結核分枝桿菌游離DNA檢測在肺外結核診斷中的價值

陳小娟,向 尹,陳俊良,陳麗龍,稅 玉

四川省樂山市人民醫院醫學檢驗科,四川樂山 614000

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的一種疾病,是全球重大公共衛生問題之一,對人類健康造成嚴重危害。結核病的防控關鍵在于對患者的早期診斷和及時治療。然而,現有的臨床實驗室病原體檢測方法靈敏度較低,使得大量低菌負荷的結核病患者因缺乏病原學證據,臨床診斷極為困難。2022年全球結核病報告顯示,2021年仍有420萬例患者未被診斷,這對全球結核病的防控計劃構成了巨大的挑戰[1]。在難診結核病中,肺外結核的診斷尤為困難。肺外結核是由MTB感染肺部以外其他部位導致的一種結核病,約占據全部結核病的20%[2]。由于肺外結核的病變部位分布廣泛,臨床癥狀不具有典型特征,杯本難以獲得且含菌量低,其診斷一直是臨床的難點。因此,尋求一種快速、準確的肺外結核病診斷方法具有重要意義。

細胞游離DNA(cfDNA)是在細胞死亡或病理狀態下,由原始細胞釋放的細胞外DNA片段,在各種體液中以游離狀態存在[3]。cfDNA于1948年被發現,可以在人類血漿、腦脊液、胸腔積液、尿液、前列腺液、唾液和其他體液中檢測到[4]。近年來,cfDNA的檢測在無創產前診斷、腫瘤的診斷分期和治療監測中已得到廣泛應用并成為研究熱點[5-7]。有研究發現,當人體感染細菌、寄生蟲等病原體時,可在體液中檢測出相應的cfDNA片段,并且其含量與感染性疾病的發生、發展相關[8-9],提示cfDNA 檢測在感染性疾病的診斷和治療方面具有潛在的應用價值。在結核病診斷和治療方面,cfDNA作為一種新興的生物標志物近年來也得到了廣泛關注。MTB cfDNA可以通過聚合酶鏈反應(PCR)在人類血漿、胸腔積液、腦脊液等體液中檢測,可能成為診斷低桿菌量結核病的有效方法[10]。有研究指出,胸腔積液中MTB cfDNA檢測對結核性胸膜炎具有較高的診斷價值[11]。近年來也有在腦脊液、腹水、尿液等體液中檢測MTB cfDNA的相關研究,證明其在結核性腦膜炎、腹部結核及泌尿系統結核等肺外結核中具有一定的診斷價值[12-14]。cfDNA作為一種新興的檢測和監測肺結核及肺外結核的生物標志物,其研究尚處于起步階段,現有的研究對肺結核和肺外結核患者的血液、胸腔積液、腦脊液和尿液等標本進行cfDNA檢測的靈敏度和特異度差異較大且標本量較小,故其在結核病診斷中的應用價值仍然存在爭議[15]。因此,本研究擬通過對臨床疑似肺外結核患者的相關體液標本進行MTB cfDNA檢測,評估其在肺外結核診斷中的臨床應用價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年7月至2022年12月本院收治的臨床高度疑似肺外結核患者為研究對象,排除臨床資料不全者、僅診斷為肺結核及臨床診斷不確定者,最終納入266例患者,其中男159例、女107例,年齡42～70歲、中位年齡56.50歲。根據結核病復合診斷標準(CRS),按照臨床最終診斷結果分為肺外結核組117例和非結核組149例。MTB檢測標本來自患者的肺外結核相關體液標本,其中腦脊液49例、胸腔積液142例、尿液54例、血漿21例。肺外結核納入標準：參考我國肺結核診斷標準(WS288-2017)和結核病分類標準(WS196-2017),綜合考慮患者的病史、臨床癥狀、體征,肺外結核診斷標準至少符合以下幾項之一：(1)腦脊液、漿膜腔積液、尿液等相關臨床標本MTB病原學檢測陽性;(2)影像學檢查有肺外結核相關證據;(3)符合肺外結核組織病理改變;(4)合并有肺結核;(5)2次以上血液標本結核感染T細胞γ干擾素釋放試驗(TB-IGRA)陽性且抗結核治療有效。排除標準：(1)臨床資料不全者;(2)已確診肺結核并排除肺外結核者;(3)臨床診斷不確定者。所有研究對象均知曉本研究,且本研究經本院醫學倫理委員會審批通過[審批號：2021(117)號]。

1.2儀器與試劑 實時熒光定量PCR儀(ABI QuantStudio5)、全自動核酸純化儀及其配套試劑(廈門愷碩生物科技有限公司)、MTB DNA檢測試劑盒(廣州達安基因有限公司)、結核分枝桿菌及利福平耐藥快速檢測(GeneXpert MTB/RIF)儀器及配套試劑(美國Cepheid公司)、MTB抗酸染色染液(珠海貝索生物有限公司)、TB-IGRA檢測試劑(北京萬泰生物藥業股份有限公司)。

1.3方法 收集患者肺外結核相關體液標本,所有標本均進行涂片抗酸染色、MTB cfDNA檢測、GeneXpert MTB/RIF。同時,所有患者均抽取靜脈血進行TB-IGRA試驗。以臨床最終診斷結果為金標準,對4種檢測方法的檢出率、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值等效能指標進行統計分析。

1.3.1MTB涂片抗酸染色 分別取腦脊液、胸腔積液、尿液及血漿標本1 mL,3 000 r/min離心10 min,去除上清液后,取底部沉淀物或留存液體涂片抗酸染色,于顯微鏡下觀察計數,陽性判定規則為每100個油鏡視野查見抗酸桿菌3條及以上。

1.3.2MTB cfDNA檢測

1.3.2.1MTB cfDNA提取 腦脊液及血漿標本2～5 mL,4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min,留取上清液用于cfDNA提取。胸腔積液及尿液標本10～15 mL,4 ℃條件下3 000 r/min 離心10 min,取上清液5 mL再次離心10 min,留取上清液用于cfDNA提取。取已離心處理的上清液標本800 μL按照核酸提取試劑盒[愷碩生物科技(廈門)股份有限公司,RC1016]說明書操作進行cfDNA提取。為提高核酸濃度,最后洗脫體積設定為50 μL。

1.3.2.2MTB cfDNA擴增 使用MTB實時熒光定量PCR試劑盒進行MTB cfDNA擴增檢測,該試劑盒檢測靶基因為MTB特異性插入序列IS6110。按照每測試27.0 μL MTB PCR反應液A,3.0 μL MTB PCR反應液B(Taq酶和尿嘧啶糖基化酶混合液),提取好的MTB cfDNA及陰陽對照分別取20.0 μL構建PCR反應體系。在實時熒光定量PCR儀中擴增,擴增程序如下：50 ℃ 2 min;95 ℃ 15 min;94 ℃ 15 s、55 ℃ 45 s,40個循環。反應體系為50.0 μL。按照試劑盒說明書進行擴增結果判定。

1.3.3GeneXpert MTB/RIF 檢測 在生物安全柜內按照標準操作程序進行標本前處理。相對清亮的腦脊液、尿液及血漿可不用前處理直接檢測。胸腔積液若較濃稠或者有凝塊則按說明書進行充分液化處理。取處理后的各類型標本2.0～2.5 mL于GeneXpert Dx檢測系統進行檢測。檢測時間約2 h。

1.3.4TB-IGRA檢測 采集患者肝素抗凝血4 mL,于2 h內取1 mL分裝到N、T、P培養基中,放入37 ℃培養箱培養(22±2)h,將培養管于3 000～5 000 r/min離心10 min,取血漿按照MTB特異性細胞免疫反應檢測試劑盒說明檢測干擾素-γ水平。

2 結 果

2.1MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF和涂片抗酸染色對肺外結核患者不同類型標本中MTB的檢出率比較 非結核組各類型標本均未檢出MTB陽性病例。根據臨床最終診斷,肺外結核組包括結核性腦膜炎20例、結核性胸膜炎57例、泌尿系統結核31例、其他部位結核9例(淋巴結核3例、脊柱結核5例、腸結核1例)。MTB cfDNA檢測法對腦脊液中MTB的檢出率為25.00%,對胸腔積液的檢出率為22.81%,對尿液的檢出率為38.71%,對血漿檢出率為11.11%。MTB cfDNA檢測法對腦脊液、胸腔積液、尿液中的MTB檢出率均顯著高于涂片抗酸染色(χ2=5.714、9.289、9.226,P=0.017、0.002、0.002)。雖然MTB cfDNA檢測法對腦脊液、尿液中MTB的檢出率高于GeneXpert MTB/RIF,但差異無統計學意義(χ2=0.143、0.648,P=0.705、0.421);MTB cfDNA檢測法對胸腔積液中MTB的檢出率顯著高于GeneXpert MTB/RIF(χ2=4.222,P=0.040)。見表1。

表1 MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF和涂片抗酸染色對肺外結核患者不同類型標本中MTB的檢測結果比較[n(%)]

2.2MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色、TB-IGRA在兩組患者中的MTB檢出率比較 在肺外結核組,MTB cfDNA檢測法對MTB的檢出率為26.50%(31/117),明顯高于GeneXpert MTB/RIF[15.38%(18/117)]和涂片抗酸染色[3.42%(4/117)],差異均有統計學意義(χ2=4.362,P=0.037;χ2=24.492,P<0.001);而TB-IGRA對MTB的檢出率為72.65%(85/117),明顯高于MTB cfDNA檢測法(χ2=49.850,P<0.001)。在非結核組,MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色對肺外結核相關體液標本進行的MTB病原學檢測均未檢出陽性病例,但TB-IGRA 檢出陽性47例。見表2。

表2 MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色、TB-IGRA在兩組患者中的MTB檢測結果比較[n(%)]

2.3MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色、TB-IGRA對肺外結核的診斷效能 MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色、TB-IGRA診斷肺外結核的靈敏度分別為26.50%、15.38%、3.42%、72.65%,特異度分別為100.00%、100.00%、100.00%、68.46%,陽性預測值分別為100.00%、100.00%、100.00%、64.39%,陰性預測值分別為63.40%、60.08%、56.87%、76.12%。MTB cfDNA檢測法的靈敏度明顯高于GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色,差異均有統計學意義(χ2=4.362、24.492,P<0.05);TB-IGRA的靈敏度顯著高于MTB cfDNA檢測法,但其特異度顯著低于MTB cfDNA檢測法,差異均有統計學意義(χ2=49.850、55.801,P<0.05)。見表3。

表3 MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色、TB-IGRA檢測對肺外結核的診斷效能[% (n/n)]

3 討 論

肺外結核由MTB侵犯肺部以外的組織器官引起,常見類型有結核性胸膜炎、結核性腦膜炎、結核性腹膜炎、泌尿系統結核、淋巴結核、腸結核、腹部結核等[16]。MTB在正常代謝、凋亡或被破壞后可釋放其特異cfDNA片段IS6110并可通過PCR檢測[17]。有研究發現,肺外結核患者相關部位非痰液標本中MTB特異性cfDNA的靈敏度和特異度可能高于診斷肺外結核的痰液標本[15]。本研究收集了肺外結核患者相應部位的非呼吸道體液標本(腦脊液、胸腔積液、尿液、血漿)進行MTB cfDNA檢測,檢測靶基因為IS6110,通過比較其與GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色以及TB-IGRA檢測的靈敏度、特異度等效能指標,初步探討MTB cfDNA檢測在肺外結核診斷中的應用價值。

本研究以CRS為參考標準,以臨床最終診斷結果為金標準,MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF、涂片抗酸染色、TB-IGRA診斷肺外結核的靈敏度分別為26.50%、15.38%、3.42%、72.65%,特異度分別為100.00%、100.00%、100.00%、68.46%,陽性預測值分別為100.00%、100.00%、100.00%、64.39%,陰性預測值分別為63.40%、60.08%、56.87%、76.12%。MTB cfDNA檢測法的靈敏度明顯高于GeneXpert MTB/RIF與涂片抗酸染色檢測,而明顯低于TB-IGRA檢測,差異均有統計學意義(P<0.05)。GeneXpert MTB/RIF為世界衛生組織推薦的診斷肺結核及肺外結核的分子快速檢測方法,近年來已在臨床廣泛應用。但GeneXpert MTB/RIF對于低菌量標本的檢出率低,且對于不同類型標本靈敏度差異較大,有研究報道其在胸腔積液中MTB檢出率最低[18]。對于肺外結核相關標本,由于其不易獲得大量標本且含菌量低,涂片抗酸染色的檢出率極低。本研究在肺外結核組患者相關部位的非痰液標本檢測中,MTB cfDNA檢測法對MTB的檢出率為26.50%,明顯優于GeneXpert MTB/RIF及涂片抗酸染色,提示MTB cfDNA檢測在肺外結核的診斷中具有較好的應用前景。TB-IGRA是通過檢測人體免疫系統對MTB感染的免疫反應來判斷結核感染存在與否。患者的免疫狀態、疾病狀態、性別和年齡等因素均可能影響到TB-IGRA的結果,其特異度較MTB的病原學檢測低[19-20]。在使用TB-IGRA進行結核病診斷時,需要綜合考慮臨床癥狀、病史以及其他檢測結果,故其對結核病診斷存在一定的局限性。本研究中TB-IGRA靈敏度明顯高于MTB cfDNA檢測法、GeneXpert MTB/RIF及涂片抗酸染色,但是其特異度僅為64.39%,而其他3種病原學檢測方法的特異度均為100.00%,提示對肺外結核的診斷與病原學檢測方法聯合使用可獲得較好的診斷效能。

筆者進一步分析了使用不同類型標本的MTB cfDNA檢測在肺外結核中的診斷效能,結果顯示MTB cfDNA檢測法對尿液中MTB的檢出率最高,對腦脊液和胸腔積液中MTB的檢出率次之。與GeneXpert MTB/RIF相比,MTB cfDNA檢測法對各類型標本中MTB的檢出率均升高,但兩種檢測方法僅對胸腔積液中MTB檢出率的差異有統計學意義(P<0.05),提示其對結核性胸膜炎的診斷與其他分子檢測方法相比更具優勢,這也與多項研究結果相符[11,15]。在對患者血漿標本的檢測中,MTB cfDNA檢測法檢出1例陽性,而GeneXpert MTB/RIF與涂片抗酸染色均未檢出,提示cfDNA血漿檢測具有作為早期診斷肺外結核病工具的潛力,但本研究中血漿標本量較小,且來自不同類型的肺外結核患者,其在肺外結核的診斷效能需要進一步研究證實。

綜上所述,MTB cfDNA作為新型分子標志物在肺外結核診斷中具有較好的應用前景,有望為少菌型結核病患者尤其是病原學證據獲得困難的結核患者的早期診斷提供強有力的證據。