歐盟微生物農藥登記中次生代謝產物的風險評估

申繼忠，張海燕，余武秀

(1.上海艾農國際貿易有限公司，上海200122；2.江蘇永安化工有限公司，江蘇漣水223404)

1 微生物的次生代謝和次生代謝產物

代謝是生命體賴以生存的重要生命活動。代謝是指生物體內所發生的用于維持生命的一系列有序的化學反應的總稱。這些反應使得生物體能夠生長和繁殖、保持它們的結構以及對外界環境做出反應。代謝的實質是生命體內部及其與外界環境之間進行的物質和能量交換。因此可以將代謝分如下幾類：分解代謝(對大的分子進行分解以獲得能量，如細胞呼吸)，合成代謝(利用能量來合成細胞中的各個組分，如蛋白質和核酸等)，物質代謝(指生物體與外界環境之間物質的交換和生物體內物質的轉變過程)，能量代謝(指生物體與外界環境之間能量的交換和生物體內能量的轉變過程)。

另外，根據代謝產物對于生命體的意義還可以將代謝區分為初級代謝和次生代謝。初級代謝的代謝系統、代謝途徑和代謝產物在各類生物中都基本相同，是一類普遍存在于各類微生物中的一種基本代謝類型。初級代謝產物是指微生物通過代謝活動所產生的、自身生長和繁殖所必需的物質，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。在不同種類的微生物細胞中，初級代謝產物的種類基本相同。此外，初級代謝產物的合成在不停的進行著，任何一種產物的合成發生障礙都會影響微生物正常的生命活動，甚至導致死亡。

次生代謝的概念最早于1891 年由Kossel 明確提出。一般指微生物在一定的生長時期，以初級代謝產物為前體，合成一些對微生物生命活動無生理功能的物質，這一過程被稱為次生代謝，所形成的產物為次生代謝產物。次生代謝產物多是分子結構較復雜的化合物，如抗微生物藥物、毒素、生物堿等。

次生代謝在植物和微生物中都有發生，并且代謝途徑和代謝產物因不同生物而異，就是同種生物也會由于培養條件不同而產生不同的次生代謝產物。在次生代謝產物中，對維持生命占有重要地位的并不少，但另一方面，各種動植物和微生物所大量積累的生物堿、類萜(ferpenoid)、酚類、抗菌物質、色素等，其生理意義并不完全清楚。

在微生物的新陳代謝中，一般將微生物從外界吸收各種營養物質，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動的物質和能量的過程稱為初級代謝。初級代謝產物有單糖或單糖衍生物、核苷酸、維生素、氨基酸、脂肪酸等單體以及由它們組成的各種大分子聚合物，如蛋白質、核酸、多糖、脂質等生命必需物質。

微生物生長到一定階段才產生的化學結構十分復雜而且對微生物本身無明顯生理功能或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質，如抗微生物藥物、毒素、激素、色素等屬于微生物的次生代謝產物。不同種類的微生物所產生的次生代謝產物不相同，它們可能積累在細胞內，也可能排到外環境中。

微生物作為自然界種群數量最為龐大的一類生命體，與人類的生產和生活關系極為密切，因此對微生物的生命過程和代謝研究發展迅速。

Xu 等[1]統計發現，植物內生真菌可以產生各種次生代謝產物。這些代謝產物分布在30 個不同屬的各種真菌中，包括一些罕見的菌種。其中，球毛殼(Chaetomium globosum)是一種很特殊的微生物，因為它能產生大量獨特的、結構上具有重要生物活性的球毛殼菌素(chaetoglobosins)。這些代謝產物對植物病原真菌的抗真菌活性表明，內生真菌可以通過產生對植物病原有毒甚至致命的生物活性分子來保護其宿主植物，并突顯了內生真菌在產生有價值的代謝產物方面的潛力(表1)。

表1 不同微生物產生的抗真菌次生代謝產物數量[1]

微生物次生代謝產物也具有廣泛的生物活性，而且很多次生代謝產物同時具有多種活性。有些產物具有農藥活性，可用于多種作物保護目的(表2)[2]。

表2 各種微生物及其代謝產物的農藥作用示例[2]

2 歐盟微生物農藥登記的法規修訂

微生物農藥深受全球各國農藥主管部門的關注。不同國家均采取盡可能有利于快速進入市場的登記審批制度。微生物農藥的活性成分主要有微生物活體和/或其次生代謝產物。微生物活體的登記審批一般不存在太多爭議，但各國對次生代謝產物的登記則有不同的措施和要求。美國對活體微生物和次生代謝產物均采取比較寬松的政策，如含有多種次生代謝活性物質的Majestene(滅活的發酵液)被批準作為殺線蟲劑[3]。我國也批準登記了各種微生物次生代謝產物作為農藥使用，如井岡霉素、武夷菌素等[4]。澳大利亞生物農藥登記要求明確指出：如果微生物體產生或被懷疑可能產生毒素或有毒代謝物，則必須對代謝物進行鑒定，并在可能的情況下進行分離。毒素或有毒代謝物可能被要求提交完整的代謝和動力學研究結果。一些發展中國家如越南，則沒有明確提出與代謝物有關的要求。

歐盟一直重視化學農藥有效成分的環境代謝產物和微生物代謝產物的風險評估。有多種農藥有效成分因為代謝產物的風險不被接受而遭到歐盟的禁用。為了區別對待化學農藥和微生物農藥，并盡可能減少對微生物代謝產物風險評估的要求，以促進微生物農藥快速上市，2022 年歐盟批準了新的與微生物農藥登記相關的法規。

歐盟微生物農藥包括基于細菌、真菌、病毒和原生動物等生產的產品(主要指活體微生物產品)。2022 年2 月8 日歐盟成員國批準了4 項實施法規(Implementing Regulations)，修訂了適用于微生物的現行法規。新的法規與歐洲綠色協議(European Green Deal)完全配合，并有助于實現從農場到餐桌戰略(Farm to Fork strategy)的目標。4 項新法規包括：微生物有效成分的審批標準[Commission Regulation (EU) 2022/1438][5]、微生物活性物質登記審批需要提交的信息和數據要求[Commission Regulation (EU) 2022/1439][6]、微生物農藥制劑產品登記所需提交的信息和數據要求[Commission Regulation (EU) 2022/1440][7]以及評價和授權含微生物生物制劑產品的統一原則[Commission Regulation(EU)2022/1441][8]。

這些新法規將促進微生物農藥進入市場。

2022 年的修訂，表現在以下幾個方面：⑴允許使用同行評審的文獻數據作為登記資料的部分內容。⑵更新了風險評價規則。⑶為微生物修訂了“低風險農藥”的定義。⑷清楚地定義了“抗微生物藥物耐藥性”等幾個概念。⑸在新的“統一評估原則”中明確給出“受關切代謝產物”(metabolites of concern)的定義，不再提相關代謝產物(relevant metabolite)一詞(但該詞仍適用于化學農藥)。舊的原則中只有“相關代謝產物”(適用于化學農藥和微生物農藥)的概念但是沒有給出準確定義。⑹“受關切代謝產物”的定義：是指被評估微生物產生的次生代謝產物，具有已知的毒性或已知的相關抗微生物藥物活性，其在微生物制劑(MPCA)中存在的濃度可能對人類健康、動物健康或環境構成風險，和/或無法充分證明代謝產物的原位生產與風險評估無關。

修訂后的歐盟微生物農藥登記法規對微生物次生代謝產物作出如下說明：⑴如果申請者聲稱其所生產的微生物農藥中存在的一種或多種次生代謝產物是產品發揮植物保護作用的有效成分的一部分，則這些代謝產物的含量應按照化學農藥登記要求的新規定予以聲明。⑵申請人應確定并列出微生物可能產生的受關切的次生代謝產物，并根據登記要求的相關規定(有效成分審批資料要求的某些內容)提交用于確定或排除受關切代謝產物的信息摘要，除非該微生物是病毒。⑶如果有效物質屬于以下2 類，則將其歸為化學農藥有效成分進行審批：化學物質(包括信息化合物和從生物材料中提取的物質)，或由微生物產生的次生代謝產物(包括從微生物中純化的代謝產物或者從能復制或轉移遺傳物質的產生菌中提純的代謝產物)。⑷除非另有說明，有關(潛在)代謝產物的數據要求適用于生物防治劑母藥(TG-MPCA)或制劑產品(MPCP)中存在的代謝產物以及使用后原位產生的代謝產物。

3 修訂后的法規對受關切次生代謝產物的信息要求

3.1 歐盟微生物農藥統一評審原則對受關切代謝產物的評審要求

在統一評審原則的各條款下均對受關切次生代謝產物的信息提出了相應的要求：⑴評價受關切代謝產物的身份信息和質量標準。⑵根據活性成分審批要求法規Regulation(EU) No 283/2013 中要求的信息評價受關切代謝產物在儲藏過程中發生的變化。⑶受關切代謝產物對植物的藥害評價。⑷對受關切代謝產物分析方法的評價、殘留分析方法評價。⑸評價受關切代謝產物的毒性；觀察到的或預期的由于受關切代謝產物引起的植物保護產品的不良毒理學影響(對操作者、工人、旁觀者和居民)；代謝產物殘留引起的風險；代謝產物殘留水平。

3.2 活性成分審批需要提交的受關切代謝產物的信息

⑴相關雜質的身份和定量信息(最高含量)。⑵對靶標生物的作用方式和寄主范圍：應提供來自科學同行評審文獻或任何其他可靠來源的關于受關切代謝產物可能的作用方式和目標生物可能暴露于受關切代謝產物的途徑的信息。⑶有關代謝產物的信息：申請人應在這一項下確定并列出微生物產生的受關切代謝產物，包括根據活性成分數據要求的某些方面的要求提交的用于確定或排除受關切代謝產物的信息摘要，除非該微生物是病毒。可根據科學文獻或對微生物或密切相關菌株進行的毒性、生態毒性或抗微生物藥物活性研究的觀察來確定受關切代謝產物。通過采用適當的基因組方法(如全基因組測序)證明，不存在生產所鑒定的潛在問題代謝產物所需的基因，應被視為證明該代謝產物不存在此類危害的證據。⑷受關切代謝產物分析方法。⑸受關切代謝產物殘留分析方法。⑹治療和急救措施：提交受關切代謝產物的已知拮抗劑(解毒劑)信息。⑺醫學監測報告應包括受關切代謝產物信息。⑻代謝產物信息和毒性研究。⑼代謝產物殘留數據。⑽微生物以及受關切代謝產物的環境發生、環境行為和歸宿，代謝產物的環境暴露數據。⑾代謝產物的信息和生態毒理學研究[4]。

3.3 制劑登記需要提交的受關切代謝產物的信息

⑴制劑產品的物理、化學和技術特性。⑵儲存前后受關切代謝產物的存在。⑶關于制劑產品的進一步信息：使用設備的清洗。⑷分析方法：受關切代謝產物的標樣(技術上可行的話)和分析方法。⑸藥效數據：受關切代謝產物對后茬作物的影響。⑹對人的影響：潛在毒性評價，包括皮膚致敏性、額外毒性數據。⑺對非靶標生物的影響：對陸棲脊椎動物、魚、水生無脊椎動物、藻類、水生植物(大型水藻)、蜜蜂及其他非靶標節肢動物的影響，對土壤中非靶標中、大型生物的影響，對非靶標陸生植物的影響[5]。

4 微生物次生代謝產物的風險評價

2020 年，歐盟健康和食品安全總理事會頒布了用作農藥的微生物產生的次生代謝產物的風險評價指南[9]。指南的目的是幫助評審人員對微生物農藥制劑中存在的次生代謝產物進行風險評價，確定出可能受關切的次生代謝產物并進行相應的風險評估。通過定性定量風險評估確定受關切次生代謝產物的風險是否可被接受。

4.1 指南對微生物(受關切)次生代謝產物的定義

次生代謝產物對微生物的初級代謝過程并不是必需的，它表現出一些可能與微生物生存功能有關的生物活動，如競爭、寄生或共生、金屬運輸等。

次生代謝產物通常是在特定的物理和生物條件共同存在的情況下由微生物產生的。單個微生物菌株產生令人關切的代謝產物的能力取決于該特定菌株許多特有的環境和遺傳因素。一種或多種菌株不產生不受歡迎的化合物并不能推定同一種內所有菌株也不產生這類化合物。

受關切次生代謝產物是被評估菌株產生的具有已知的毒性或抗微生物藥物活性的代謝產物，其可接受的風險應通過定量風險評估來證明。

4.2 關于原位(in situ)產生的未知代謝產物

所謂原位產生的代謝產物，是指活體微生物制劑使用之后其在田間使用部位可能產生的代謝產物。指南文件中描述的方法是基于次生代謝產物的毒性研究、作用方式、對收獲后的發酵培養基以及對微生物有害生物防治劑母藥(TG-MPCA)和/或微生物防治劑(MPCP)的分析數據。不是在發酵過程中產生的代謝產物和/或與作用方式無關的原位產生的代謝產物的風險評價不在本指南的范圍內。由于這些代謝產物是未知的，所以它們在天然微生物中的存在無法被合理地證實。可以預期，它們的產量很低，因為存在競爭而且微生物可利用的資源和能量都有限。此外，微生物被認為無處不在，因此人類、動物和環境都會自然接觸到這些代謝產物。所以，除非通過公開文獻綜述、毒性研究、基因組表征或其他與微生物有關的信息能夠確定這些代謝產物危害，否則可以合理地假設這些未知代謝產物不會構成可預見的風險，因此不構成法規意義上的“相關代謝產物(relevant metabolites)”。

4.3 關于具抗微生物藥物活性的次生代謝產物

指南文件涉及的與微生物代謝產物有關的2 種危害是毒性和抗微生物藥物活性。歐盟特別關注抗微生物藥物的農業應用。因此，如果已知某種微生物能夠產生具有重要醫學意義的抗微生物藥物(依據WHO的定義)，則應評估制劑產品中是否存在這類化合物。

WHO 對抗微生物藥物(antimicrobials)耐藥性(AMR)的釋義如下：抗微生物藥物包括抗生素、抗病毒藥、抗真菌藥和抗寄生蟲藥，它們是用于預防和治療人類、動物和植物感染的藥物。而抗微生物藥物耐藥性是指當細菌、病毒、真菌和寄生蟲隨著時間的推移發生變化，不再對藥物產生反應。

與在制劑產品中存在的抗微生物藥物的釋放不同，土著或施用后的外來微生物原位產生的抗微生物藥物只在很小的范圍內產生一定時期的拮抗作用。即使土壤或植物環境中存在人類或動物病原體，暴露于這些抗微生物藥物而直接相互作用，這種暴露也僅限于短時間，之后是長時間的不暴露。這種情況不利于抗微生物藥物耐藥性的發展和持續。因此，用于植物保護產品的微生物原位產生的抗微生物藥物不被視為對人類和動物健康構成可預見的風險。因此，沒有必要對這些原位產生的抗微生物藥物化合物進行評估。

為了便于風險評價，指南文件給出了2 個定義，可視為評估原則。

⑴潛在受關切的代謝產物：被評估菌株可能產生的在基于文獻和試驗數據的初步評估中(即在該指南中描述的評估的第2 階段結束時)已經確定具有毒性或抗微生物藥物活性的代謝物。對此類次生代謝產物進一步的評估是必要的，以確定其是否屬于受關切的次生代謝產物。

⑵受關切的代次生謝產物：被評估菌株產生的代謝物，具有已知的毒性或抗微生物藥物活性，其可接受的風險應通過定量風險評估來證明。

4.4 分步確定受關切的次生代謝產物

為了確定微生物是否正在產生受關切的代謝產物，指導文件按照分步的程序進行評估。該指南將評估程序分成4 個階段：⑴第1 階段(步驟1～2)：確定需要評估的代謝產物所屬類型(包括歸入化學農藥評審、無需進行評審的病毒、需要進一步評審3 種)；⑵第2 階段(步驟3～11)：收集關于代謝產物的基本信息，并產生潛在受關切代謝產物的清單；⑶第3 階段(步驟12～15)：確定哪些已識別的代謝產物值得關切，從而得到值得受關切的代謝產物清單和無需關切的代謝物清單；⑷第4 階段(步驟16～20)：對受關切的代謝產物進行風險評估。

每個階段由幾個步驟組成。這些步驟包含對申請人和風險評估人員的提問，以指導他們完成每個階段的過程。

4.4.1 第1 階段(步驟1～2)：確定代謝產物所需的評估類型

步驟1：確定次生代謝產物在微生物農藥作用方式中所起的作用。即需要確定微生物活性物質的主要作用方式是否基于制劑產品中存在的次生代謝產物。

關于微生物作用方式的信息對于識別潛在受關切代謝產物很重要。因此，在技術上可行的情況下必須在登記申請檔案中盡可能詳細地描述產品的作用方式，并有科學證據支持，以確定所鑒定的代謝產物是否明確參與作用方式。

如果微生物產品的植物保護作用已知是由于毒素/代謝產物的殘留效應，或者作用方式是基于產品中存在的代謝物的殘留效應，這意味著采用離體的代謝產物將產生相同的植物保護作用并且代謝物可以被視為活性物質，此時需要按照化學農藥登記要求提交數據檔案。含有滅活微生物及微生物代謝物的某些產品就屬于這一類(如美國批準的Majestene 殺線蟲劑)。

作用方式不是基于產品中存在的次生代謝物的所有微生物產品，則進入步驟2 進一步予以評估。

步驟2：目的是排除次生代謝產物的產生。如果微生物農藥是基于病毒生產的，根據目前的科學知識，沒有跡象表明病毒能產生可能令人擔憂的代謝物，因此不需要進一步評估。

對于所有其他微生物：進入第2 階段。

4.4.2 第2 階段(步驟3～11)：收集關于代謝物的基本信息

在第2 階段，結合不同來源的數據集，確定哪些代謝產物可能是由被評估的菌株和密切相關的菌株所產生，并收集有關這些代謝物的危害信息(即毒性或抗微生物藥物活性)，以確定導致任何觀察到的毒性作用的任何代謝物。

作為第2 階段評估的一部分，需分別準備如下3 個清單：⑴所申請菌株及其相關菌株(及其危害作用)被確定的代謝物清單。⑵(生態)毒理學研究中觀察到的可能由代謝物引起的有害影響清單。⑶未觀察到任何有害影響的(生態)毒理學研究。

在這些(生態)毒理學研究中觀察到的能產生有害影響的任何代謝物都必須予以鑒定。

應該對第一個清單中所有得到確定的代謝物進行單獨的文獻檢索。然后將上述前2 個清單合并為潛在的受關切有毒代謝物清單(包括有抗微生物藥物活性的化合物)。

收集關于代謝產物的基本信息，并生成潛在受關切代謝產物的清單。

在第2 階段，步驟3～8 是強制性的。步驟9 是一個可選步驟，可用于排除潛在的代謝產物，以進一步評估。步驟10 是有條件的步驟，對于信息不太全的微生物是必需的。

4.4.3 第3 階段(步驟12～15)：確定受關切的代謝產物

在第3 階段將處理由第2 階段確定的潛在受關切代謝物可能引起的風險。

預期的成果是將潛在受關切的代謝產物區分為“不受關切”或“受關切并需要風險評估”2 組。

要確定代謝產物是否真正值得關切，則需要確定代謝物的暴露程度。由于暴露取決于母藥(TGMPCA)中存在的代謝產物和代謝產物的原位產生，因此確定實際暴露水平可能具有挑戰性。

如果能充分證明菌株不產生代謝產物(例如通過全基因組測序即WGS 數據)，則無需評估。否則進入代謝產物的暴露途徑評估。

如能充分證明代謝產物的原位產生與風險評估無關，則無需評估。若不能，則進入下一步確定潛在的受關切代謝產物是否存在受關切的風險。

通過定性評估能否證明人類或相關的非靶生物(NTO)對代謝產物的暴露在不值得關切的背景暴露水平范圍內，若是，則無需評估；否則將其確定為“受關切代謝產物”。

對于所有值得關切的代謝產物(第3 階段的結果)，說明原位產生是否與風險評估相關，以及代謝產物是否存在于產品中。然后進入第4 階段。

4.4.4 第4 階段(步驟16～20)：對受關切的代謝產物(即相關代謝產物)進行風險評估

第4 階段的風險評估對于以下所有代謝物都是必要的：⑴暴露評估不能證明代謝物與人類和非靶生物無關；⑵所描述的毒理學效應被認為與擬議的用途有關。

所有已確定的對人類和相關非靶生物(即已確定危害的生物)的毒性類型(如急性毒性、遺傳毒性)都需要在風險評估中加以處理。

對于風險評估，原則上應遵循微生物和化學活性物質法規和指導文件中指定的相關標準方法。如果這些方法不合適或在技術上不可行，可以考慮以下方法：

⑴暴露評估(暴露的確定)

對于產品中存在的代謝產物造成的暴露，應根據歐洲食品安全局(EFSA)關于農藥環境歸宿建模和/或操作人員/工人/旁觀者/居民的現行指南，酌情進行定量暴露評估。

對于那些沒有充分證明原位產生與風險評估無關的代謝產物，通過測量代謝產物在相關環境區域的濃度來確定暴露(例如可食用部分，這將觸發需要進行殘留試驗，如化學農藥數據要求所述)。

⑵從文獻或毒理學關切閾值(TTC)中確定參考值

是否可以根據現有信息/數據確定相關代謝產物的參考值，若是，進入設置NOAEL/NOEC 和參考值的步驟(見下文)；若否，進入(生態)毒性測試。

毒理學關切閾值(TTC)方法適用于受關切的代謝產物，若是，進入設置NOAEL/NOEC 和參考值的步驟；若否，進入(生態)毒性測試。

⑶根據文獻/現有數據確定受關切代謝產物的毒性終點(生態毒理學)

是否可以根據現有文獻/數據確定相關非靶標生物組的代謝產物的毒性終點，若是，進入設置NOAEL/NOEC 和參考值的步驟；若否，進入(生態)毒性測試。

⑷NOAEL/NOEC 和參考值的設置

酌情為人類健康設定無可見有害作用水平(NOAEL)/最大無影響濃度(NOEC)及相關群體的參考值包括施用人員允許暴露量(AOEL)/急性參考劑量(ARfD)/每日允許攝入量(ADI)/農藥施用人員急性允許暴露量(AAOEL)；對非靶標生物的NOEC/EC50。另外(特別是對于遺傳毒性物質)，如果合適，可以使用TTC。

4.4.5 定量風險評估

⑴對人的毒理學風險評估

適當地將暴露量與參考值進行比較。確定所評估的接觸組/有機體是否突破了相應的觸發值(如傳統化學物質)。如果沒有突破，則表示該代謝產物存在可接受的風險，更新概述表。如果突破了，即表明該代謝產物存在不可接受的風險，更新受關切代謝物清單。

⑵生態毒理學風險評估

適當地將暴露量與參考值進行比較。確定所評估的接觸組/有機體是否突破了相應的觸發值(如傳統化學物質)。如果沒有突破，則表示該代謝產物存在可接受的風險，更新概述表。如果突破了，代表該代謝產物存在不可接受的風險，更新受關切代謝物清單。

該指南已經得到實際應用。2023 年3 月1 日批準有效期至2038 年2 月28 日的微生物農藥有效成分綠假單胞菌菌株MA342，評審結果要求該活性成分中存在的具有遺傳毒性的代謝物2,3-deepoxy-2,3-didehydro-rhizoxin(DDR)的含量不得超過2 μg/mL。同時要求根據該指南進一步提供有關DDR 的信息，尤其是環境降解速率信息[10]。

5 小結

為了適應歐洲綠色協議和從農場到餐桌戰略，歐盟于2022 年修訂了微生物農藥的登記評審相關法規。在此之前的2020 年歐盟委員會發布了微生物農藥中代謝產物風險評價指南。該指南提出了一種實用的逐步評估方法來評估微生物(擬)作為活性物質生產的次生代謝物的相關風險。指南自2021 年11 月1 日起生效。

該指南設計的風險評估程序分4 個步驟。第1 步是確定微生物代謝產物可能需要的評估類型(包括歸入化學農藥評審、無需進行評審的病毒、需要進一步評審3 種)；第2 步是通過文獻檢索和試驗數據，收集有關微生物及其代謝物的信息，以建立潛在的受關切代謝物列表；第3 步是根據被評估菌株實際產生代謝物的數據，可能的暴露途徑和定性風險評估，將潛在的受關切代謝物列表細化為受關切代謝物列表。最后1 步是對每一種確定的受關切次生代謝物進行定性和定量風險評估。