30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑的高效液相色譜分析方法研究

苑璐，董立峰，于金山，韓順英，辛秀亮

(1.山東碧奧生物科技有限公司，山東威海264402；2.山東省五蓮縣叩官鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，山東日照262300；3.日照市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊，山東日照262300)

丙硫菌唑(prothioconazole)是由拜耳公司研發(fā)的一種低毒、廣譜的新型三唑硫酮類殺菌劑，主要用于防治禾谷類作物、豆類作物等的多種病害，尤其是對谷物作物的真菌病害表現(xiàn)出優(yōu)異的防治效果及優(yōu)良的保綠防衰作用，且增產(chǎn)明顯[1-3]。氟環(huán)唑(epoxiconazole)是一種內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，其主要抑制病菌麥角甾醇的合成，阻礙病菌細(xì)胞壁的形成，且對真菌C14-脫甲基化酶(C14-demethylase)有顯著抑制作用[1,4]，同時可提升作物幾丁質(zhì)酶活性，使真菌吸器收縮，抑制真菌侵入。為了提高對作物病害的防治效果，延緩抗藥性的產(chǎn)生，生產(chǎn)實際中常將這2 種藥劑混合使用或加工成混劑。2 者混劑的HPLC 檢測方法未見報道，筆者在30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑的研制及其應(yīng)用的基礎(chǔ)上，開展了產(chǎn)品分析方法研究，所得方法具有高效、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，可為其生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇，色譜純(市售)；磷酸，分析純(市售)；丙硫菌唑標(biāo)樣，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%(安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司)；氟環(huán)唑標(biāo)樣，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%(沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司)；30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑樣品(實驗室自制)。

PM1000 高效液相色譜儀配紫外檢測器(具可調(diào)波長)；ME204E/02 電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；KQ2200DA 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；濾膜：0.45μm(有機系，天津市領(lǐng)航實驗設(shè)備股份有限公司)。

1.2 色譜條件

Agilent 5TC-C18不銹鋼柱色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.，內(nèi)裝5μm 填充物)；流動相：甲醇-pH 3.0 磷酸水溶液(體積比80∶20)，通過濾膜過濾并進行脫氣；流速為1.0 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫為室溫；進樣體積為5μL。在該色譜條件下，丙硫菌唑和氟環(huán)唑的保留時間分別約為8.00、6.00 min。丙硫菌唑和氟環(huán)唑標(biāo)樣、混劑試樣的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 丙硫菌唑和氟環(huán)唑標(biāo)樣、混劑試樣的高效液相色譜圖

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)樣溶液的配制

分別稱取0.05 g(精確至0.00001 g)丙硫菌唑和氟環(huán)唑的標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，加入適量的甲醇，超聲均勻、冷卻至室溫后用甲醇稀釋到刻度線，搖勻備用。

1.3.2 試樣溶液的制備

稱取約0.35 g (精確至0.00001 g) 30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑于100 mL 容量瓶中，加入適量的甲醇，超聲均勻、冷卻至室溫后用甲醇稀釋到刻度線，搖勻備用。

1.4 測定

按1.2 條件，儀器基線確認(rèn)穩(wěn)定后，使用標(biāo)樣溶液連續(xù)進樣，待相鄰2 針峰面積相對變化＜2.0%，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進行測定。

1.5 計算

將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中丙硫菌唑和氟環(huán)唑的峰面積分別進行平均。試樣中的丙硫菌唑、氟環(huán)唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按下式計算[4-5]：

式中：w為試樣中丙硫菌唑或氟環(huán)唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；R2為丙硫菌唑或氟環(huán)唑試樣的峰面積平均值；m1為丙硫菌唑或氟環(huán)唑標(biāo)樣的質(zhì)量(g)；w1為標(biāo)樣中丙硫菌唑或氟環(huán)唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；R1為標(biāo)樣溶液中丙硫菌唑或氟環(huán)唑的峰面積平均值；m2為試樣的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

通過多次檢測確認(rèn)并充分考慮非有效成分峰的干擾，確定了220 nm 為該方法的檢測波長，并且在該波長下，2 種有效成分都有較好的峰形。

2.2 流動相及色譜柱的選擇

比較了不同廠商、填料的色譜柱和不同流動相體系，最終確認(rèn)以甲醇-pH 3.0 磷酸水為流動相，可以使丙硫菌唑、氟環(huán)唑有效成分以及其他非有效組分得到有效地分離，且不存在其他干擾因素。為了得到良好峰形和分析效果，最終設(shè)定流動相體積比為80∶20，柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min。

2.3 線性相關(guān)性測定

準(zhǔn)確稱取5 個不同質(zhì)量的丙硫菌唑、氟環(huán)唑標(biāo)樣，分別配制5 個系列質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液。按照確定的色譜分析條件進樣，得到其各自峰面積響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度的關(guān)系。在質(zhì)量濃度300～708 mg/L 范圍內(nèi)，丙硫菌唑質(zhì)量濃度與峰面積響應(yīng)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=990 444x+2E+06，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999；在質(zhì)量濃度295～703 mg/L 范圍內(nèi)，氟環(huán)唑質(zhì)量濃度與峰面積響應(yīng)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=1E+06x-166 968，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

2.4 方法的精密度

準(zhǔn)確稱取同一批次30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑試樣6 份，在上述的色譜條件下，測定試樣中氟環(huán)唑、丙硫菌唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(表1)。丙硫菌唑和氟環(huán)唑的標(biāo)準(zhǔn)偏差均為0.02，變異系數(shù)分別為0.1%、0.2%。該方法的精密度良好，能滿足對30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑的定量分析。

表1 精密度測定

2.5 方法的準(zhǔn)確度

在已知含量的30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑樣品溶液中，定量加入氟環(huán)唑、丙硫菌唑標(biāo)樣，按上述的色譜條件進行分析，結(jié)果見表2。丙硫菌唑的平均回收率為99.76%；氟環(huán)唑的平均回收率為99.90%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 準(zhǔn)確度測定

2.6 非分析物干擾試驗

用不含有效成分的標(biāo)準(zhǔn)制劑作為空白樣品，按1.2 色譜操作條件進行分析，采用高倍進樣，結(jié)果未見空白樣品中含其他干擾物質(zhì)。

3 結(jié)論

本文建立了一種同時檢測30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑中有效成分的定性定量高效液相色譜分析方法，即采用5TC-C18色譜柱(150mm×4.6mmi.d.×5μm)、輔助可變波長紫外檢測器，設(shè)定甲醇-pH3.0 磷酸水溶液為流動相(體積比為80∶20)。該方法操作簡單快捷、重復(fù)性和準(zhǔn)確度高、分離效果好，可用于30%丙硫菌唑·氟環(huán)唑懸浮劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制。