HIV低病毒載量患者耐藥檢測的可行性及臨床預后研究

楊壁琿

云南省傳染病醫(yī)院檢驗科,云南昆明 650301

通過有效的抗病毒治療,目前艾滋病遏制已取得了較大的進展,艾滋病病死率下降,盡管取得了這些成效,但低病毒載量對于治療效果仍具有挑戰(zhàn)性。當血漿中病毒載量較低或無法檢測到時,從血漿中獲取病毒進行耐藥檢測成功率會降低,這就需要一種替代方法來進行耐藥檢測。從全血中提取前病毒DNA可以進行耐藥檢測,并且可以為抗病毒治療提供耐藥檢測信息[1]。但國外有些研究表明抗病毒治療啟動后前病毒DNA基因型耐藥性檢測(DNA GRT)與治療前血漿中HIV RNA基因型耐藥性檢測(RNA GRT)結果相比,DNA GRT并不能識別所有的耐藥突變位點[2-3],而有研究則發(fā)現(xiàn)二者之間存在良好的一致性[4-5],但我國相關研究報道較少。故本研究探討了低病毒載量樣本RNA GRT和DNA GRT擴增率及2種方法檢測結果的一致性,并分析了低病毒載量耐藥對治療的影響,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1月至2021年12月云南省傳染病醫(yī)院HIV低病毒載量(HIV RNA在200～1 000 copy/mL)樣本212份,包括血漿和全血,其中昆明市105份、曲靖市57份、紅河哈尼族彝族自治州50份;男120例(57%),女92(43%)例;平均年齡(43.0±13.2)歲;病毒載量200～500 copy/mL樣本113份,>500～1 000 copy/mL樣本99份。本研究中涉及4種類型的低病毒載量情況：(1)基線低病毒載量;(2)抗病毒治療失敗后的低病毒載量,即抗病毒治療時間>6個月,且抗病毒治療失敗(HIV RNA>1 000 copy/mL),每次病毒載量檢測間隔時間>6個月,目前處于低病毒載量;(3)持續(xù)性低病毒載量,即抗病毒治療時間>6個月,每次病毒載量檢測間隔時間>6個月,至少連續(xù)2次出現(xiàn)低病毒載量;(4)一過性低病毒載量,即在達到病毒學抑制(HIV RNA<50 copy/mL)后單獨出現(xiàn)過一次低病毒載量,之后再次呈現(xiàn)病毒學抑制。

1.2方法

1.2.1RNA GRT 212份低病毒載量標本全部進行RNA GRT。采用德國Qiagen公司QIAamp Viral RNAMini Kit試劑盒從血漿中抽提HIV RNA,進行HIV RNA核酸提取和基因擴增。把1 mL血漿進行超速離心(23 000 r/min)60 min,棄去多余的上清液后進行核酸提取。提取的RNA通過in-house耐藥檢測方法進行巢式聚合酶鏈反應擴增蛋白酶區(qū)和反轉錄酶區(qū)基因序列,擴增產(chǎn)物遞交云南科耀生物公司進行Sanger測序。

1.2.2DNA GRT 從昆明市挑選40份全血樣本進行DNA GRT。使用海力特核酸提取試劑從全血中提取HIV cDNA,進行全血HIV cDNA核酸提取和基因擴增。通過in-house耐藥檢測方法,進行巢式聚合酶鏈反應擴增蛋白酶區(qū)和反轉錄酶區(qū)基因序列,委托海力特公司完成Sanger測序得到蛋白酶區(qū)和發(fā)轉錄酶區(qū)基因序列。

1.2.3序列分析及應用 整理序列提交美國斯坦福大學HIV耐藥數(shù)據(jù)庫獲得耐藥位點和耐藥程度分析結果。耐藥程度分為敏感(S)、潛在耐藥(P)、低度耐藥(L)、中度耐藥(I)、高度耐藥(H),敏感和潛在耐藥判定為敏感毒株,低度耐藥、中度耐藥和高度耐藥判定為耐藥毒株。

1.3觀察指標 (1)低病毒載量樣本的擴增效果;(2)評價RNA GRT和DNA GRT 2種方法檢測結果的一致性;(3)低病毒載量的耐藥情況;(4)低病毒載量對臨床治療效果的影響。

1.3統(tǒng)計學處理 采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)收集和整理。

2 結 果

2.1低病毒載量樣本的擴增效果

2.1.1RNA GRT 212份樣本中擴增成功107份,擴增率為59.22%。其中昆明市未經(jīng)反復凍融樣本105份,擴增成功67份,擴增率為63.81%,曲靖市、紅河哈尼族彝族自治州反復凍融樣本107份,擴增成功40份,擴增率為37.38%。病毒載量在200～500 copy/mL的標本擴增率為44.25%(50/113),>500～1 000 copy/mL的標本擴增率為57.58%(57/99)。

2.1.2DNA GRT 檢測的40份標本中,擴增成功24例,擴增率為60.0%。

2.1.3RNA GRT聯(lián)合DNA GRT 40份樣本中RNA GRT聯(lián)合DNA GRT總擴增率為90.0%(36/40),其中2種方法共同擴增成功21份。

2.2低病毒載量的耐藥情況分析 107份RNA GRT擴增成功的樣本中,有32份是經(jīng)過抗病毒治療失敗后的低病毒載量,有30份是持續(xù)性低病毒載量,有29份是一過性低病毒載量,有16份是基線低病毒載量。30份持續(xù)性低病毒載量樣本中,有2份樣本為同一患者不同時間點檢測結果,經(jīng)過8個月該患者耐藥位點增加2個(K219Q、P225H)且耐藥程度加深。持續(xù)性和一過性低病毒載量患者初始治療方案基于齊多夫定(AZT)/替諾福韋(TDF)+拉米夫定(3TC)+依非韋倫(EFV)/奈韋拉平(NVP)有55例,基于AZT+3TC+LPV/洛匹那韋/利托那韋(r)有2例,基于艾維雷韋/考比司他(EVG/c)/恩曲他濱(FTC)/丙酚替諾福韋(TAF)有1例。持續(xù)性低病毒載量耐藥發(fā)生率為48.28%(14/29),一過性低病毒載量耐藥發(fā)生率為41.38%(12/29)。持續(xù)性和一過性低病毒載量患者核苷類反轉錄酶抑制劑(NRTIs)耐藥突變位點主要為M184V,非核苷類反轉錄酶抑制劑(NNRTIs)耐藥突變位點主要為E138Q/A,這兩類低病毒載量患者各有1例檢出蛋白酶體抑制劑(PI)耐藥突變位點。持續(xù)性和一過性低病毒載量患者對AZT、3TC、TDF的耐藥率均為6.89%、27.59%、6.89%,對EFV、NVP的耐藥率均為27.59%、31.03%,對LPV/r的耐藥率均為3.45%。16例基線低病毒載量患者中有1例檢出NRTIs耐藥突變位點M41L,引起AZT低度耐藥,耐藥率為6.25%。見表1。

表1 低病毒載量耐藥突變位點情況

2.3共同擴增標本的2種方法耐藥突變位點檢測結果比較 2種方法共同擴增成功的21份樣本中,10份樣本(47.62%)使用2種方法檢出的耐藥結果完全一致。RNA GRT共檢出40個主要耐藥突變位點,DNA GRT共檢出17個主要耐藥突變位點;有8份樣本在RNA GRT中是檢出耐藥突變位點而在DNA GRT中是耐藥位點缺失;有1份樣本在DNA GRT中是檢出耐藥突變位點而在RNA GRT中是耐藥位點缺失;有2份樣本在RNA GRT中檢出耐藥突變位點但在DNA GRT中出現(xiàn)混合堿基引起不一致。PI耐藥突變位點的不一致率為9.52%(2/21),NRTIs和NNRTIs耐藥突變位點的不一致率均為42.86%(9/21)。見表2。

表2 2種方法檢測不一致耐藥突變位點情況

2.4低病毒載量對臨床治療效果的影響 29份持續(xù)性低病毒載量樣本中,在12個月隨訪中有14份(48.27%)病毒載量<50 copy/mL,有13份(44.83%)病毒載量在>50～1 000copy/mL,有2份(6.90%)病毒載量>1 000 copy/mL。16份基線低病毒載量樣本中,在12個月隨訪中有1份(6.25%)出現(xiàn)病毒載量>1 000 copy/mL,其余病毒載量均<50 copy/mL。

3 討 論

無論是在全球范圍還是在中國國內(nèi),HIV耐藥檢測都需引起高度重視,通過耐藥結果可監(jiān)測整個抗病毒治療過程的有效性[6-8]。在發(fā)達國家,一旦患者HIV RNA病毒載量>50 copy /mL,立即給予干預如加強隨訪,耐藥檢測,藥代動力學評估,甚至更換治療藥物。在我國由于醫(yī)療資源有限,只針對患者抗病毒治療1年以上且病毒載量>1 000 copy/mL時進行耐藥基因型檢測,根據(jù)檢測結果更換藥物。當病毒載量≤1 000 copy /mL時,往往血漿RNA GRT擴增成功率不高,只有60%左右[9],加上目前指南尚無明確指導性方案及處理原則,因此導致治療后病毒載量在>50～1 000 copy/mL的患者臨床管理處于“灰色地帶”,同時低病毒載量是目前實驗室耐藥監(jiān)測中的盲區(qū)。在抗病毒治療期間由于藥物選擇性壓力產(chǎn)生的耐藥毒株可能潛伏在病毒庫中,那么當血漿中病毒載量較低或無法檢測到時,血細胞中的前病毒DNA GRT可能有助于指導更換藥物[10]。

本研究發(fā)現(xiàn),低病毒載量未經(jīng)反復凍融樣本及時檢測可提高血漿RNA GRT擴增率,且病毒載量越高擴增成功率越高。RNA GRT聯(lián)合DNA GRT總擴增率可以達到90.0%。對于低病毒載量樣本,全血中前病毒DNA GRT與血漿中RNA GRT結果之間存在一定的相關性,相對于RNA GRT,DNA GRT會有一定程度的耐藥信息丟失。在本研究中只有基線低病毒載量樣本2種方法檢測結果呈現(xiàn)出高度的一致性,這與之前的一些研究結果相似[11-12],有研究報道只有在沒有發(fā)生抗病毒治療失敗的情況下二者檢測結果才具有高度的一致性[13]。DNA GRT可能無法檢測到所有隨時間發(fā)生變化的耐藥突變位點[14]。本研究中DNA GRT檢測出耐藥位點而RNA GRT未檢測出,可能是耐藥位點的積累經(jīng)歷了這4個階段：(1)HIV DAN堿基出現(xiàn)優(yōu)勢耐藥突變位點;(2)HIV DNA的優(yōu)勢耐藥突變位點被復制擴增,開始出現(xiàn)耐藥病毒;(3)隨著優(yōu)勢耐藥突變位點的積累及耐藥病毒復制,可能出現(xiàn)低病毒血癥;(4)耐藥病毒快速增加,臨床表現(xiàn)為病毒反彈或治療失敗[15]。盡管RNA GRT可能更直接地反映患者體內(nèi)耐藥情況,但HIV前病毒DNA也能在一定程度上反映患者耐藥情況,并能將耐藥出現(xiàn)的時間點提前。RNA GRT檢測出耐藥位點而DNA GRT未檢測出的原因可能為HIV病毒耐藥基因PCR模板來源于全血中的HIV前病毒DNA,所采用的Sanger測序策略通過優(yōu)先測序總序列中豐度占比最高的優(yōu)勢DNA序列,這些優(yōu)勢序列的占比理論上要超過總序列數(shù)的40%,更加傾向于檢測優(yōu)勢耐藥毒株。HIV DAN水平的耐藥突變信息,代表HIV感染者外周血HIV儲存庫中的優(yōu)勢耐藥毒株,在DNA突變位點未成為優(yōu)勢耐藥突變位點時仍可轉錄出突變的病毒,這是Sanger測序的局限性。在接下來的研究中有必要使用深度測序技術,以便盡早發(fā)現(xiàn)HIV感染者出現(xiàn)病毒學失敗,為臨床抗病毒治療方案的制訂和調(diào)整提供有效的參考意見。

本研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)性低病毒載量患者耐藥發(fā)生率為48.28%,主要突變位點是NRTIs M184V和NNRTIs E138Q/A,PI耐藥突變位點較少,只檢出1例,可能與研究對象中二線藥物使用率低有關。本研究中有1例持續(xù)性低病毒載量患者在8個月內(nèi)出現(xiàn)新增耐藥位點且藥物耐藥程度加深。在持續(xù)性低病毒載量患者中,在12個月隨訪中有48.28%病毒載量<50 copy/mL,44.83%病毒載量>50～1 000 copy/mL,病毒載量>1 000 copy/mL只有6.9%,這時仍有可能及時抑制病毒,重新獲得較好的治療效果。因此在低病毒載量檢出耐藥結果后,盡快采取干預措施,降低后期病毒學失敗風險。有研究報道持續(xù)性低病毒載量耐藥位點的積累可能會增加后續(xù)治療病毒學失敗風險[16],基線低病毒載量患者與基線沒有發(fā)生低病毒載量患者相比,后期發(fā)生病毒學失敗的風險高36倍[17]。單次出現(xiàn)病毒載量>400 copy/mL患者病毒學失敗風險增加[18-19]。因此還應當關注基線低病毒載量和單次出現(xiàn)低病毒載量患者。

綜上所述,低病毒載量進行耐藥基因型檢測是可行的,RNA GRT和DNA GRT 2種檢測方法結果存在一定的相關性。美國治療指南建議,當病毒載量在20～1 000 copy/mL時使用前病毒DNA GRT進行檢測,但在解釋結果時需謹慎[20]。總之,應盡早識別耐藥突變位點,更換治療方案,預防后期治療失敗。