加味生肌玉紅膏對肛瘺模型大鼠術后創面的作用及血清炎癥因子水平的影響

梅蘋蘋,郭修田,馮文哲,林 璐

(1.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院,上海 200071;2.陜西中醫藥大學附屬醫院肛腸科,陜西 咸陽 712000)

肛瘺病名最早記載于《山海經·中山經》：“食者不癰,可以為瘺”,指出了肛瘺多是由肛門周圍膿腫破潰后引起的后遺疾患[1],肛瘺的發病率約占正常人群的1.04%～3.6%,且復發率較高[2]。目前臨床治療肛瘺主要以手術為主,但是由于手術方式為開放式,創口易被糞便污染,通常不進行縫合,易感染,出現滲液、水腫、炎癥反應及疼痛等影響創面愈合,給患者生活造成巨大不便。因此,減輕肛瘺術后創面的炎性反應,促進創面愈合已經成為臨床關注的重點。中醫學認為濕熱下注是肛瘺的根本病機,而濕熱邪氣的致病特點與炎癥密切相關[3]。本研究針對肛瘺術后創面早期濕熱內蘊明顯的病機特點,在煨膿長肉治法的指導下,我們在生肌玉紅膏原方的基礎上,增加并調整了祛濕清熱功效的藥物及劑量,使祛濕清熱作用更加突出,觀察加味生肌玉紅膏對肛瘺模型大鼠創面愈合率及血清中白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)及血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表達的變化,現總結如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：60只SPF級雄性SD大鼠,周齡為8～10周,體重175～215 g,均由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供[生產許可證號：SCXK(陜)2018-001]。實驗經陜西中醫藥大學倫理委員會批準,倫理委員會審批號：SUCMDL20210608001。實驗前開始適應性喂養2周,大鼠飼養于陜西中醫藥大學動物實驗中心。飼養條件：室溫保持在20～25 ℃,環境濕度40%～60%,普通飼料喂養,自由飲水飲食。

1.1.2 藥物制作：加味生肌玉紅膏藥物(蒼術、黃柏、當歸、白蠟各60 g,白芷15 g,輕粉、血竭各12 g,紫草6 g,甘草36 g)的制備方法：先將蒼術、黃柏、當歸、白芷、紫草、甘草六味入油內浸3 d,然后文火熬枯去渣;再入血竭化盡,次入白蠟微火化開,待油溫后,再入研細輕粉攪勻,冷卻后即凝成膏,4 ℃冰箱保存。由陜西中醫藥大學附屬醫院制劑中心生產,符合 GMP標準。

1.1.3 主要試劑：二甲苯(國藥集團,批號：10023418);蘇木素-伊紅染液(南昌雨露實驗器材有限公司,批號：171007);醫用凡士林紗布(山東安捷高科消毒科技有限公司,批號：2021110219);康復新液(四川好醫生攀西藥業有限公司,批號：B220223);ELISA檢測試劑盒(Beyotime,批號：E-TSELH0029);中性樹膠(金華力升實驗器材廠,批號：20171118);4%多聚甲醛組織固定液(Biosharp,批號：70071800);NF-κB信號通路抑制劑(PDTC)(西安灝洋生物技術有限公司,批號：P9701-25g);糞便混懸液：取新鮮大鼠糞便20 g,與0.9%氯化鈉溶液1∶1均勻混合,5000 r/min,離心5 min,取上清液備用。

1.1.4 主要儀器：實驗用電泳儀電源(北京六一儀器廠,型號：DYY-7C);垂直電泳槽(北京六一儀器廠,型號：DYCZ-24DN);電轉儀(北京六一儀器廠,型號：DYCZ-40);切片盒(海門市杰銳思實驗器材廠,型號：20016532);石蠟切片機(沈陽恒松科技有限公司,型號：HS-S7220-B);其他儀器均由陜西中醫藥大學實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模與分組：在付小兵等[4]制作創面模型的基礎上做適當改良：取 60 只體重達標的大鼠,實驗當天禁食,3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔內注射麻醉。標記4 cm×4 cm面積剔除背部毛發,備皮區域用乙醇棉球消毒,大鼠背部制備一個2.0 cm×2.0 cm的正方形,按印記制備一個破壞皮膚全層并深達筋膜的正方形創面,避開大血管,查無活動性出血后,于創面滴灑0.5 ml糞便混懸液,并用醫用紗布覆蓋、包扎。3 d后取下紗布并觀察創面可見較多膿性分泌物,表示傷口已發生急性感染,即為造模成功。共造模成功60只,按隨機數字表法分成凡士林組10只,康復新液組10只、加味生肌玉紅膏組10只、PDTC+康復新液組10只、PDTC+凡士林組10只、PDTC+加味生肌玉紅膏組10只。

1.2.2 實驗給藥：造模成功后,每日清晨于大鼠創面滴灑糞便混懸液 0.5 ml,1 h后用0.9%氯化鈉溶液棉球清創,并用無菌干棉球擦拭分泌物。凡士林組(凡士林0.3 g/只)均勻涂抹傷口,康復新液組(康復新液0.3 ml/只)均勻涂抹創面,加味生肌玉紅膏組(加味生肌玉紅膏0.3 g/只)完全覆蓋創面,PDTC+康復新液組、PDTC+凡士林組和PDTC+加味生肌玉紅膏組需在藥物干預基礎上,給予NF-κB信號通路抑制劑 PDTC 100 mg/kg 腹腔注射,每日1次,連續 5 d。各組換完藥后用醫用紗布覆蓋,膠帶綁定。

1.2.3 一般情況：每日觀察大鼠進食、飲水及活動情況,換藥前或更換紗布時觀察創面情況：分泌物,感染,水腫,肉芽生長情況等。

1.2.4 創面愈合率：分別在干預3、7、14 d時記錄相關數據,創面用保鮮膜覆蓋,用記號筆描繪各組大鼠創面圖形,取保鮮膜緊密貼合于心電圖圖紙上,測量創面大小,記錄創面面積(cm2),計算創面愈合率。創面愈合率=(初始創面面積-當前創傷面積)/初始創面面積×100%。

1.2.5 血清VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6表達檢測：各組大鼠在給藥3、7、14 d時麻醉大鼠,大鼠尾靜脈抽取血樣2 ml,將血液溫水浴20 min后,5000 r/min離心15 min,留取血清,按ELISA測試試劑盒說明書進行檢測,用酶標儀在450 nm波長測量VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6的OD值,繪出曲線并計算出直線回歸方程式,將OD值代入并計算出蛋白濃度。

2 結 果

2.1 加味生肌玉紅膏對大鼠一般情況及創面愈合情況的影響 全程無樣本脫落,造模后第1天大鼠進食及活動量均較前明顯減少,各組創面情況均較差,水腫明顯,滲液較多,且表面覆有膿性分泌物;治療后第3天,大鼠飲食與活動量比造模當日稍改善,凡士林組與康復新液組可見高度組織水腫,明顯皮膚結構損傷,局部分泌物較多,加味生肌玉紅膏組、PDTC+康復新液組、PDTC+凡士林組和PDTC+加味生肌玉紅膏組創面炎癥比治療前稍減輕;第7～14天,各組大鼠創面逐漸出現痂皮覆蓋,去除痂皮可見康復新液組、凡士林組及PDTC+凡士林組創面水腫,仍有部分炎癥,創面較前縮小不明顯,而加味生肌玉紅膏組、PDTC+康復新液組、PDTC+加味生肌玉紅膏組創面水腫不明顯,創面較前明顯縮小,爬皮明顯;第21天時,各組已趨于愈合,除凡士林組和康復新液組外其余各組大鼠創面愈合較快,大部分PDTC+加味生肌玉紅膏組及加味生肌玉紅膏組大鼠接近完全愈合。

2.2 加味生肌玉紅膏對大鼠創面愈合率的影響 見表1。給藥第3、7、14天,加味生肌玉紅膏組與PDTC+加味生肌玉紅膏組創面愈合率顯著高于其余各組,差異有統計學意義(P<0.05)。給藥第3天,凡士林組、康復新液組、PDTC+凡士林組及PDTC+康復新液組創面愈合率差異無統計學意義(P>0.05)。給藥第7、14天,凡士林組的創面愈合率最低(P<0.05),PDTC+加味生肌玉紅膏和加味生肌玉紅膏組創面愈合率高于其余各組(P<0.05)。

表1 各組大鼠不同時間創面愈合率(%)

2.3 ELISA法檢測大鼠不同時間血清VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6的表達量 在給藥后第3天IL-1β表達達到峰值,凡士林組含量最高,康復新液組與凡士林組IL-1β表達含量明顯高于加味生肌玉紅膏組(P<0.05),PDTC+加味生肌玉紅膏組、PDTC+康復新液組含量低于其余各組(P<0.05);給藥第7、14天,PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-1β表達含量明顯低于其余各組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時間IL-1β表達情況(ng/ml)

在給藥第3天TNF-α表達達到峰值,凡士林組含量最高,康復新液組與凡士林組TNF-α表達含量明顯高于加味生肌玉紅膏組(P<0.05),PDTC+加味生肌玉紅膏組、PDTC+康復新液組TNF-α含量低于其余各組(P<0.05);給藥第7天,PDTC+加味生肌玉紅膏組TNF-α表達含量明顯低于其余各組(P<0.05);給藥第14天,TNF-α含量較前明顯降低,PDTC+加味生肌玉紅膏組TNF-α含量最低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠不同時間TNF-α表達情況(ng/ml)

在給藥第3天IL-6表達達到峰值,凡士林組含量最高,康復新液組與凡士林組TNF-α表達含量明顯高于加味生肌玉紅膏組(P<0.05),PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-6含量低于其余各組(P<0.05);給藥第7天,PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-6表達含量明顯低于其余各組(P<0.05),加味生肌玉紅膏組IL-6表達含量與康復新液組比較差異無統計學意義(P>0.05),但明顯低于凡士林組(P<0.05);給藥第14天,IL-6含量較前明顯降低,PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-6含量最低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠不同時間IL-6表達情況(ng/ml)

給藥第3天,凡士林組的VEGF含量最低(P<0.05);給藥第7天,各組VEGF含量逐漸升高,PDTC+加味生肌玉紅膏組VEGF含量高于其余各組(P<0.05),加味生肌玉紅膏組VEGF含量明顯高于康復新液組與凡士林組(P<0.05);給藥第14天,VEGF含量較第7天稍低,PDTC+加味生肌玉紅膏組與加味生肌玉紅膏組VEGF表達含量差異無統計學意義(P>0.05),但高于其余各組(P<0.05),加味生肌玉紅膏組VEGF表達含量明顯高于凡士林組與康復新液組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠不同時間VEGF表達情況(ng/ml)

3 討 論

目前肛瘺最普遍采用的治療方式仍是手術,然而肛周皮膚嬌嫩,肛門處痛覺神經豐富,肛瘺手術后的創面因糞便污染及排便過程中的機械性損傷,容易出現疼痛、水腫、出血、愈合緩慢等并發癥,進而嚴重影響患者的休息、進食、活動,從而影響肛瘺患者術后的恢復[5-7]。因此解決肛瘺術后創面愈合這一難題,已成為臨床醫生關注的重點。

生肌玉紅膏出自《外科正宗》,作為外治創面的經典藥方,具有祛腐生肌,活血止痛的功效,臨床療效得到了廣泛的認可。本研究采用陜西中醫藥大學附屬醫院制劑中心制備的加味生肌玉紅膏,藥物組成為：蒼術、白芷、輕粉、黃柏、當歸、甘草、白蠟、紫草、血竭等。其中甘草、黃柏有清熱解毒,消腫止痛的作用;蒼術、白芷有祛病除濕,排膿生肌,活血止痛等功效;當歸能活血化瘀,還具有潤燥滑腸的作用;紫草具有活血、涼血、清熱解毒作用,對熱結便秘具有較好療效,與當歸合用可以改善局部組織血液循環;血竭可化瘀止血,活血止痛;白蠟具有止血生肌的作用,輕粉則具有攻毒殺蟲,祛腐斂瘡的作用。諸藥合用制成加味生肌玉紅膏,可生肌止痛,解毒消腫,對紅腫、潰爛、流膿液的肛瘺術后創面具有較好的治療效果。本研究發現在治療的各個時間點,加味生肌玉紅膏組與PDTC+加味生肌玉紅膏組創面愈合率顯著高于其余各組,差異有統計學意義,且通過對創面觀察發現,凡士林組主要以瘢痕修復為主,且部分伴有創面水腫,加味生肌玉紅膏組與PDTC+加味生肌玉紅膏組創面較前明顯縮小,爬皮明顯,甚至部分創面已有毛發覆蓋,修復良好。表明加味生肌玉紅膏可以有效促進創面愈合。

本研究針對肛瘺術后創面早期濕熱內蘊明顯的病機特點,在煨膿長肉治法的指導下,在生肌玉紅膏原方的基礎上,增加并調整了祛濕清熱功效的藥物及劑量,使祛濕清熱作用更加突出。中醫學認為濕熱下注是肛瘺的根本病機,而濕熱邪氣的致病特點與炎癥密切相關。張旭峰等[8]研究發現濕熱體質的患者體內炎癥因子水平高于平和體質患者。有學者[9]證實,濕熱下注證患者的腫瘤壞死因子、白細胞介素-4、白細胞介素-10等炎性指標可明顯增高。濕熱流注肛門而致創面難斂,炎性反應又是肛瘺術后恢復緩慢的重要原因。NF-κB作為重要的轉錄因子,在炎癥性應激反應中占有重要的地位。已有研究證實NF-κB可高效誘導多種細胞因子,包括IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表達[10-12]。TNF-α、IL-6是最常見的炎性因子,可導致肛瘺術后多種并發癥的發生[13-14]。IL-6是一種由多種細胞合成并分泌的炎性因子,在機體免疫調節中發揮關鍵作用,是機體關鍵炎癥遞質和調節因子[15]。IL-1是炎性反應和免疫應答中的重要細胞因子,其中,IL-1β在宿主對抗炎性反應的開始和發展階段,可啟動炎癥的級聯反應,激活絲裂原活化蛋白酶通路,對創面愈合造成不良影響[16-17]。TNF-α具有廣泛的功能,它可以促進抗炎呈遞,誘導炎癥細胞活化、聚集,刺激機體局部炎性反應,還可與IL-1β相互作用加重炎性反應[18]。本研究結果顯示,在給藥后第3天IL-1β、TNF-α、IL-6表達達到峰值,凡士林組含量最高。治療各時間點加味生肌玉紅膏組的IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表達顯著低于凡士林組與康復新液組。給予NF-κB信號通路抑制劑PDTC 100 mg/kg腹腔注射后,治療第7、14天PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表達含量最低,表明加味生肌玉紅膏可有效抑制肛瘺術后創面的炎性反應。創面增生的關鍵階段,需要傷口內基底部肉芽組織的新血管生成[19],而生長因子參與細胞的生長、增殖、分化和遷移,從而促進肉芽的生長,加速上皮化[20-21]。VEGF作為目前已知最強的促血管內皮生長因子,在受損傷組織中發揮重要作用[22-23]。有研究證實,VEGF高表達的同時可刺激血管內皮細胞增殖,促進血管生成,加速創面愈合[24-25]。本研究結果顯示,VEGF在治療后第3天,凡士林組表達含量最低,之后各組VEGF含量逐漸升高,治療后第14天,VEGF含量較第7天稍低,而治療各時間點PDTC+加味生肌玉紅膏組與加味生肌玉紅膏組VEGF表達含量顯著高于凡士林組與康復新液組,證實了加味生肌玉紅膏可以促進VEGF蛋白的表達,促進血管形成,從而促進創面愈合。

綜上所述,加味生肌玉紅膏可能通過NF-κB 信號通路來抑制IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表達,且證實了其可上調VEGF蛋白的表達,從而促進血管內皮細胞新生,減輕炎性反應,加速創面組織的恢復,從而縮短愈合時間。以上研究表明,加味生肌玉紅膏對于肛瘺術后創面的恢復具有良好作用。然而加味生肌玉紅膏是否可通過其他作用機制促進創面愈合,需在以后的研究中進行更深入的探討。