圓口銅魚呼吸代謝的溫度響應(yīng)特征研究

胡曉娜，吳興兵，朱永久，朱挺兵，李學(xué)梅，楊德國

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223)

呼吸代謝是魚類最基本的生命活動(dòng)。魚類通過呼吸獲取水體中溶解氧以維持其各種生命活動(dòng)，同時(shí)向水體釋放氨態(tài)氮和CO2。耗氧率和排氨率是魚類呼吸代謝的重要表征指標(biāo)[1]。影響魚類呼吸代謝的因素有體重、年齡等內(nèi)在因素和水溫、鹽度等外在因素，其中水溫是影響魚類呼吸代謝重要的環(huán)境因素之一[2]。水溫對(duì)魚類的各方面均產(chǎn)生影響，如生理生化水平、能源物質(zhì)需求、能源物質(zhì)代謝途徑等。溫度系數(shù)(Q10)是反應(yīng)魚類代謝率對(duì)水溫變化響應(yīng)程度的重要指標(biāo)，Q10值越大，說明水溫變化對(duì)魚類影響越大[3]。另外，若水溫變化劇烈，甚至超出機(jī)體可調(diào)節(jié)范圍，魚類將產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為皮質(zhì)醇升高，生理機(jī)能受到影響，進(jìn)而影響呼吸代謝過程[4]。因此，研究魚類呼吸代謝對(duì)水溫變化的響應(yīng)特征，對(duì)魚類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展和自然資源的保護(hù)都具重要意義。

圓口銅魚(Coreiusguichenoti)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)亞科(Gobioninae)銅魚屬(Coreius)，為長(zhǎng)江上游特有魚類，棲息于水流湍急的江河底層[5]。因受水利工程建設(shè)、過度捕撈和環(huán)境惡化等影響，自然資源嚴(yán)重衰減[6]。目前，圓口銅魚已被《中國脊椎動(dòng)物紅色名錄(2016)》列為極危物種[7]，野外種群被《國家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄(2021)》列為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物。由于人工養(yǎng)殖環(huán)境與圓口銅魚自然棲息生境差異較大，研究圓口銅魚對(duì)環(huán)境因素的響應(yīng)特征十分重要。目前對(duì)圓口銅魚的研究主要集中在野生資源現(xiàn)狀[5]、應(yīng)激及其緩解方法[8]等方面。有關(guān)環(huán)境條件對(duì)圓口銅魚影響的研究較少，在呼吸代謝方面，僅見流速、體重和水溫對(duì)圓口銅魚代謝率的影響[9，10]。而關(guān)于圓口銅魚呼吸代謝對(duì)不同水溫的響應(yīng)特征，仍缺乏系統(tǒng)研究。

基于此，本實(shí)驗(yàn)研究了人工繁育圓口銅魚不同水溫下的耗氧率、排氨率、氧氮比和不同水溫范圍Q10，并同步測(cè)定了相應(yīng)水溫下圓口銅魚血液生理生化指標(biāo)，探討了圓口銅魚呼吸代謝對(duì)不同水溫的響應(yīng)特征，以期為圓口銅魚人工養(yǎng)殖和野外種群保護(hù)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚體質(zhì)量(94.84±1.72)g，為人工培育的3齡子一代圓口銅魚，均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所窯灣基地。實(shí)驗(yàn)前所有實(shí)驗(yàn)魚暫養(yǎng)于室內(nèi)封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的養(yǎng)殖桶(直徑0.8 m，高0.73 m，水深0.45 m。如無特殊說明，本研究均使用此規(guī)格養(yǎng)殖桶)。暫養(yǎng)期間保持水溫(20±0.5)℃和自然光周期。

暫養(yǎng)期間投喂人工配合飼料(粗蛋白質(zhì)≥42.0%，粗脂肪≥5.0%，總磷≥1.0%，粗纖維≤10.0%，粗灰分≤16.0%，賴氨酸≥2.4%)，采用飽食投喂，每日8：00和16：00各投喂一次。每日換水量約為養(yǎng)殖水體總水量的10%。所換新水經(jīng)曝氣、調(diào)溫后進(jìn)入養(yǎng)殖桶使用。養(yǎng)殖水體溶解氧大于7 mg/L，pH(7.61±0.27)，氨氮(0.04±0.03)mg/L，亞硝酸鹽(0.02±0.02)mg/L，硝酸鹽(15.40±7.37)mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置5個(gè)水溫處理組(10、15、20、25、30 ℃)，每個(gè)水溫組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)放置圓口銅魚30尾至養(yǎng)殖桶中。各水溫組水溫波動(dòng)范圍為±0.5 ℃。實(shí)驗(yàn)魚初始養(yǎng)殖水溫為(20±0.5)℃，水溫以2 ℃/d調(diào)整至各水溫組水溫。實(shí)驗(yàn)魚在各水溫下適應(yīng)2周后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h。

采用封閉流水式實(shí)驗(yàn)裝置[11]測(cè)定耗氧率和排氨率，使用10 L的廣口瓶做呼吸室，呼吸室放入恒溫水槽中，呼吸室和恒溫水槽使用的水均來自控溫養(yǎng)殖系統(tǒng)。廣口瓶使用橡皮塞塞緊，橡皮塞上帶有長(zhǎng)短2根玻璃管，長(zhǎng)玻璃管深入呼吸室底部，作為呼吸室的進(jìn)水口，短玻璃管稍突出橡皮塞，為呼吸室的出水口。每個(gè)水溫組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)使用2尾實(shí)驗(yàn)魚。實(shí)驗(yàn)魚放入呼吸室2 h后開始實(shí)驗(yàn)，測(cè)定進(jìn)、出水口溶解氧和氨氮。每隔2 h測(cè)定一次進(jìn)出水口水溫、溶解氧、水流量，同時(shí)采集水樣用于水體中氨氮測(cè)定，持續(xù)24 h。實(shí)驗(yàn)過程中，呼吸室出水口溶解氧水平保持在4 mg/L以上，氨氮水平保持在0.20 mg/L以下，水流量為(14.58±1.48)L/h。采樣結(jié)束后，測(cè)量實(shí)驗(yàn)魚全長(zhǎng)(cm，精確至0.1 cm)、體長(zhǎng)(cm，精確至0.1 cm)和體質(zhì)量(g，精確至0.01 g)。

1.3 耗氧率、排氨率測(cè)定

溶解氧使用溶氧儀(哈希，HQ40d)測(cè)定，氨氮含量使用水質(zhì)分析儀(哈希，DR3900)測(cè)定。耗氧率、排氨率、溫度系數(shù)、氧氮比計(jì)算公式[12-14]如下：

耗氧率[mg/(kg·h)]：RO=(DO0-DOt)×V/W

排氨率[mg/(kg·h)]：RN=(Nt-N0)×V/W

溫度系數(shù)：Q10=(R2/R1)10/(T2-T1)

氧氮比：O∶N=(Ro/16)/(RN/14)

式中：DO0、DOt分別代表進(jìn)、出水口溶解氧含量(mg/L)；N0、Nt分別代表進(jìn)、出水口氨氮含量(mg/L)；V代表呼吸室水流速度(L/h)；W代表實(shí)驗(yàn)魚體質(zhì)量(kg)；R1、R2分別代表水溫T1和T2時(shí)的耗氧率(或排氨率)；RO、RN分別代表耗氧率和排氨率。

1.4 生理生化指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)魚分別在10、15、20、25和30 ℃水溫條件下暫養(yǎng)2周后，禁食24 h進(jìn)行樣品采集工作。每個(gè)水溫組9個(gè)重復(fù)。取樣時(shí)，每次從養(yǎng)殖桶中快速撈取1尾魚，放入含MS-222(100 mg/L)的水中麻醉，用1 mL注射器(1%肝素鈉浸潤(rùn)針頭)尾靜脈抽血。血液分為2份：一份全血凍存，用于血紅蛋白含量測(cè)定，另一份置4 ℃冰箱中靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，取上層血清，用于乳酸、血糖、皮質(zhì)醇測(cè)定。

血液生化指標(biāo)測(cè)定均使用南京建成生物工程研究所試劑盒，樣品處理與測(cè)定均按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。血紅蛋白含量采用HICN比色法測(cè)定(貨號(hào)：C021)，血糖含量采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定(貨號(hào)：A154)，乳酸和皮質(zhì)醇含量采用比色法(貨號(hào)分別為A019-2和H094)測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

各測(cè)定參數(shù)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)的形式表示。各指標(biāo)的差異比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較，顯著水平為0.05。數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS 25。

2 結(jié)果

2.1 水溫對(duì)圓口銅魚耗氧率、排氨率、溫度系數(shù)Q10和氧氮比的影響

不同水溫下圓口銅魚耗氧率、排氨率見圖1。在10～30 ℃內(nèi)，隨著水溫升高，圓口銅魚耗氧率和排氨率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，均在25 ℃組達(dá)到最大，其值分別為247.95 mg/(kg·h)和8.52 mg/(kg·h)。15～25 ℃內(nèi)各組耗氧率無顯著差異，但顯著高于10、30 ℃組，10 ℃組顯著低于其他各水溫組[圖1(a)]。各水溫組排氨率無顯著差異[圖1(b)]。

圖1 不同水溫下圓口銅魚耗氧率(a)、排氨率(b)。Fig.1 Oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of C.guichenoti under different water temperatures不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下圖同。

不同水溫范圍圓口銅魚耗氧率、排氨率的Q10值見表1。耗氧率Q10值范圍為0.45～5.64，整體呈下降趨勢(shì)，10～15 ℃組顯著高于其他組，25～30 ℃組顯著低于其他組。排氨率Q10值范圍為0.38～1.53，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在20～25 ℃組達(dá)到最大值，25～30 ℃組最小且顯著低于其他組。

表1 不同水溫范圍圓口銅魚耗氧率和排氨率的Q10值Tab.1 Q10 values of oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of C.guichenoti under different water temperature range

不同水溫下圓口銅魚氧氮比見圖2。10～30 ℃范圍內(nèi)，氧氮比范圍為15.28～30.71，單因素方差分析表明，水溫對(duì)氧氮比有顯著影響，繼而使用多重比較進(jìn)行不同水溫組間的差異比較，發(fā)現(xiàn)10 ℃組氧氮比顯著低于其他組。

圖2 不同水溫下圓口銅魚氧氮比Fig.2 O∶N ratio of C.guichenoti under different water temperatures

2.2 水溫對(duì)圓口銅魚血液生理生化指標(biāo)的影響

不同水溫下圓口銅魚血液生理生化指標(biāo)如表2所示。整體上，水溫對(duì)圓口銅魚血紅蛋白、血糖、乳酸、皮質(zhì)醇含量均具顯著影響。血紅蛋白含量隨水溫升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在25 ℃組達(dá)到最大，其值為80.41 g/L，30 ℃組最小，其值為60.52 g/L，顯著低于其他水溫組。血糖含量隨水溫升高整體呈下降趨勢(shì)，但在25 ℃出現(xiàn)略微回升；除25 ℃組外，10 ℃組血糖含量顯著高于其他各水溫組。乳酸含量隨水溫升高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，15 ℃組最大，其值為2.42 mmol/L；10 ℃組乳酸含量顯著低于其他水溫組，其值為1.10 mmol/L。皮質(zhì)醇含量隨水溫升高呈先下降后升高趨勢(shì)，25 ℃組達(dá)到最低，其值為2.67 ng/mL；10 ℃組含量顯著高于其他各水溫組，其值為14.03 ng/mL。15、20、30 ℃組間無顯著差異，20、25 ℃無顯著差異。

表2 不同水溫下圓口銅魚血液生理生化指標(biāo)Tab.2 Blood physiological and biochemical indexes of C.guichenoti under different water temperatures

2.3 水溫對(duì)圓口銅魚耗氧率晝夜變化的影響

不同水溫下圓口銅魚耗氧率晝夜變化如圖3所示。15～25 ℃范圍內(nèi)，圓口銅魚耗氧率為夜間顯著高于白天，10、30 ℃組夜間和白天無顯著差異。15～25 ℃組全天耗氧率整體均高于10、30 ℃組。

圖3 不同水溫下圓口銅魚耗氧率晝夜變化Fig.3 Diurnal variation of oxygen consumption rate of C.guichenoti under different water temperatures

3 討論

3.1 水溫對(duì)圓口銅魚呼吸代謝的影響

呼吸和排泄是魚類代謝活動(dòng)重要表征，可反映魚類新陳代謝水平、生理狀況[15]。隨水溫升高，腦、心臟、肝臟等器官組織細(xì)胞中各種酶活性增強(qiáng)，新陳代謝水平升高，引起氧氣需求量增加，此時(shí)魚類通過增加呼吸頻率、氣體交換量，以及提高血紅蛋白含量增強(qiáng)氧氣運(yùn)輸能力等提高氧氣攝取量，表現(xiàn)出耗氧率、排氨率和血紅蛋白含量同時(shí)升高的現(xiàn)象[16，17]，但超出適宜溫度范圍時(shí)，魚體生理機(jī)能(如造血系統(tǒng))發(fā)生改變，出現(xiàn)耗氧率、排氨率和血紅蛋白含量降低的現(xiàn)象[18，19]。本研究中，圓口銅魚耗氧率和排氨率均隨水溫升高呈先升高后降低趨勢(shì)，均在25 ℃組達(dá)到最大值。符合魚類耗氧率和排氨率隨水溫升高先增加后降低的一般規(guī)律。與鯔(Mugilcephalus)[18]幼魚的研究結(jié)論一致。魚類代謝速率對(duì)水溫變化的響應(yīng)程度可用溫度系數(shù)(Q10)表示[3]。10～30 ℃范圍內(nèi)，鯽(Carassiuscarassius)、鳊(Parabramispekinensis)耗氧率Q10值范圍為0.94～2.61[20]。本研究中，15～25 ℃范圍內(nèi)，圓口銅魚耗氧率和排氨率的Q10值范圍為1.05～1.53。圓口銅魚耗氧率Q10值在10～15 ℃出現(xiàn)最大值，為5.64，表明該溫度范圍內(nèi)圓口銅魚對(duì)溫度變化較敏感。在適宜溫度范圍內(nèi)，Q10值隨水溫升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，最低值出現(xiàn)在最佳溫度下，水溫超過此范圍時(shí)，Q10值減小[13]。在31～34 ℃范圍內(nèi)，脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)成蝦耗氧率Q10值小于1，認(rèn)為脊尾白蝦的呼吸在高溫下受到限制[13]，本研究結(jié)果與其類似。25～30 ℃，圓口銅魚耗氧率和排氨率的Q10值均小于1且顯著低于其他組，說明30 ℃水溫較高，圓口銅魚的呼吸受到限制。結(jié)合耗氧率、排氨率、耗氧率Q10、排氨率Q10綜合分析，認(rèn)為30 ℃超出圓口銅魚適溫范圍，15～25 ℃范圍內(nèi)圓口銅魚代謝水平較穩(wěn)定。

血糖是魚類重要的能源物質(zhì)，可表示魚類對(duì)能量的需求。血糖主要源于消化吸收的葡萄糖或肝糖原的分解和糖異生作用，通常情況下保持動(dòng)態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)[21]。低溫應(yīng)激下，皮質(zhì)醇含量增加通常作為魚體應(yīng)激的信號(hào)，高皮質(zhì)醇含量可引起高血糖現(xiàn)象[22]。低溫環(huán)境下尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)出現(xiàn)高血糖現(xiàn)象，是為代謝反應(yīng)提供底物的一種機(jī)制[22]。本研究中，10 ℃組圓口銅魚血糖含量顯著高于15、20、30 ℃組，10 ℃組皮質(zhì)醇含量顯著高于其他組，表明圓口銅魚在此水溫下受到低溫脅迫，為抵御低溫環(huán)境，機(jī)體大量分解肝糖原，導(dǎo)致血糖含量增加。熱應(yīng)激下，皮質(zhì)醇含量增加促進(jìn)肝糖原分解和糖異生作用增強(qiáng)，血糖含量升高供給能量代謝水平升高的需求，隨時(shí)間延長(zhǎng)，血糖被消耗，肝糖原大量分解，出現(xiàn)血糖顯著下降的現(xiàn)象[23]。本研究中，當(dāng)水溫由25 ℃升至30 ℃時(shí)，圓口銅魚血糖含量下降，皮質(zhì)醇含量顯著上升，說明30 ℃條件下，圓口銅魚長(zhǎng)時(shí)間受到高溫脅迫后，肝糖原大量消耗，導(dǎo)致血糖含量降低。結(jié)合耗氧率、排氨率、血紅蛋白含量在30 ℃時(shí)顯著下降等現(xiàn)象，認(rèn)為30 ℃已超出圓口銅魚適溫范圍。氧氮比常用于表示動(dòng)物體內(nèi)供能的能源物質(zhì)的比例，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)作為主要能源物質(zhì)時(shí)，氧氮比約為7；蛋白質(zhì)和脂肪共同供能時(shí)，氧氮比約為24；脂肪和碳水化合物供能比例越高，氧氮比越大[24-26]。本研究中，10 ℃組圓口銅魚氧氮比值為15.28，顯著低于其他各組，說明圓口銅魚低溫下主要依靠蛋白質(zhì)供能，可能與低溫下圓口銅魚依附在養(yǎng)殖桶底部，攝食活動(dòng)較少有關(guān)，不利于機(jī)體生長(zhǎng)。綜合分析，15～25 ℃范圍內(nèi)，圓口銅魚呼吸代謝水平處于穩(wěn)定狀態(tài)。

能量代謝分為需氧代謝和厭氧代謝兩種途徑。乳酸是厭氧代謝途徑的代謝產(chǎn)物，其含量一定程度上可代表魚體厭氧代謝的水平[27]。水溫升高，機(jī)體各類酶活性增強(qiáng)，魚體運(yùn)動(dòng)增多，能量需求增大，此時(shí)機(jī)體需氧代謝提供的能量未能滿足機(jī)體需求，機(jī)體可通過提升厭氧代謝水平以保證機(jī)體能量供應(yīng)充足[27]。本研究中，15～30 ℃組，圓口銅魚乳酸含量均顯著高于10 ℃組，可能與圓口銅魚恢復(fù)運(yùn)動(dòng)以及運(yùn)動(dòng)增多有關(guān)。適溫范圍內(nèi)，魚類與水環(huán)境處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。本研究中，水溫處于15～25 ℃范圍內(nèi)時(shí)，圓口銅魚乳酸含量無顯著變化，說明此時(shí)圓口銅魚代謝水平處于穩(wěn)定狀態(tài)，這與15～25 ℃水溫范圍內(nèi)圓口銅魚耗氧率無顯著差異的表現(xiàn)一致。30 ℃時(shí)，乳酸含量顯著降低，可能與水溫過高，圓口銅魚受到脅迫，機(jī)能受損，代謝水平降低有關(guān)。

3.2 水溫對(duì)圓口銅魚耗氧率晝夜變化的影響

耗氧率晝夜變化顯示了生物體對(duì)環(huán)境周期性變化的適應(yīng)特征，通常分為夜間大于白天、白天大于夜間和晝夜差異不明顯等3種類型。一般來說，耗氧率高表明魚類此時(shí)代謝水平較高，正處于較強(qiáng)的活動(dòng)狀態(tài)，如攝食和快速游動(dòng)[3]。本研究中發(fā)現(xiàn)，15、20和25 ℃組圓口銅魚耗氧率均為夜間大于白天類型，這與孫寶柱等[28]的研究結(jié)果一致，這說明，15～25 ℃范圍內(nèi)圓口銅魚夜間活動(dòng)要強(qiáng)于白天，推測(cè)與圓口銅魚夜間攝食習(xí)性相關(guān)。10 ℃組圓口銅魚耗氧率屬于晝夜差異不明顯型，這與劉飛等[29]報(bào)道的圓口銅魚春季白晝型攝食節(jié)律的研究結(jié)果相符。推測(cè)與水溫過低，其攝食活動(dòng)在水溫較高的正午表現(xiàn)更為活躍有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，10 ℃時(shí)，圓口銅魚全天停留于養(yǎng)殖桶底部，游泳運(yùn)動(dòng)較少，這與其此時(shí)晝夜耗氧率差異不大一致。30 ℃時(shí)，耗氧率晝夜差異不大，此時(shí)，水溫較高，圓口銅魚攝食活動(dòng)不受水溫限制，推測(cè)與水溫過高，身體機(jī)能受到影響有關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)15～25 ℃水溫組，圓口銅魚全天耗氧率均高于10、30 ℃水溫組，與實(shí)驗(yàn)過程中10 ℃組圓口銅魚代謝水平低、30 ℃組血紅蛋白含量顯著降低等表現(xiàn)一致，這說明15～25 ℃范圍內(nèi)圓口銅魚代謝水平較穩(wěn)定。

研究表明，水溫24.5～26 ℃范圍內(nèi)，圓口銅魚(體質(zhì)量：9.9～14.0 g)晝夜耗氧率在11：00和3：00達(dá)到高潮，9：00和21：00達(dá)到低潮[28]，而本研究中在17：00達(dá)到低潮，推測(cè)與實(shí)驗(yàn)魚的規(guī)格不同有關(guān)。15～25 ℃組圓口銅魚耗氧率均在17：00后開始升高，并在19：00至翌日1：00時(shí)間段內(nèi)維持較高水平，推測(cè)圓口銅魚在此時(shí)間段內(nèi)活動(dòng)強(qiáng)，需氧量大[30]，然而夜間由于浮游植物光合作用弱，水體中氧氣不能及時(shí)補(bǔ)充，因此在人工養(yǎng)殖過程中，應(yīng)注意夜間水體溶解氧的含量，必要時(shí)需在夜間人工增氧，避免缺氧事故發(fā)生。

4 結(jié)論

水溫對(duì)圓口銅魚呼吸代謝表征指標(biāo)及血液學(xué)參數(shù)具顯著影響。15～25 ℃范圍內(nèi)，圓口銅魚整體代謝水平穩(wěn)定；水溫對(duì)圓口銅魚耗氧率晝夜變化具顯著影響，應(yīng)根據(jù)不同水溫下耗氧率晝夜特征對(duì)投喂時(shí)間進(jìn)行合理調(diào)整，以期達(dá)到圓口銅魚健康養(yǎng)殖的目的。