在模型大鼠的肝癌細胞中表達更加明顯,而通過使用抗纖抑癌方可以顯著的抑制這些蛋白在大鼠肝癌細胞中的表達,使大鼠肝癌細胞對鐵死亡的敏感性增加,從而對治療肝癌起到積極作用。王智檳等[34]發現實脾消積方可通過上調腫瘤蛋白53(p53)的表達,下調xCT和GPX4的表達,促進糖代謝異常從而使肝癌細胞鐵死亡。α-常春藤皂苷(α-Hederin)是從中藥復方腸胃清中分析所得的一種五環三萜類皂苷[35],相關研究發現其在抗腫瘤領域前景廣闊。韓松峰等[36]通過測定發現隨著α-Hederin使用濃度的增加,肝癌Bel-7402細胞內二價金屬轉運蛋白1(DMT1)的表達也隨之上升,細胞膜對Fe2+的通透性增加,大量的Fe2+被轉運運到細胞內,同時ROS水平升高,誘導肝癌細胞鐵死亡。周佳林等[37]通過網絡藥理學發掘半夏-天南星和肝癌的共同靶點,最終篩選出5個與鐵死亡相關的靶點,分別為AKT1、RELA、VEGFA、TP53和HIF-1α,且相關研究證明此類靶點與肝癌的發病和治療相關,說明半夏-天南星可以經相關靶點調控鐵死亡,發揮防治肝癌的作用。楊晶[38]通過體外肝癌細胞實驗研究固本消積方對人肝癌HepG2細胞鐵死亡的作用機制,發現肝癌細胞中TRPV1呈低表達狀態,而固本消積方在激活TRPV1后可以抑制GPX4的表達,誘導肝癌細胞鐵死亡。

3 小 結

肝癌是各種慢性肝病的終末階段,如何針對性地誘導肝癌細胞死亡同時保護正常肝細胞的活性,是臨床治療肝癌的一個方向。

鐵死亡作為一種新型的細胞死亡機制,其對肝癌的影響是雙向的。一方面,鐵死亡中Fe2+代謝的紊亂和氧化應激可以促進肝癌細胞死亡,對肝癌起到治療效果;另一方面,鐵死亡也可能加速正常肝細胞的死亡,導致肝癌患者的病情惡化。中藥在調節誘導肝癌細胞鐵死亡的同時會不會對正常肝細胞造成影響,尚未有學者進一步研究,此后應當重點關注。

現有研究表明,鐵死亡的過程與xCT、GPx4、GSH的表達和Fe2+水平密切相關。中藥及復方的活性成分以其多途徑、多靶點的特點,對于治療肝癌存在獨特的優勢,不僅可以直接誘導肝癌細胞鐵死亡,還能抑制肝癌細胞對化療的耐藥性,增加其他藥物的療效,中藥在通過鐵死亡機制防治肝癌的研究領域仍處于探索階段,其前途一片光明。且現有研究大多局限于動物實驗或離體實驗,缺乏臨床實驗驗證,相關防治肝癌的靶點及通路的具體機制尚不明確,今后的研究應進一步探索中藥調節鐵死亡的具體機制,為中醫防治肝癌提供新思路。