1例ABO疑難血型的鑒定與臨床疑難輸血探討

周 宇,牛長春,廖 璞,陶翠華

1.川北醫學院,四川南充637002;2.重慶市人民醫院檢驗科,重慶401121;3.武漢亞洲心臟病醫院輸血科,湖北武漢430022

輸血是現代醫療中不可缺少的一部分,但輸血之前也存在諸多的問題與挑戰,其中血型鑒定對于臨床輸血至關重要,正確的血型鑒定才能保證臨床用血的安全[1]。由于基因突變、糖基轉移酶數量與活性改變等導致多種正反定型不符的亞型疑難血型出現,導致血清學鑒定難度大,交叉配血困難[2],對檢驗人員的能力和臨床選用合適的血液制品提出了更高的要求。通過標準血清學方法進行ABO血型、不規則抗體篩查、交叉配血試驗、吸收放散試驗和基因測序分型等實驗,可進一步提高ABO血型疑難血型鑒定的準確性,以此提高臨床用血的安全性和有效性。筆者在臨床住院患者日常血清抗篩檢測樣本中發現1例正反定型不符的情況,最終鑒定為AB亞型。雖然該例內科患者并未要求輸血,但考慮亞型病例較為罕見,故通過分析該例患者的鑒定,進一步探討了臨床輸血難點和策略,進而為臨床疑難血型鑒定提供案例參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者,女,70歲,臨床診斷為心絞痛,無輸血史,有妊娠史,于2020年9月3日在武漢亞洲心臟病醫院進行常規血型及不規則抗體篩查,血型檢測發現正反定型不符,正定型B抗原凝集強度減弱,疑似亞型,遂進一步展開深入研究。

1.2試劑與儀器 單克隆抗-A(上海血液生物醫藥有限責任公司,生產批號：20200201,效價1∶256);單克隆抗-B(上海血液生物醫藥有限責任公司,生產批號：20200201,效價1∶128);抗-H(江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司,生產批號：20160707,效價1∶64);抗-A1(江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司,生產批號：20180830,效價1∶128);ABO紅細胞(江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司,生產批號：202008008);3%不規則抗體篩選紅細胞(江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司,生產批號：20200922);KA-2200日本久保田小型臺式專用離心機;Ortho BioVue專用卡式離心機;Ortho vision Max奧森多全自動血型及配血分析儀。

1.3方法

1.3.1血型血清學試驗 采用試管法和微柱凝膠法檢測患者ABO血型、Rh血型及進行不規則抗體篩查和鑒定[3-4],此外還進行行吸收放散試驗。所有試驗方法均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》[5]或者試劑說明書進行操作。

1.3.2洗滌紅細胞的制取 取4支試管,分別加入50 μL的健康人A、O、AB以及本例患者離心后紅細胞,然后加入生理鹽水至試管2/3～3/4處,充分振蕩、混勻、洗滌后放入久保田離心機1 000 r/min離心1 min,然后棄去上清生理鹽水,重復操作3～5次,最后留下的離心后紅細胞即為洗滌紅細胞,用于與抗-A1、抗-H反應。

1.3.3PCR法基因測序分型 全血提取DNA采用PCR法對ABO基因的7個外顯子進行擴增[6-7],對7個外顯子全編碼區進行直接測序[8-9],并檢索血型抗原基因突變數據庫(BGMUT)[10]進行對比。

2 結 果

2.1本例患者ABO血型正反定型結果 試管法顯示正定型有A、B抗原,反定型Bc端有弱反應,見表1。

表1 卡式法與試管法ABO血型正反定型結果

2.2健康人A、O、AB型洗滌紅細胞及本例患者洗滌紅細胞(Pc)分別與抗-A1、-H血清試劑的反應 O型紅細胞表面存在大量前體抗原H。Pc、Ac與抗-A1反應強度相同,與抗-H反應強度則是Pc更高。見表2。

表2 健康人A、AB、O型標準紅細胞及本例患者紅細胞與抗-A1與抗-H抗體反應

2.3不規則抗體篩查結果 患者血清與抗篩細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號細胞反應均呈陰性,排除不規則抗體存在的可能性。見表3。

表3 本例患者血清與篩查細胞反應結果

2.4本例患者吸收放散試驗結果 放散液與標準B型紅細胞反應,與標準O型紅細胞不反應,本例患者紅細胞表面存在弱B抗原。見表4。

表4 患者紅細胞吸收放散試驗結果

2.5基因測序分型結果 本例患者ABO基因第1～7外顯子測序顯示ABO基因的第6、第7個外顯子上存在297 A/G、467 C/T、526 C/G、657 C/T、703 A/G、721 C/T、796 A/C、803 C/G、930 A/G雜合,見表5;第7外顯子存在堿基467C>T;721C>T變異,此突變引起多肽鏈氨基酸P156L;R241W替換,見表6。經檢索BGMUT,此患者2個等位基因分別為A1.02和Bw.03,確認該患者ABO血型的基因型為ABO*A1.02/Bw.03。

表5 患者血型的基因測序結果

表6 單核苷酸及氨基酸替換結果

3 討 論

ABO等位基因位于染色體9q34.1～q34.2,全長19.5 kb,編碼區由7個外顯子組成,長1 062 bp。第6、7號外顯子約占編碼區長度的77%[11],編碼酶的催化活性區同時也是ABO亞型基因突變的主要區域。糖基轉移酶A和B均由354個氨基酸組成,且具有高度的同源性,二者一級結構僅有4個氨基酸殘基的差異。ABO血型系統具有一定的血清學特點,但分子機制各不相同,B亞型較A亞型少見,Bx則更是罕見[12],本研究患者鑒定為ABx亞型,同時血清中檢出不規則的弱抗B抗體。

ABO血型基因多態性決定了ABO血型抗原多態性[13-16],但迄今為止關于ABO基因完全缺失導致O表現型的案例較少報道,也未發現ABO基因堿基連續缺失的現象,提示單核苷酸多態性(SNPs)是形成ABO基因多態性的重要因素。本例患者有2處單個核苷酸的改變導致氨基酸置換,467C>T導致156位氨基酸由脯氨酸替換為亮氨酸;721C>T使241位氨基酸由精氨酸替換為色氨酸,但第156位氨基酸不位于酶的催化活性中心,故而此處雖為氨基酸突變但并不影響糖基轉移酶的活性與生物學功能。但第241位氨基酸則處于糖基轉移酶的催化活性區,此處突變后蛋白質一級結構改變導致構象發生改變,使糖基轉移酶的特異性、活性改變,從而造成ABO血型中B抗原表達數目減少,與抗-B反應凝集強度減弱,形成亞型。

3.1疑難輸血的原則與方案策略 血型的準確鑒定是臨床輸血的根本,即便是亞型的疑難臨床輸血,也需要精確分型,亞型鑒定的意義在于為受血者選擇最合適的血液保障輸血安全與有效。針對上述ABx亞型的臨床輸血,同型供血者是最佳選擇,按現有的血清學特點來看,最理想的血源應該是相同ABx亞型血液,但是在現實情況下較難以實現[17]。由于患者血清中存在弱B抗體,雖然強度不高,但在輸血的時候不可忽略其作用,臨床輸血首先就是要保證輸注的紅細胞不被破壞,故而不能選用B型血和AB型血,由于患者血清中存在抗-B,所以輸注AB型血同樣會出現凝集反應,對于A型血,雖然血清中存在抗-B,但并不會發生強烈的凝集反應,因為B亞型抗原的表達不僅有量變而且還有質變;況且隨著血液的輸入,其中的抗體進入人體循環血液后,也會被稀釋而效價降低,因此,A型血可作為一種輸入血型,在患者有輸血需求指征的時候,可以選用A型洗滌紅細胞進行輸注。O型紅細胞被稱為“萬能輸血型”,在緊急情況下,為挽救生命,避免同種抗體的產生,可以在交叉配血試驗滿足主側不凝集的情況下,少量緩慢輸入O型洗滌紅細胞。總之,絕對安全的輸血是沒有的,亞型的疑難輸血要嚴防血型的漏判、誤判,盡可能制訂準確、有效的輸血策略,才能提高安全輸血水平[18-19]。

3.2基因測序分型對臨床罕見亞型的作用 與本例患者血清學相似的另外一種罕見亞型cisAB也是紅細胞表面存在B抗原弱表達,同時血漿中有1+～3+的抗-B。2種亞型紅細胞表面的A、B、AB抗原的表達強度類似,僅憑血清學格局難以肯定地區分。

檢索BGMUT ABw03與cisAB基因序列,cisAB特有的堿基突變在700C>T,引起第234位氨基酸由脯氨酸替換為絲氨酸(P234S)[1];本例患者ABw03在721C>T發生了特有的點突變,引起241位氨基酸由精氨酸替換為色氨酸(R241W)。二者相比僅存在單個氨基酸的差異,但-A1和-H反應格局有明顯差別。不過肉眼觀察凝集強度存在主觀差別,同時血清學反應也受多種其他因素的干擾,準確度不夠高,還是存在無法完全肯定的情況。ABO亞型無論是抗原的量變還是質變,其血清學試驗外在形式都一樣,都僅表現為凝集強弱的變化,這才導致血清學鑒定困難,因此開展基因檢測分型技術十分有必要[20],可作為血清學鑒定的重要補充,幫助順利解決疑難血型鑒定困難的問題,具有重要的臨床意義。

3.3ABO亞型鑒定基本方法思路 一般情況下進行ABO血型正反定型鑒定時,發現正反定型不一致,通常根據是否正定型抗原凝集強度減弱呈雙群現象(混合視野MF)、紅細胞表面H抗原強度以及是否可以通過吸收放散試驗檢測到弱抗原等進行ABO亞型的鑒定[21]。但在鑒定這種疑難血型時,既有技術問題也有患者血型的問題,故而在遇到血型鑒定正反定型不一致的情況下,除常規試驗外,正定型試驗增加抗-H、抗-A1、抗-AB血清抗體;反定型增加O型標準紅細胞、A1型紅細胞、A2型紅細胞等(反定型對于亞型篩檢尤為重要,正定型弱抗原不發生凝集反應的時候,反定型的弱抗體可有提示性作用,防止漏檢),再進行直接抗人球蛋白試驗、吸收放散試驗、基因測序檢測等最終準確分型[22]。

由于實驗條件有限并未對本例患者進行家系調查和糖基轉移酶活性的測試,缺乏ABO等位基因的遺傳方式及該例ABO復合亞型出現的具體機制等信息。總之,更全面的基因序列測序和更加完整的家系調查有助于豐富ABO血型的基因多態性、ABO亞型形成的關系及其可能的遺傳方式。