利拉魯肽對2型糖尿病性骨質疏松大鼠骨鈣素、Hedgehog信號通路及CaBp-D9k基因表達的作用機制

侯保健 嚴兆丹 張令暉 蔡莉

(湖北省第三人民醫院,湖北 武漢 430030)

糖尿病性骨質疏松(DOP)是由糖尿病(DM)引發的繼發性骨質疏松(OP),是目前臨床中常見的2型糖尿病(T2DM)并發癥,具有骨組織結構損壞、骨韌性降低等多種病理特性,可造成患者骨質量發生進行性病變,進而影響生活質量和健康安全〔1〕。相關研究表示〔2〕,DOP發生時患者產生骨折及骨損傷的概率增加。現階段,對于DOP的治療臨床常通過提高調控血糖及改善骨密度等方式進行干預,雖可在一定程度上改善患者的臨床癥狀,但由于治療時間較長,極易使機體產生其他不良反應,進而對致病環境和體質改善產生不利影響。有學者發現〔3〕,在DM中胰島β細胞功能異常對疾病進程中具有關鍵意義。利拉魯肽不僅對能顯著提高胰島素的合成/分泌,且有研究證實其對DOP大鼠具有一定的治療效果〔4〕。經研究〔5〕,在OP中人類胚胎發育調控因子(Hedgehog)信號通路可產生一定的調控作用,且作為參與骨形成/骨分化的關鍵因子,由Hedgehog信號蛋白、Ptc/Smo受體及相關下游因子等組成,且激活Hedgehog信號通路可促進成骨細胞增加〔6〕。在DOP中成骨細胞合成的骨鈣素(BGP)、骨基質、骨轉換等因素的降低均大大提高了DOP的風險〔7〕。經研究〔8〕,機體內的營養因子及鈣元素的調節障礙也是誘發OP的關鍵因素,而腸道鈣吸收以鈣調節蛋白(CaBp-D9K)調和為主,CaBp-D9K的活性失衡對OP的產生具有重要影響,因此改善機體營養吸收業是治療 DOP的關鍵途徑。但目前尚未有關利拉魯肽對Hedgehog信號通路及CaBp-D9k具體作用的相關報道,本實驗研究利拉魯肽對DOP大鼠骨鈣素、Hedgehog信號通路及CaBp-D9k基因表達的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 60只SPF級SD大鼠購自長沙市天勤生物公司(許可證號:SCXK(湘)2020-0214),體質量200～300 g,大鼠常規飼養,自由飲食飲水,適應1 w后進行實驗。本實驗已通過醫院醫學倫理委員會審批(批號:Y2020-002-10)。

1.2實驗試劑 全自動化學分析儀(濟南鑫貝西生物技術有限公司,型號:BK-1200),胰島素試劑盒(浙江愛康生物科技有限公司,貨號:C00601),蘇木素-伊紅(HE)染色液(上海西格生物科技有限公司,貨號XG-X6822),PCR儀(西安天隆科技有限公司,型號:Gentier 96R),TUNEL試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司,貨號:AT005-2),音猬因子(Shh)、細胞表面受體(Ptch)1、鋅指蛋白(Gli)1一抗(上海彩佑實業有限公司,貨號:1206R),辣根過氧化物酶二抗(南京都萊生物技術有限公司,型號:E0040)。

1.3模型建立及干預 取60只SD大鼠隨機分為健康組、DM組、DM+利拉魯肽組、去勢組、DM+去勢組、DM+去勢+利拉魯肽組,每組10只。去勢模型:大鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉固定后剃除毛發并消毒,在背部中央縱向切口3 cm,牽拉皮膚切口至一側,正線邊2 cm,髂嵴上1.5 cm位置將肌肉進行剝離,入切口找尋一側卵巢將輸卵管結扎并切除卵巢,依照此方法將另一側卵巢相同處理,縫合皮膚后對切口進行消炎處理。DM模建立需腹腔注射60 mg/kg STZ(溶于檸檬酸緩沖液中),待72 h后測定模型空腹血糖,>16.7 mmol/L為建模成功。DM+去勢組、DM+去勢+利拉魯肽組在DM模型建立成功后建立去勢模型。健康組、DM組、去勢組、DM+去勢組常規培養;DM+利拉魯肽組、DM+去勢+利拉魯肽組于造模1 w后進行給藥,在皮下注射0.6 mg/kg利拉魯肽,1次/d,均干預8 w。

1.4檢測各組血糖及胰島素水平 給藥結束后,取各組大鼠下腔靜脈血2 ml,離心 15 min (轉速3 000 r/min),采集上層血清,將血清置于全自動化學分析儀檢測空腹血糖值,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測胰島素水平。

1.5HE染色觀察病理形態 給藥結束后,腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后處死,收集股骨組織,將其在甲醛溶液中固定后,置于10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)溶液中脫鈣30 d。脫水-透蠟-包埋,5 μm切片,烘干-脫蠟至水-蘇木素染色,1%鹽酸乙醇處理5 s,洗滌,伊紅染色,梯度乙醇3 min,無水乙醇5 min,二甲苯5 min,擦干后,中性樹膠封片,晾干,顯微鏡下觀察并拍照。

1.6逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測BGP、CaBp-D9k mRNA水平 取各組大鼠股骨組織,剪碎、研磨、離心后,Trizol法提取培養細胞總RNA,檢測RNA濃度,計算OD值,依據試劑盒,將RNA逆轉錄合成cDNA。通過PrimerPremier5.0軟件設計,以β-actin為內參。PCR體系為20 μl,60 ℃預熱3 min,90 ℃預變性5 min,98 ℃變性60 s,70 ℃延伸30 s,40個循環。數據以2-ΔΔCt法計算相對表達量,引物序列:BGP上游引物:5′-TCATGTCCAAGCAGGAGGGCAGTAA-3′,下游:5′-TTGTAGGCGTCCTGGAAGCCAATGT-3′;CaBp-D9k上游引物:5′-GATAAGAACGGTGATGGAGAAGT-3′,下游:5′-TCAATCAGTAGGTGGTGTCGG-3′;β-actin上游引物:5′-AGGGGTCCTCTGTGAACTTG-3′,下游:5′-CAGCAGTCTCATTCCAAGCC-3′。

1.7TUNEL檢測成骨細胞凋亡 取各組股骨組織石蠟標本,切片固定,漂洗并用0.1 % Triton X-100浸潤,然后使用TUNEL分析試劑盒對凋亡的DNA片段進行異硫氰酸熒光素(FITC)末端標記。熒光顯微鏡觀察FITC標記的TUNEL陽性細胞并拍照。 根據骨組織細胞凋亡指數 (AI)的計算公式,AI=陽性細胞數/(陽性細胞數+陰性細胞數)× 100%。

1.8Western印跡檢測Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達 將各組股骨組織進行裂解并提取核蛋白,并對核蛋白的濃度進行測量。每孔上樣蛋白量20 μg,將蛋白溶液與緩沖溶液(4∶1)混勻后煮沸,變性,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉印緩沖液配制好后放入4 ℃冰箱內預冷,然后將50 μg蛋白轉移聚偏氟乙烯膜上,脫脂奶粉封閉1 h。加入Shh、Ptch1、Gli1一抗(1∶150)孵育過夜,磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次,10 min/次,最后加入辣根過氧化物酶二抗(1∶1 000),常溫封閉1.5 h。取出聚偏氟乙烯膜,上述方法漂洗。用電化學發光(ECL)試劑曝光顯影3 min,用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以GAPDH為內參。計算目的蛋白與內參條帶灰度值的比值,即為Shh、Ptch1、Gli1蛋白的相對表達量。

1.9統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行方差分析,兩組間對比采用t檢驗。

2 結 果

2.1各組空腹血糖值及胰島素水平 與健康組相比,DM組、去勢組、DM+去勢組空腹血糖值明顯升高,胰島素水平明顯降低(P<0.05),經過利拉魯肽干預后,與DM組、去勢組及DM+去勢組相比,DM+利拉魯肽組、DM+去勢+利拉魯肽組空腹血糖值顯著降低,胰島素水平顯著升高(P<0.05),DM組、去勢組及DM+去勢組空腹血糖、胰島素水平兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組空腹血糖值及胰島素水平對比

2.2HE染色觀察病理形態 與健康組相比,DM組和去勢組中骨小梁排列紊亂,數量減少,變細,發生斷裂,空洞增多,成骨細胞數量顯著減少,DM+去勢組中這種病理變化更加嚴重;DM+利拉魯肽組和DM+去勢+利拉魯肽組骨新生數量顯著增加,成骨細胞增多,見圖1。

圖1 各組股骨病理形態(HE染色,×200)

2.3各組BGP mRNA、CaBp-D9k mRNA表達 與健康組相比,DM組、去勢組、DM+去勢組BGP、CaBp-D9k mRNA表達顯著降低,且以去勢組與DM+去勢組表達變化最顯著(P<0.05),經過利拉魯肽干預后,與DM組、去勢組及DM+去勢組相比,DM+利拉魯肽組、DM+去勢+利拉魯肽組BGP、CaBp-D9k mRNA表達顯著升高(P<0.05),DM組、去勢組及DM+去勢組BGP、CaBp-D9k mRNA表達兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組BGP mRNA、CaBp-D9k mRNA表達對比

2.4各組成骨細胞凋亡 與健康組〔(4.06±0.30)%〕相比,DM組AI〔(13.08±1.31)%〕、去勢組〔(16.45±1.67)%〕、DM+去勢組〔(21.26±2.38)%〕增加,且以去勢組與DM+去勢組AI變化最顯著(P<0.05),經過利拉魯肽干預后,與DM組、去勢組及DM+去勢組相比,DM+利拉魯肽組AI〔(8.27±1.54)%〕、DM+去勢+利拉魯肽組〔(11.42±1.73)%〕顯著降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組成骨細胞凋亡(免疫熒光染色,×200)

2.5Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達 與健康組相比,DM組、去勢組、DM+去勢組Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達明顯降低,且以去勢組與DM+去勢組水平變化最顯著(P<0.05);與DM組、去勢組及DM+去勢組相比,DM+利拉魯肽組、DM+去勢+利拉魯肽組Shh、Ptch1、Gli1表達水平顯著升高(P<0.05);DM組、去勢組及DM+去勢組Shh、Ptch1、Gli1表達水平兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

1～6:健康組、DM組、DM+利拉魯肽組、去勢組、DM+去勢組、DM+去勢+利拉魯肽組圖3 各組Shh、Ptch1、Gli1水平對比

表3 各組Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達對比

3 討 論

DOP的疾病進程與胰島細胞的相關功能具有密切聯系,以往臨床DOP治療藥物對調控胰島細胞增殖分化及骨代謝具有一定的局限性。而利拉魯肽可有效加速修復胰島細胞,改善骨代謝。相關研究表示〔9〕,利拉魯肽對降低骨折發生具有良好效果,且男性肥胖T2DM患者接受利拉魯肽治療后,骨形成增加同時骨吸收受到抑制〔10〕。臨床治療中,利拉魯肽是控制T2DM患者的血糖及體質量的新藥且具有良好治療效果。 此外,利拉魯肽能夠有效改善OP動物模型的骨結構及骨密度,對骨的良好形成具有積極作用〔11〕。有學者研究發現〔12〕利拉魯肽可有效調節骨代謝,抑制破骨細胞增加,對糖尿病去卵巢大鼠起骨保護作用。經研究,不僅可調節骨代謝激素、反映成骨細胞活性,也是骨形成及骨質量判定的重要標志物〔13〕。本研究提示提示利拉魯肽具有降血糖,促骨形成的作用,這與王志剛等〔14〕及溫濱紅等〔15〕的研究結果一致。

Hedgehog不僅可干預成骨細胞系轉化,還對調節成骨細胞的分化和介導信號中Shh及多種骨骼生長發育密切相關〔16,17〕。 此外,Shh與細胞在肢體、體節、神經管發育中的分化建立有關,參與軟骨發育。 Ptch1、Gli1在Hedgehog 通路中發揮信號轉導作用。研究表明〔18〕Shh升高對激活Gli1/Ptc轉錄和增加Gli1蛋白表達,促進骨髓間充質干細胞向成骨分化進而促進治療具有重要意義。有學者〔19〕表示,OP產生機制與Hedgehog信號傳導通路Shh、Gli1 mRNA和蛋白活性下降有關,在經過治療后,通過激活Hedgehog信號傳導通路中的Shh、Gli1,以促進骨形成,抑制骨吸收,起到防止骨質疏松的作用。此外,高建強等〔20〕研究提示,GLP-1激動劑可通過激活Hedgehog通路促進成骨細胞增殖。在本實驗中,經過利拉魯肽干預后 PTCH1、Gli1、Shh水平升高,與上述研究結果相似,提示利拉魯肽通過調控TCH1、Gli1、Shh表達激活Hedgehog通路,促進成骨分化。

在腸道鈣吸收中跨細胞轉運過程是其關鍵方式。常規小腸內鈣離子吸收以十二指腸為主,并由腸鈣吸收通道基因CaBp-D9K進行介導〔21〕。而CaBp-D9K作為受維生素D介導的鈣轉運蛋白,可增強細胞內鈣轉運及促進鈣離子穿透細胞到達基底側,并與鈣吸收呈正相關。小腸吸收的鈣進入機體后,多數鈣通過儲存使骨礦化增加,提示骨密度等增加,從而改善OP。研究顯示〔22〕,CaBp-D9K下降是絕經后OP高發的關鍵,由于絕經女性雌激素水平降低可導致繼發性甲狀旁腺和維生素 D顯著降低,進而導致腸道功能及腸黏膜內CaBp-D9K 發生障礙。韓龍等〔23〕研究提示,通過增加小腸CaBp-D9k mRNA表達,促進腸鈣吸收,從而降低去卵巢大鼠OP程度。本研究提示,利拉魯肽可通過促進CaBp-D9K的合成,增強小腸鈣吸收能力,從而糾正體內負鈣平衡狀態抑制破骨作用,促進成骨作用。