基于“肝病實(shí)脾”理論探討逍遙散對(duì)肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞鐵死亡的影響

胡哲君,湯穆浛,張 銳,金 泓,嚴(yán) 倫,何鴻志,曾鳳蘭,周志鵬

(廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院,廣東 廣州 510220)

肝纖維化是各種慢性肝病進(jìn)展中的共同病理結(jié)果,肝炎病毒感染、酒精、藥物損傷等是其主要病因,隨著病情的進(jìn)展,患者最終會(huì)因肝硬化或肝細(xì)胞癌而導(dǎo)致肝衰竭,甚至危及生命[1-3]。免疫系統(tǒng)異常激活與脂質(zhì)毒性等是觸發(fā)肝臟炎癥及其纖維化變性的主要病理機(jī)制[4],其中肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)受免疫炎癥刺激活化,進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞是肝纖維化的關(guān)鍵步驟[5],鐵死亡作為一種細(xì)胞死亡形式在該過(guò)程中扮演著重要角色,通過(guò)誘導(dǎo)HSC鐵死亡可有效減少肝組織細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度增生和沉積,最終延緩肝纖維化進(jìn)展[6-7]。《金匱要略》里張仲景提出“見(jiàn)肝之病,知肝傳脾,當(dāng)先實(shí)脾”的治療肝病思路,對(duì)于肝纖維化引發(fā)的肝硬化的臨床治療具有重要指導(dǎo)意義,基于“肝病實(shí)脾”理論來(lái)調(diào)控免疫功能、腸道菌群可有效防治肝硬化[8],運(yùn)用“實(shí)脾”之法以“治肝”,可通過(guò)改善腸道菌群與脾胃升降失調(diào)來(lái)減輕非酒精性脂肪性肝病相關(guān)癥狀[9]。逍遙散是始載于《太平惠民和劑局方》中的方劑,具有調(diào)和肝脾、補(bǔ)肝疏郁、肝脾同治的功效,可通過(guò)“肝病實(shí)脾法”恢復(fù)腸道菌群正常結(jié)構(gòu),進(jìn)而對(duì)肝纖維化大鼠起到抗纖維化與肝臟保護(hù)作用[10],能對(duì)肝郁脾虛型肝纖維化發(fā)揮治療作用[11],但HSC鐵死亡在逍遙散對(duì)肝纖維化治療中的作用目前還不清楚,本文通過(guò)構(gòu)建肝纖維化大鼠模型,基于“肝病實(shí)脾”理論探討逍遙散對(duì)其HSC鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD健康大鼠自成都藥康生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi),生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2020-0034,雄性,SPF級(jí),體重215～240 g,鼠齡7周左右,分籠飼養(yǎng)在明暗12 h/12 h交替進(jìn)行照明屏障環(huán)境動(dòng)物房中,每籠飼養(yǎng)大鼠少于5只,大鼠自由進(jìn)食飲水且飼養(yǎng)房?jī)?nèi)溫度為23～25 ℃、濕度為55%～65%。

1.1.2 試劑與儀器：四氯化碳(批號(hào)TMST-715875,純度99.4%),自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)銷(xiāo)售平臺(tái)購(gòu)買(mǎi);逍遙散方劑組分：柴胡(批號(hào)404319T)、當(dāng)歸(批號(hào)406242T)、白芍(批號(hào)312267T)、白術(shù)(批號(hào)405219T)、茯苓(批號(hào)405218T)、生姜(批號(hào)404245T)、薄荷(批號(hào)404395T)、炙甘草(批號(hào)404243T),各中藥組分均為顆粒劑,均自廣東一方制藥有限公司購(gòu)買(mǎi);水飛薊賓葡甲胺片(規(guī)格50 mg/片,國(guó)藥準(zhǔn)字H14023291),自山西仟源醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司購(gòu)買(mǎi);percoll細(xì)胞分離液,自上海山進(jìn)生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi);抗兔和小鼠HRP-DAB免疫組化檢測(cè)試劑盒,自杭州斯達(dá)特生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi);糞便基因組DNA快速提取試劑盒,自上海澤葉生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi);Nextera XT DNA文庫(kù)制備試劑盒、Illumina Miseq測(cè)序試劑盒,自美國(guó)Illumina公司購(gòu)買(mǎi);Masson染色試劑盒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量檢測(cè)試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、鐵含量檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒,自北京索萊寶科技有限公司購(gòu)買(mǎi);兔源抗大鼠抗-長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶4(ACSL4)一抗、兔源抗大鼠抗-α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)一抗、兔源抗大鼠抗-谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(GPX4)一抗、兔源抗大鼠抗-β-actin一抗、兔源抗大鼠抗-環(huán)加氧酶2(PTGS2)一抗、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)小鼠抗兔二抗,自美國(guó)CST公司購(gòu)買(mǎi)等。

全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)DT-480),自盛世東唐江蘇生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi);冷凍切片機(jī)(型號(hào)ALQ-2000),自湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司購(gòu)買(mǎi);雙目生物顯微鏡(型號(hào)XSP-2CA),自華熙昕瑞(青島)分析儀器有限公司購(gòu)買(mǎi);全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(型號(hào)HED-SY96A),自山東霍爾德電子科技有限公司購(gòu)買(mǎi);垂直電泳系統(tǒng)(型號(hào)XCell SureLock Mini-Cell)、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號(hào)XCell Ⅱ Blot Module)、電泳儀電源(型號(hào)Power Ease Touch),自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司購(gòu)買(mǎi)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝纖維化大鼠模型制備及分組給藥：參考文獻(xiàn)[12]制備肝纖維化大鼠模型：將四氯化碳與玉米油混合制為40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的溶液,于SD大鼠腹腔內(nèi)注射,劑量為1 ml/kg,2次/周(相隔3 d),持續(xù)8周后隨機(jī)選3只大鼠,進(jìn)行肝臟病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其肝組織內(nèi)形成明顯纖維間隔,且以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)外周血中肝功能指標(biāo)：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT),發(fā)現(xiàn)其水平相比正常大鼠明顯升高,即表明肝纖維化大鼠模型制備成功,隨機(jī)分為模型組、逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組,每組12只,另取12只SD大鼠于其腹腔內(nèi)注射1 ml/kg的玉米油設(shè)為對(duì)照組。

逍遙散由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓各15 g,生姜、薄荷各6 g,炙甘草9 g組成,根據(jù)顆粒劑與生藥劑量換算關(guān)系,取相對(duì)應(yīng)質(zhì)量的各種單味中藥顆粒劑溶于0.9%氯化鈉溶液配制為0.155 g/ml的藥液備用;將水飛薊賓葡甲胺片研碎溶于0.9%氯化鈉溶液中配成5 mg/ml的藥液備用。各組大鼠于造模成功后進(jìn)行分組處理：逍遙散組大鼠灌胃10 ml/kg逍遙散藥液(逍遙散劑量達(dá)到1.55 g/kg)[10],水飛薊賓葡甲胺組大鼠灌胃10 ml/kg水飛薊賓葡甲胺藥液(水飛薊賓葡甲胺劑量達(dá)到50 mg/kg)[12],對(duì)照組、模型組灌胃10 ml/kg 0.9%氯化鈉溶液,各組大鼠均處理3周(1次/d)。

1.2.2 檢測(cè)各組大鼠肝功能指標(biāo)、肝指數(shù)并采集標(biāo)本：末次給藥結(jié)束后24 h使用乙醚麻醉各組大鼠,采集其腹主動(dòng)脈血1 ml左右進(jìn)行離心(4 ℃、3000 r/min、20 min),獲取血清并使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)其中肝功能指標(biāo)AST、ALT水平;再次采集各組大鼠腹主動(dòng)脈血1 ml左右進(jìn)行離心(4 ℃、3000 r/min、20 min),獲取其中血清儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

自每組大鼠中隨機(jī)選出6只大鼠稱(chēng)量其體重,采集其糞便標(biāo)本保存在液氮中備用;打開(kāi)腹腔并取出肝臟,稱(chēng)量其重量后依據(jù)公式算出各組大鼠肝指數(shù),公式：肝指數(shù)=肝臟重量/體重×100%;然后以0.9%氯化鈉溶液漂洗稱(chēng)重后的肝臟,做包埋處理后于液氮內(nèi)快速冷凍,取出肝冷凍組織塊放入冷凍切片機(jī)內(nèi)切成約4 μm厚的薄片備用。

每組剩余的6只大鼠,整體消毒后在無(wú)菌操作臺(tái)中打開(kāi)腹腔,結(jié)扎其上腔靜脈,以乙二醇四乙酸、膠原酶和鏈霉蛋白酶溶液從門(mén)靜脈灌注肝臟,剪下消化后的肝臟于無(wú)菌DMEM/F12培養(yǎng)基中剝碎、漂洗,然后置于膠原酶和鏈霉蛋白酶組成的混合酶溶液中繼續(xù)消化,過(guò)200目篩后獲得細(xì)胞懸液,置于15 ml離心管中離心(37 ℃、1000 r/min、15 min),以30%的percoll細(xì)胞分離液8 ml和70%的percoll細(xì)胞分離液3 ml重懸細(xì)胞,接著離心(37 ℃、2500 r/min、20 min),通過(guò)細(xì)胞密度區(qū)分細(xì)胞類(lèi)型,HSC在上層細(xì)胞層中富集,將其小心吸出后離心(37 ℃、1000 r/min、10 min),采用含有20%胎牛血清及1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)。

1.2.3 以Masson染色檢測(cè)各組大鼠肝纖維化：取出上述所得的肝組織冰凍切片在室溫下靜置5 min,然后浸沒(méi)在冰丙酮中固定15 min,取出用蒸餾水漂洗后滴加Masson染液進(jìn)行染色(具體方法如Masson染色試劑盒說(shuō)明書(shū)中所示),用蒸餾水漂洗后采用中性樹(shù)脂封片觀(guān)察,采用生物顯微鏡采集各組大鼠肝組織圖像,以Image J軟件分析所得圖片,并定量計(jì)算各組大鼠肝組織切片中被染成藍(lán)色的膠原纖維面積和視野總面積,根據(jù)公式算出各組大鼠肝膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF),公式：CVF(%)=切片膠原纖維面積/切片視野總面積×100%。

1.2.4 以免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠肝星狀細(xì)胞活化：取出上述所得的肝組織冰凍切片以同樣方法固定、漂洗,以3%過(guò)氧化氫去除切片內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,進(jìn)行抗原修復(fù)后采用5%山羊血清封閉切片,滴加兔源抗大鼠抗-α-SMA一抗溶液覆沒(méi)切片,搖動(dòng)孵育過(guò)夜后洗片,滴加相對(duì)應(yīng)二抗溶液覆沒(méi)切片,搖動(dòng)孵育2 h后洗片,采用抗兔和小鼠HRP-DAB免疫組化檢測(cè)試劑盒并按其說(shuō)明書(shū)中方法進(jìn)行染色,封片后觀(guān)察,以生物顯微鏡采集各組大鼠肝組織圖像并以Image J軟件進(jìn)行分析,定量各組大鼠肝組織切片中被染成棕色的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),根據(jù)公式算出各組大鼠肝組織α-SMA陽(yáng)性比,公式：α-SMA陽(yáng)性比(%)=α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 通過(guò)16SrRNA基因測(cè)序檢測(cè)各組大鼠腸道菌群改變：取上述采集的各組大鼠糞便標(biāo)本,采用糞便基因組DNA快速提取試劑盒并按其說(shuō)明書(shū)中方法分別提取其中基因組DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化,獲得1 ng/μl的DNA采用PCR反應(yīng)試劑盒并按其說(shuō)明書(shū)中方法對(duì)16S V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為：Forward-5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’;Reverse-5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’,再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)純化所得PCR產(chǎn)物,將5倍量的每組PCR產(chǎn)物混為一個(gè)合并文庫(kù),以Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序后采用Mothur軟件拼接處理,獲取非冗余的有效數(shù)據(jù),以Uparse軟件聚類(lèi)序列為多個(gè)操作分類(lèi)單元,默認(rèn)97%的一致性,基于R語(yǔ)言對(duì)微生物群落組成多樣性進(jìn)行分析,獲取Alpha多樣性指數(shù)ACE,并采用Mothur方法和SILVA132的SSUr RNA數(shù)據(jù)庫(kù)做物種注釋分析來(lái)獲取重要腸道菌群(擬桿菌目、梭菌目)豐度。

1.2.6 以試劑盒測(cè)定各組大鼠HSC鐵死亡指標(biāo)：取上述進(jìn)行原代培養(yǎng)的各組大鼠HSC,分別置于預(yù)冷RAPI裂解液內(nèi)混勻,在冰水浴中進(jìn)行裂解,2 h后離心(4 ℃、3000 r/min、20 min),獲得各組大鼠HSC樣品液,以BCA法測(cè)出其中蛋白總濃度后每組取出0.34 ml采用GSH含量檢測(cè)試劑盒、鐵含量檢測(cè)試劑盒、MDA含量檢測(cè)試劑盒分別測(cè)量其中GSH、MDA水平與鐵含量,具體測(cè)量方法見(jiàn)各自試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.7 以免疫印跡檢測(cè)各組大鼠HSC鐵死亡標(biāo)志蛋白表達(dá)：取上述提取的各組大鼠HSC樣品液,放入沸水浴內(nèi)加熱變性其中蛋白,根據(jù)蛋白濃度測(cè)定結(jié)果每組取出20 μg蛋白樣品,依次進(jìn)行電泳、濕式轉(zhuǎn)印,在PVDF膜上獲取各組按分子量大小分離開(kāi)的蛋白,在5%脫脂牛奶中封閉蛋白非特異抗原,并分別孵育兔源抗大鼠Anti-ACSL4、GPX4、PTGS2、β-actin一抗和HRP偶聯(lián)小鼠抗兔二抗,使各組ACSL4、GPX4、PTGS2、β-actin蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)后用化學(xué)發(fā)光試劑使其顯色,攝取其圖像后采用Image J軟件定量各組蛋白灰度值,計(jì)算各組ACSL4、GPX4、PTGS2蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值,即可獲得其相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示,多組間數(shù)據(jù)的差異比較進(jìn)行單因素方差分析,組間兩兩差異進(jìn)一步比較進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清AST、ALT水平比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清AST、ALT水平均明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠血清AST、ALT水平均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠血清AST、ALT水平和肝指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清AST、ALT水平比較(U/L)

2.2 逍遙散對(duì)大鼠肝指數(shù)與肝纖維化的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠肝指數(shù)與肝CVF明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝指數(shù)與肝CVF均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝指數(shù)與肝CVF均無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表2(圖1)。

A：對(duì)照組;B：模型組;C：逍遙散組;D：水飛薊賓葡甲胺組

表2 各組大鼠肝指數(shù)與肝CVF比較(%)

2.3 各組大鼠肝星狀細(xì)胞活化比較 見(jiàn)圖2。對(duì)照組、模型組、逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝組織α-SMA陽(yáng)性比分別為(5.31±1.63)%、(54.93±3.75)%、(8.52±2.43)%、(7.16±2.10)%。與對(duì)照組相比,模型組大鼠肝組織α-SMA陽(yáng)性比明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝組織α-SMA陽(yáng)性比均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝組織α-SMA陽(yáng)性比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對(duì)照組;B：模型組;C：逍遙散組;D：水飛薊賓葡甲胺組

2.4 各組大鼠ACE指數(shù)、梭菌目豐度、擬桿菌目豐度比較 見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比,模型組大鼠ACE指數(shù)、梭菌目豐度均明顯升高(P<0.05),擬桿菌目豐度明顯降低(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠ACE指數(shù)、梭菌目豐度均降低(P<0.05),擬桿菌目豐度均升高(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠ACE指數(shù)、梭菌目豐度、擬桿菌目豐度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠ACE指數(shù)、梭菌目豐度、擬桿菌目豐度比較

2.5 各組大鼠HSC鐵死亡指標(biāo)鐵含量、GSH及MDA水平比較 見(jiàn)表4。與對(duì)照組相比,模型組大鼠HSC鐵死亡指標(biāo)鐵含量、MDA水平均明顯降低(P<0.05),GSH水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠HSC鐵死亡指標(biāo)鐵含量、MDA水平均升高(P<0.05),GSH水平均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠HSC鐵死亡指標(biāo)鐵含量、GSH及MDA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠HSC鐵死亡指標(biāo)鐵含量、GSH及MDA水平比較

2.6 各組大鼠HSC鐵死亡標(biāo)志蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表5(圖3)。與對(duì)照組相比,模型組大鼠HSC鐵死亡標(biāo)志蛋白ACSL4、PTGS2表達(dá)明顯降低(P<0.05),GPX4蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠HSC鐵死亡標(biāo)志蛋白ACSL4、PTGS2表達(dá)均升高(P<0.05),GPX4蛋白表達(dá)均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠HSC鐵死亡標(biāo)志蛋白ACSL4、PTGS2、GPX4表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 免疫印跡檢測(cè)各組大鼠HSC鐵死亡標(biāo)志蛋白表達(dá)

表5 各組大鼠HSC鐵死亡標(biāo)志蛋白相對(duì)表達(dá)比較

3 討 論

因代謝紊亂、病毒感染或藥物刺激等引發(fā)的慢性肝病是世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,肝纖維化作為慢性肝病的共同病理結(jié)果,一直是臨床研究熱點(diǎn),現(xiàn)有治療手段均以延緩纖維化進(jìn)展為主,對(duì)于肝纖維化的進(jìn)展難以逆轉(zhuǎn),因此還需探索更有效的抗肝纖維化方法[13-15]。本文采用腹腔注射四氯化碳的方法建立肝纖維化大鼠模型,結(jié)果顯示,造模大鼠肝組織內(nèi)形成明顯纖維間隔,血清AST與ALT水平、肝指數(shù)、肝CVF相比對(duì)照組大鼠明顯升高,表明四氯化碳可引發(fā)大鼠肝組織纖維化變性并損害其肝功能,提示肝纖維化大鼠模型構(gòu)建成功。

中醫(yī)臟腑學(xué)說(shuō)認(rèn)為肝脾在病理生理上聯(lián)系密切,“見(jiàn)肝之病,知肝傳脾,當(dāng)先實(shí)脾”就是張仲景基于“肝病實(shí)脾”理論提出的肝病治療原則,是中醫(yī)“治未病”思想的具體體現(xiàn),現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)腸-肝軸參與脂肪肝的發(fā)病機(jī)制,腸道菌群失衡作為脾虛的微觀(guān)表現(xiàn),是基于“肝病實(shí)脾”理論進(jìn)行肝脾同病治療的病理基礎(chǔ),促進(jìn)腸道菌群穩(wěn)態(tài)恢復(fù)可有效延緩脂肪肝的發(fā)展[16],并可減輕肝臟炎癥與保護(hù)非酒精性脂肪性肝病大鼠腸黏膜屏障功能[17];遵從“肝病實(shí)脾”理論還可在肝硬化的治療中發(fā)揮重要作用[18]。逍遙散由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)等組成,柴胡作為君藥,可疏肝解郁、條達(dá)肝氣。當(dāng)歸、白芍同為臣藥,能柔肝養(yǎng)血。白術(shù)、甘草、茯苓共起健脾益氣、生化營(yíng)血之效,薄荷疏郁散熱,生姜溫胃和中,共為佐藥。眾藥合用既補(bǔ)肝解郁又兼顧氣血,肝脾同治,作為調(diào)和肝脾之名方可通過(guò)恢復(fù)腸道菌群正常結(jié)構(gòu)來(lái)減少內(nèi)毒素,進(jìn)而改善大鼠肝纖維化[10,19],還能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和凋亡信號(hào)激活而顯著減輕四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷[20]。本文結(jié)果顯示,以逍遙散處理肝纖維化大鼠,可升高其擬桿菌目豐度,降低其血清AST與ALT水平、肝指數(shù)、肝CVF、肝組織α-SMA陽(yáng)性比、ACE指數(shù)、梭菌目豐度,表明逍遙散可降低腸道菌群豐富度,恢復(fù)腸道菌群正常結(jié)構(gòu),抑制四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠HSC活化及肝纖維化,改善其肝功能,進(jìn)一步證實(shí)了逍遙散可基于“肝病實(shí)脾”理論治療肝纖維化。

HSC的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),抑制其活性并促進(jìn)活性HSC死亡是防治肝纖維化的有效策略[21-22],鐵死亡作為一種新型的程序性細(xì)胞死亡方式,在包括肝纖維化在內(nèi)的多種生理病理過(guò)程中起到重要調(diào)節(jié)作用,通過(guò)誘導(dǎo)HSC鐵死亡可有效抑制HSC活化,進(jìn)而減輕肝纖維化[23-25]。本文結(jié)果顯示,肝纖維化大鼠HSC鐵含量、MDA水平、ACSL4與PTGS2蛋白表達(dá)相比對(duì)照組大鼠明顯降低,GSH水平與GPX4蛋白表達(dá)明顯升高,表明四氯化碳可導(dǎo)致大鼠HSC鐵死亡水平降低;以逍遙散處理肝纖維化大鼠可升高其HSC鐵含量、MDA水平、ACSL4與PTGS2蛋白表達(dá),并降低其GSH水平與GPX4蛋白表達(dá),表明逍遙散可增強(qiáng)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠HSC鐵死亡,揭示促進(jìn)HSC鐵死亡可能是逍遙散治療肝纖維化的藥理機(jī)制之一。

綜上所述,逍遙散可降低腸道菌群豐富度并恢復(fù)其正常結(jié)構(gòu),促進(jìn)HSC鐵死亡,進(jìn)而減輕四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠HSC活化及肝纖維化,改善大鼠肝功能,增強(qiáng)HSC鐵死亡可能是其藥理機(jī)制之一。