我國(guó)微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系構(gòu)建方法與內(nèi)容解析

卜元卿，周蓉，袁善奎，虞悅，張圣虎，戴傳超，藍(lán)帥

(1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京210042；2.南京信息工程大學(xué)江蘇省大氣環(huán)境與裝備技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210044；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京100125；4.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210023)

隨著化學(xué)農(nóng)藥使用對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康危害日益顯現(xiàn)，削減化學(xué)農(nóng)藥使用、開(kāi)發(fā)替代品成為各國(guó)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的首要任務(wù)之一。“十四五”期間，生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)將成為我國(guó)新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)之一，成為保障農(nóng)業(yè)綠色高質(zhì)量發(fā)展的重要生產(chǎn)資料，實(shí)現(xiàn)人民生命健康的重要基石。微生物農(nóng)藥是最大的生物農(nóng)藥類型，占全球生物農(nóng)藥產(chǎn)品近90%。微生物農(nóng)藥具有物種資源豐富、不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境有毒有害物質(zhì)殘留低等顯著特點(diǎn)，是最具潛力和價(jià)值的化學(xué)農(nóng)藥替代產(chǎn)品。截至2022 年12 月31 日，在有效登記狀態(tài)的生物農(nóng)藥有效成分有142 個(gè)，產(chǎn)品有1900 多個(gè)。8 年來(lái)生物農(nóng)藥有效成分和產(chǎn)品的年均增長(zhǎng)率分別為6.40%和8.83%[1]。

雖然微生物農(nóng)藥的環(huán)境友好性一般優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥，具有較好的化學(xué)農(nóng)藥替代潛力，且開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景廣闊，但其環(huán)境安全性并不能因此被忽視。微生物農(nóng)藥進(jìn)入環(huán)境后作為非土著生物，可通過(guò)資源競(jìng)爭(zhēng)或釋放毒素改變?cè)鷳B(tài)系統(tǒng)平衡，在殺滅/控制靶標(biāo)生物的同時(shí)，也存在對(duì)環(huán)境生物產(chǎn)生不良作用的風(fēng)險(xiǎn)，以及危害傳播的風(fēng)險(xiǎn)。與化學(xué)農(nóng)藥不同，微生物農(nóng)藥通過(guò)直接施用或噴灑飄移、雨水沖刷等途徑進(jìn)入環(huán)境，其數(shù)量受環(huán)境條件影響有可能減少，也有可能增加。當(dāng)環(huán)境條件不適宜時(shí)，微生物的生命活動(dòng)受到抑制或引起變異、甚至死亡；當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，微生物菌株開(kāi)始生長(zhǎng)、繁殖，并發(fā)揮其生態(tài)作用。而且微生物農(nóng)藥進(jìn)入環(huán)境生物體內(nèi)后，除了毒性作用外，還具有侵染力，可以在生物體內(nèi)定殖、繁殖和擴(kuò)散，突破機(jī)體的防御屏障，產(chǎn)生內(nèi)化作用。由于微生物毒性發(fā)生機(jī)制、環(huán)境暴露途徑有其獨(dú)特性，顯著不同于化學(xué)農(nóng)藥，因此，微生物農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序、評(píng)估指標(biāo)、數(shù)據(jù)測(cè)試方法和評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)等也不同于化學(xué)農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估要求。立足微生物農(nóng)藥特征，建立微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體系，對(duì)防范微生物農(nóng)藥使用的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有重要作用。

為了加強(qiáng)微生物農(nóng)藥的環(huán)境管理，保護(hù)生物安全和生態(tài)環(huán)境，世界各國(guó)都加大了生物制劑的環(huán)境監(jiān)管力度。美國(guó)、加拿大、日本、歐盟等國(guó)家和組織分別建立了微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)技術(shù)體系，對(duì)促進(jìn)微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展起到了重要作用。然而，長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)微生物農(nóng)藥環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)基礎(chǔ)研究薄弱、環(huán)境安全管理體系不健全等，導(dǎo)致微生物農(nóng)藥產(chǎn)品創(chuàng)制和產(chǎn)業(yè)發(fā)展整體滯后于國(guó)際發(fā)展水平。2017 年《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》修訂并實(shí)施后，新修訂的《農(nóng)藥登記管理辦法》《農(nóng)藥登記資料要求》《農(nóng)藥登記試驗(yàn)管理辦法》等相繼頒布。對(duì)微生物農(nóng)藥登記資料要求發(fā)生了一些變化，包括更加關(guān)注微生物農(nóng)藥的環(huán)境安全性，提出了有別于化學(xué)農(nóng)藥的微生物環(huán)境生物毒性試驗(yàn)、增殖試驗(yàn)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估登記資料的要求[2]，使我國(guó)微生物農(nóng)藥的管理更加規(guī)范。

針對(duì)我國(guó)微生物農(nóng)藥環(huán)境安全管理的迫切需求，筆者通過(guò)資料調(diào)研及研究分析構(gòu)建了以風(fēng)險(xiǎn)控制為指導(dǎo)思想，涵蓋環(huán)境生物毒性評(píng)價(jià)、環(huán)境增殖能力評(píng)價(jià)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系，形成《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》、《微生物農(nóng)藥環(huán)境增殖試驗(yàn)準(zhǔn)則》和《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南》系列標(biāo)準(zhǔn)15 項(xiàng)。該標(biāo)準(zhǔn)體系將微生物學(xué)、細(xì)菌學(xué)、遺傳學(xué)等經(jīng)典理論靈活應(yīng)用到微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)當(dāng)中，并將多種微生物環(huán)境檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行靈活組合，顯著提高方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可靠性，填補(bǔ)了我國(guó)微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)管理技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)空白。

1 微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法

《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T 3152.1—2017～NY/T 3152.6—2017)系列標(biāo)準(zhǔn)共6 項(xiàng)，分別針對(duì)6 類不同的環(huán)境生物。生態(tài)系統(tǒng)中的各類生物都有可能受到微生物農(nóng)藥的影響，但在進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)時(shí)，不可能對(duì)環(huán)境中的所有生物開(kāi)展測(cè)試，因此，需要綜合考慮生物類群的生態(tài)價(jià)值、科學(xué)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，選擇典型的、有代表性的生物類群作為毒性測(cè)試的受試生物。另外，微生物農(nóng)藥進(jìn)入環(huán)境后對(duì)環(huán)境中非靶標(biāo)生物的不利影響主要來(lái)源于微生物菌株的致病性。在試驗(yàn)方法構(gòu)建時(shí)也需要兼顧病原體侵入生物機(jī)體的數(shù)量、侵襲力、毒力等與微生物菌株致病性相關(guān)的因素[3]。通過(guò)細(xì)菌類微生物農(nóng)藥蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)、真菌類微生物農(nóng)藥球孢白僵菌(Beauveria bassiana，Bb)以及病毒類微生物農(nóng)藥棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(Helicoverpa armigera nuclear polyhedrosis virus，HaNPV)對(duì)不同環(huán)境生物的毒性評(píng)價(jià)研究，建立了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)毒性測(cè)試方法[3]。遵循最不利原則，微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)毒性測(cè)試采用遞進(jìn)式的測(cè)試方法，首先進(jìn)行最不利條件下的最大暴露量試驗(yàn)，若發(fā)現(xiàn)有不良影響，再進(jìn)一步開(kāi)展劑量驗(yàn)證試驗(yàn)和致死(病)驗(yàn)證試驗(yàn)。由于最大暴露量試驗(yàn)只需設(shè)置一組處理組，因此對(duì)于不存在非靶標(biāo)環(huán)境生物致死(病)性的微生物農(nóng)藥，首先開(kāi)展最大危害暴露量試驗(yàn)可大大減少毒性測(cè)試的時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本。

1.1 環(huán)境生物指標(biāo)的選擇(基本同現(xiàn)有化學(xué)農(nóng)藥)

根據(jù)不同生物類群的特點(diǎn)、敏感程度以及生態(tài)價(jià)值，結(jié)合我國(guó)《農(nóng)藥登記資料規(guī)定》要求，選擇6 大類典型的、有代表性的生物作為毒性測(cè)試的受試生物。

1.1.1 水生生物指標(biāo)

水生態(tài)系統(tǒng)中，魚(yú)類是一個(gè)重要組成部分，處于水生食物鏈的頂端，攝食初級(jí)生產(chǎn)者和水生無(wú)脊椎動(dòng)物，對(duì)維護(hù)水生生態(tài)系統(tǒng)的完整性和穩(wěn)定性具有重要作用，而且我國(guó)魚(yú)類物種豐富，且魚(yú)類具有藥用、食用等經(jīng)濟(jì)價(jià)值。溞類是作為初級(jí)消費(fèi)者，對(duì)維護(hù)水生態(tài)系統(tǒng)功能和水環(huán)境質(zhì)量也具有重要作用。藻類是地球上最重要的初級(jí)生產(chǎn)者，其物種多樣性及豐富度直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。而且溞類和藻類對(duì)于毒性物質(zhì)都具有較高的敏感性。因此，選擇魚(yú)類、溞類和藻類作為微生物農(nóng)藥對(duì)水生生態(tài)環(huán)境影響的生物指標(biāo)。

1.1.2 陸生生物指標(biāo)

陸生生態(tài)系統(tǒng)中，鳥(niǎo)類參與生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)能量流動(dòng)和無(wú)機(jī)物質(zhì)循環(huán)，對(duì)森林、草原、農(nóng)田、湖泊、海洋等生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定都具有維持作用，而且我國(guó)是鳥(niǎo)類資源最為豐富的國(guó)家。蜜蜂是對(duì)人類有益的昆蟲(chóng)類群之一，它既采花釀蜜，又傳授花粉，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。家蠶是我國(guó)特有的一種重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)農(nóng)藥十分敏感，又是非靶標(biāo)生物的代表物種之一。因此，選擇鳥(niǎo)類、蜜蜂和家蠶作為微生物農(nóng)藥對(duì)陸生生態(tài)環(huán)境影響的生物指標(biāo)。

1.2 毒性測(cè)試方法的建立

根據(jù)微生物農(nóng)藥的特點(diǎn)以及環(huán)境生物的特性，分別建立了6 類環(huán)境生物的毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法。

1.2.1 暴露途徑

微生物農(nóng)藥對(duì)環(huán)境生物產(chǎn)生毒性需滿足2 個(gè)條件，一是對(duì)環(huán)境生物具有暴露的可能，二是對(duì)環(huán)境生物具有致死或致病的能力。因此，在進(jìn)行微生物農(nóng)藥毒性評(píng)價(jià)時(shí)，首先應(yīng)確定其暴露途徑。微生物農(nóng)藥通過(guò)施用進(jìn)入環(huán)境后，可通過(guò)皮膚、食物、飲用水等多種途徑進(jìn)入生物體，而且微生物菌株種類繁多，致病途徑因種類而異，因此，評(píng)價(jià)微生物農(nóng)藥的毒性時(shí)暴露途徑的選擇尤為重要。

對(duì)于水生生物來(lái)說(shuō)，整個(gè)生命周期均暴露于水環(huán)境中，因此接觸暴露是最為重要的暴露方式。另外，魚(yú)類還有可能會(huì)攝食遷移進(jìn)入水體中被微生物農(nóng)藥感染的昆蟲(chóng)，因此還需要考慮經(jīng)口暴露途徑。

對(duì)于陸生生物，暴露途徑的設(shè)置主要參考美國(guó)、加拿大、日本等國(guó)家微生物農(nóng)藥毒性試驗(yàn)暴露途徑要求。鳥(niǎo)類根據(jù)微生物農(nóng)藥菌株特性和使用方式選擇經(jīng)口飼喂或腹腔注射作為暴露途徑。蜜蜂則根據(jù)微生物農(nóng)藥的種類選擇經(jīng)口或接觸的暴露途徑。家蠶以經(jīng)口暴露途徑為主，采用浸葉法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)周期

微生物菌株通過(guò)不同的暴露途徑侵入生物體后，可能會(huì)存在一定時(shí)期的潛伏期，因此，與化學(xué)農(nóng)藥相比，微生物農(nóng)藥對(duì)環(huán)境生物的毒性試驗(yàn)需要更長(zhǎng)的試驗(yàn)周期。參考美國(guó)、加拿大、日本微生物農(nóng)藥環(huán)境安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)要求，結(jié)合用于試驗(yàn)的受試生物的生命周期，確定水生生物魚(yú)類的試驗(yàn)觀察時(shí)間持續(xù)30 d，溞類的試驗(yàn)觀察時(shí)間持續(xù)21 d，藻類的試驗(yàn)觀察時(shí)間持續(xù)96 h。陸生生物鳥(niǎo)類的試驗(yàn)觀察時(shí)間持續(xù)30 d，蜜蜂的試驗(yàn)觀察時(shí)間持續(xù)14 d，家蠶的試驗(yàn)觀察時(shí)間沒(méi)有明確的天數(shù)要求，根據(jù)家蠶的發(fā)育情況，從2 齡起至家蠶化蛹。但是對(duì)于魚(yú)類、溞類、鳥(niǎo)類和蜜蜂，當(dāng)受試生物在以上規(guī)定的試驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)死亡、活動(dòng)抑制等毒性效應(yīng)或明顯病征，則需延長(zhǎng)觀察時(shí)間，直至確定最終的影響。

1.2.3 最大危害暴露量試驗(yàn)

微生物農(nóng)藥中的微生物菌株進(jìn)入環(huán)境后，除了會(huì)侵入環(huán)境生物體內(nèi)，還有一部分會(huì)暴露在環(huán)境當(dāng)中，并在環(huán)境中傳播及增殖，最大危害暴露量試驗(yàn)的設(shè)置考慮了風(fēng)險(xiǎn)最大可能性發(fā)生時(shí)的最不利影響，包括具有一定數(shù)量和足夠毒力的微生物以及適宜的入侵途徑；處于易感性的敏感生物；具有可促使微生物侵入易感動(dòng)物的外界條件，同時(shí)考慮了潛伏期(從暴露到感染和染病的時(shí)間)、免疫力(正常的和受損的)的影響。如果環(huán)境生物暴露于最大劑量微生物農(nóng)藥時(shí)，未發(fā)生不良影響，則可以認(rèn)為微生物農(nóng)藥在使用中不會(huì)產(chǎn)生不良影響。微生物農(nóng)藥最大危害暴露量(表1)的設(shè)置主要參考美國(guó)微生物農(nóng)藥毒性測(cè)試方法[4-9]，考慮的因素包括物種特征、暴露途徑和微生物農(nóng)藥在水中的溶解度等。由于美國(guó)微生物農(nóng)藥測(cè)試的環(huán)境生物不包括水生生物藻類和陸生生物家蠶，因此這2 種生物的最大危害暴露量分別參照水生生物魚(yú)類和溞類，以及陸生生物蜜蜂相應(yīng)暴露途徑的最大危害暴露量。

表1 微生物農(nóng)藥最大危害暴露量

試驗(yàn)開(kāi)始后，每日觀察受試生物的死亡情況及毒性癥狀，當(dāng)試驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)，有50%的個(gè)體死亡或致病時(shí)，則需要進(jìn)一步開(kāi)展劑量效應(yīng)毒性試驗(yàn)。

1.2.4 劑量效應(yīng)毒性試驗(yàn)

劑量效應(yīng)毒性試驗(yàn)的目的是評(píng)價(jià)微生物菌株在系列環(huán)境暴露濃度下對(duì)環(huán)境生物的影響，以確定微生物與環(huán)境生物之間的毒性劑量效應(yīng)關(guān)系。劑量效應(yīng)毒性試驗(yàn)系列濃度的設(shè)置依據(jù)最大危害暴露量試驗(yàn)結(jié)果，按一定比例間距設(shè)置5～7組暴露濃度，用以確定微生物農(nóng)藥對(duì)不同環(huán)境生物的半數(shù)致死量(LD50/LC50)、半數(shù)感染量(ID50/IC50)、半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)。

1.2.5 致死(病)驗(yàn)證試驗(yàn)

微生物對(duì)生物群體發(fā)生危害的必要條件主要有易感群體、致病性(毒力)和環(huán)境傳播能力。針對(duì)微生物農(nóng)藥生物體內(nèi)存活和繁衍對(duì)宿主的危害，以微生物學(xué)經(jīng)典理論科赫氏法則為依據(jù)，建立了傳統(tǒng)稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法、血球計(jì)數(shù)板法與熒光定量PCR法相結(jié)合的微生物農(nóng)藥環(huán)境生物致病性測(cè)試方法。試驗(yàn)時(shí)可根據(jù)微生物類型和特性選擇合適的方法。細(xì)菌可采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法結(jié)合熒光定量PCR法，真菌可采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法和血球計(jì)數(shù)板法，原生動(dòng)物可選擇血球計(jì)數(shù)板法，病毒可采用血球計(jì)數(shù)板法和熒光定量PCR 法。

2 微生物農(nóng)藥環(huán)境增殖標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法

《微生物農(nóng)藥環(huán)境增殖試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T3278.1—2018～NY/T3278.3—2018)系列標(biāo)準(zhǔn)共3 項(xiàng)，分別針對(duì)3 類不同的環(huán)境介質(zhì)，目的是要通過(guò)測(cè)試證明微生物菌株在環(huán)境中宿存或繁殖、復(fù)制的能力。微生物農(nóng)藥施用后除了少部分作用于靶標(biāo)生物外，大部分進(jìn)入土壤、水、空氣、植物葉面等環(huán)境介質(zhì)中。微生物菌株與不同環(huán)境介質(zhì)之間存在復(fù)雜的相互作用，各種環(huán)境因素會(huì)不同程度地影響微生物菌株在環(huán)境中的生長(zhǎng)和繁殖。因此，微生物農(nóng)藥環(huán)境增殖標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法的建立需選擇具有代表性的環(huán)境介質(zhì)，并考慮影響微生物菌株生長(zhǎng)繁殖的各種環(huán)境因素。

2.1 環(huán)境介質(zhì)的選擇

我國(guó)幅員遼闊，不同地區(qū)氣候條件、土壤類型、耕作方式等都存在顯著差異，因此，選擇合適的、具有代表性的環(huán)境介質(zhì)對(duì)評(píng)價(jià)微生物農(nóng)藥的環(huán)境增殖能力具有重要意義。

通過(guò)系統(tǒng)研究典型微生物農(nóng)藥在不同類型土壤(東北黑土、陜西黃綿土和褐土、河北棕壤、江西紅壤、江蘇水稻土等)，自然水體(河水、湖水)，植物葉面(蠟質(zhì)、毛質(zhì))中的宿存和消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)最壞場(chǎng)景構(gòu)建為宗旨，結(jié)合我國(guó)主要作物生產(chǎn)區(qū)，提出我國(guó)微生物農(nóng)藥環(huán)境增殖評(píng)價(jià)的代表性環(huán)境介質(zhì)。

針對(duì)土壤介質(zhì)，推薦使用總有機(jī)碳含量較高的黑土作為試驗(yàn)用土，也可以根據(jù)微生物農(nóng)藥的使用范圍選擇擬施用地區(qū)的土壤作為試驗(yàn)用土，土壤的含水量要達(dá)到最大田間持水量的40%～60%。針對(duì)水環(huán)境介質(zhì)，推薦使用配制水作為試驗(yàn)用水，根據(jù)自然水體分析研究結(jié)果提出了試驗(yàn)用水的配方，且配制水在使用前需要通過(guò)高壓蒸汽滅菌處理。針對(duì)植物葉面，綜合考慮植物的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值推薦的試驗(yàn)用植物為棉花，也可以選擇微生物農(nóng)藥登記作物或其他具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值或生態(tài)價(jià)值的植物葉片。

2.2 接種量

研究結(jié)果顯示，在特定環(huán)境介質(zhì)中，不同劑量處理下微生物農(nóng)藥菌株蘇云金芽孢桿菌(Bt)的整體消長(zhǎng)規(guī)律基本類似，說(shuō)明Bt 在土壤中的消長(zhǎng)情況與初始種群數(shù)量關(guān)系較小[3]。因此，以108CFU/mL作為供試物初始接種濃度，若供試物不能達(dá)到108CFU/mL可以根據(jù)推薦使用量計(jì)算菌株接種濃度。

2.3 培養(yǎng)條件

微生物增殖是菌株與外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。環(huán)境中的物理、化學(xué)因素對(duì)微生物形態(tài)、生理、生長(zhǎng)、繁殖等特征均有影響，當(dāng)環(huán)境條件超過(guò)一定極限，甚至?xí)T導(dǎo)微生物的死亡。因此，為盡量降低試驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境因素的影響，要按照微生物菌株最佳生長(zhǎng)條件設(shè)立培養(yǎng)溫度、濕度、氧氣、光照等培養(yǎng)參數(shù)。

2.4 試驗(yàn)周期與取樣

微生物農(nóng)藥環(huán)境增殖試驗(yàn)的試驗(yàn)周期要能夠反映供試物在環(huán)境介質(zhì)中的宿存、繁衍和衰亡情況，或在28 d 內(nèi)持續(xù)檢測(cè)到供試物數(shù)量維持穩(wěn)定或低于初始接種量，可結(jié)束試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)環(huán)境微生物生長(zhǎng)一般規(guī)律設(shè)置取樣量和取樣時(shí)間，通常自接種后開(kāi)始取樣，前4 d 每天取樣，4 d 后每隔1 d取1 次樣，也可根據(jù)受試物的具體生長(zhǎng)情況調(diào)整取樣量和取樣間隔時(shí)間。

2.5 計(jì)數(shù)方法

通過(guò)深入研究抗生素突變體標(biāo)記法、綠色熒光蛋白基因標(biāo)記法、特異性基因熒光檢測(cè)法、基于核酸染色的DAPI 法、基于特異性基因的SCAR 分子標(biāo)記法、基于特異性蛋白ELISA 檢測(cè)法等微生物分子檢測(cè)技術(shù)的適用范圍、靈敏性和穩(wěn)定性，結(jié)合不同類型微生物菌株特征和環(huán)境介質(zhì)類型細(xì)化分類，建立了稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法、綠色熒光蛋白基因標(biāo)記法、特異性基因熒光定量PCR 法、直接計(jì)數(shù)法等多種準(zhǔn)確、可靠的環(huán)境微生物檢測(cè)技術(shù)組合。試驗(yàn)時(shí)可根據(jù)微生物類型和計(jì)數(shù)單位要求選擇合適的方法。細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母以CFU為計(jì)數(shù)單位時(shí)，可采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法、綠色熒光蛋白基因標(biāo)記-平板計(jì)數(shù)法測(cè)定，以基因拷貝數(shù)為計(jì)數(shù)單位時(shí)，可采用分子標(biāo)記-熒光定量PCR法。原生動(dòng)物、真菌孢子、酵母通常以個(gè)體數(shù)為計(jì)數(shù)單位，可采用直接計(jì)數(shù)法測(cè)定。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果繪制供試物的生長(zhǎng)-消亡曲線。

3 微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方法

《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南》(NYT 4197.1—2022～NYT 4197.6—2022)系列標(biāo)準(zhǔn)共6 項(xiàng)，分別為總則和針對(duì)魚(yú)類、溞類、鳥(niǎo)類、蜜蜂和家蠶等保護(hù)目標(biāo)的評(píng)估。該套評(píng)估指南充分比較了國(guó)外微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的程序、方法(表2)，其中家蠶屬于我國(guó)特有經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，除日本有相關(guān)要求外，國(guó)外暫無(wú)微生物農(nóng)藥對(duì)家蠶環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)估采納階段遞進(jìn)評(píng)估程序，以最大危害暴露量評(píng)估-危害效應(yīng)和環(huán)境增殖-高級(jí)生命循環(huán)影響-中宇宙或小規(guī)模野外模擬為評(píng)價(jià)路線，以毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)和增殖能力評(píng)價(jià)為核心，建立了從簡(jiǎn)單、保守到復(fù)雜、現(xiàn)實(shí)的四階段微生物農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序，包括初級(jí)評(píng)估(第一階段和第二階段)、高級(jí)評(píng)估(第三階段和第四階段)(圖1)，實(shí)現(xiàn)科學(xué)、準(zhǔn)確、規(guī)范、可靠和經(jīng)濟(jì)的目標(biāo)。

圖1 微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序

表2 本標(biāo)準(zhǔn)與其他國(guó)家準(zhǔn)則的比較

3.1 問(wèn)題闡述

問(wèn)題闡述包括風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)、數(shù)據(jù)收集和評(píng)估計(jì)劃簡(jiǎn)述等內(nèi)容要求。根據(jù)微生物農(nóng)藥生物學(xué)特征、防治對(duì)象等確定對(duì)保護(hù)生物危害的可能性，當(dāng)根據(jù)現(xiàn)有信息不能排除保護(hù)生物受到微生物農(nóng)藥的暴露危害時(shí)，通過(guò)收集微生物農(nóng)藥生物學(xué)、生態(tài)毒理、環(huán)境繁衍、制劑組成及使用方法等方面的信息開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。針對(duì)用于多種作物或多種防治對(duì)象的微生物農(nóng)藥，要求根據(jù)每種作物或防治對(duì)象的施藥方法、施藥量或頻率、施藥時(shí)間等的不同，對(duì)其使用方法進(jìn)行分組評(píng)估，從而明確何種條件下該微生物農(nóng)藥對(duì)保護(hù)生物的風(fēng)險(xiǎn)可接受。

3.2 第一階段(最大危害暴露量評(píng)估)

微生物侵入生物機(jī)體，并在生物體某一部位定殖、生殖和繁殖，從而引起生物機(jī)體的病理反應(yīng)。這種病理反應(yīng)不僅取決于微生物的致病力和毒力，還與感染生物的遺傳易感性、機(jī)體的免疫狀態(tài)和環(huán)境因素有關(guān)。識(shí)別微生物感染和傳染的發(fā)生是評(píng)估微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的首要關(guān)鍵。第一階段根據(jù)微生物農(nóng)藥環(huán)境生物毒性測(cè)試最大危害暴露試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，以對(duì)50%個(gè)體具有毒性或致病性作為是否開(kāi)展第二階段評(píng)估的依據(jù)。

3.3 第二階段(危害效應(yīng)和環(huán)境繁衍)

如果在第一階段最大危害暴露量評(píng)估顯示對(duì)保護(hù)對(duì)象有不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，則要進(jìn)行第二階段測(cè)試和評(píng)估，包括劑量-效應(yīng)、致死(病)驗(yàn)證和環(huán)境繁衍等測(cè)試，從易感群體、致病性(毒力)和環(huán)境傳播能力進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。在危害效應(yīng)評(píng)估中不僅考慮了暴露和劑量-效應(yīng)的潛伏期、免疫力，還通過(guò)致死(病)性試驗(yàn)測(cè)試了在群體中二次傳播的影響。

3.3.1 環(huán)境繁衍

根據(jù)微生物在土壤、水或植物葉面的存活率及分布，能進(jìn)一步描述微生物的暴露和濃度。由于目前微生物環(huán)境暴露和濃度數(shù)據(jù)十分有限，因此采用土壤、水或植物葉面中檢測(cè)到的微生物數(shù)據(jù)用以評(píng)估環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

3.3.2 初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)表征

⑴如果劑量效應(yīng)模型符合指數(shù)模型或泊松分布模型，風(fēng)險(xiǎn)表征可采用風(fēng)險(xiǎn)商值(RQ)進(jìn)行定量描述：RQ≤1，即環(huán)境暴露濃度低于或等于危害效應(yīng)終點(diǎn)，則風(fēng)險(xiǎn)可接受；RQ＞1，即環(huán)境暴露濃度高于危害效應(yīng)終點(diǎn)，則風(fēng)險(xiǎn)不可接受。⑵如果劑量效應(yīng)模型符合單擊、非閾值模型，風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)準(zhǔn)可采用定性描述：如微生物農(nóng)藥在水體中無(wú)生長(zhǎng)能力，則風(fēng)險(xiǎn)可接受；如微生物農(nóng)藥在水體中有生長(zhǎng)能力，則風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

3.4 第三階段(高級(jí)生命循環(huán)影響評(píng)估)

微生物對(duì)保護(hù)對(duì)象的危害可以分為個(gè)體、種群、群落，同時(shí)根據(jù)傳播途徑不同還存在水平傳播和垂直傳播2 種方式。水平傳播是指在群體之間或個(gè)體之間以水平形式橫向平行傳播，又可以分為直接接觸傳播和間接接觸傳播。直接傳播是指不需要任何外界因素參與，微生物傳染通過(guò)直接接觸(交配、抓咬等)引起易感生物感染的傳播方式，通常形成明顯的傳播鏈但不會(huì)造成大規(guī)模流行。間接傳播是必須在外界因素參與下，如經(jīng)過(guò)污染的水、食物、空氣、土壤或生物傳播。垂直傳播是指從母體到其后代2 代之間的傳播，包括經(jīng)卵傳播、經(jīng)胎盤傳播和經(jīng)產(chǎn)道傳播。高級(jí)生命周期試驗(yàn)的目標(biāo)是研究微生物農(nóng)藥對(duì)保護(hù)對(duì)象個(gè)體或種群的持續(xù)性影響和影響程度。

3.5 第四階段(中宇宙或小規(guī)模野外試驗(yàn))

利用中宇宙系統(tǒng)或小規(guī)模野外試驗(yàn)體系(核心區(qū)和防護(hù)區(qū)總面積不超過(guò)10 hm2，其中核心區(qū)面積不超過(guò)10%，且核心區(qū)與防護(hù)區(qū)呈同心圓分布)，評(píng)估微生物農(nóng)藥正常使用下對(duì)保護(hù)目標(biāo)食物鏈、生態(tài)系統(tǒng)的影響，重點(diǎn)包括危害影響、傳播范圍、影響程度和持續(xù)時(shí)間等。

4 結(jié)論

微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)系列標(biāo)準(zhǔn)的制訂進(jìn)一步完善了我國(guó)生物農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)技術(shù)體系，通過(guò)微生物農(nóng)藥登記前環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，從源頭控制微生物農(nóng)藥對(duì)環(huán)境可能產(chǎn)生的危害。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序、方法和評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，可保證評(píng)估結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和一致性，對(duì)于規(guī)范我國(guó)微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作，使之適應(yīng)新形勢(shì)的要求，從而更好地為我國(guó)的農(nóng)藥登記和農(nóng)藥環(huán)境管理提供技術(shù)支持具有重要意義。