河川沙塘鱧病原殺鮭氣單胞菌致病性及感染后宿主免疫相關(guān)基因差異表達(dá)分析

李 杰，劉國(guó)興，2，錢且奇，朱玉潔，陳 圳，姜 群，王 駿，張曉君，高曉建

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 ，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017)

河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)屬于鱸形目(Perciformes)鰕鯱魚亞目沙塘鱧科(Odontobutidae)沙塘鱧屬(Odontobutis)，常見于我國(guó)長(zhǎng)江中下游、錢塘江、閩江等[1-2]，該品種味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的歡迎，已成為我國(guó)水產(chǎn)業(yè)極具發(fā)展?jié)摿Φ奶厣B(yǎng)殖品種。自2009年河川沙塘鱧開始規(guī)模化繁育以來，其人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，已在多個(gè)省市的養(yǎng)殖區(qū)開展了混養(yǎng)和套養(yǎng)[3]。但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以及水環(huán)境的惡化，河川沙塘鱧病害問題也逐漸嚴(yán)重，制約著其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前已報(bào)道的河川沙塘鱧病原有維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[4]、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)[5]、溶血性蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)[6]、兩性綿霉(Achlyabisexualis)[7]等。

2021年3月江蘇常熟市某養(yǎng)殖場(chǎng)河川沙塘鱧出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，發(fā)病水溫為12～15 ℃，其主要癥狀為體表不同程度的潰瘍，并且鰭條充血、出血。本研究從瀕死的河川沙塘鱧分離到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)細(xì)菌，命名為G2-4-1，經(jīng)理化特性和分子特征確定其為殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)。通過對(duì)分離菌人工感染健康的河川沙塘鱧和組織病理分析以確定其致病性，并對(duì)其進(jìn)行了致病菌毒力因子檢測(cè)、耐藥性檢測(cè)以及感染后宿主免疫相關(guān)基因表達(dá)變化分析，探尋河川沙塘鱧對(duì)殺鮭氣單胞菌感染的免疫應(yīng)答規(guī)律，為進(jìn)一步研究河川沙塘鱧細(xì)菌性疾病防控奠定了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離

患病河川沙塘鱧(60±5)g采自江蘇常熟市河川沙塘鱧養(yǎng)殖場(chǎng)，將瀕死的河川沙塘鱧用75%的酒精體表消毒后，無菌條件取肝臟、腎臟及脾臟組織，并劃線接種至普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，20 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并將純化后的菌液加入等體積的20%(V/V)甘油，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 人工感染試驗(yàn)

將分離菌G2-4-1接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，20 ℃培養(yǎng)36 h制成菌懸液，并用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋至1.8×108、1.8×107、1.8×106、1.8×105、1.8×104CFU/mL。將健康的河川沙塘鱧[(15±1.5)g]暫養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為5個(gè)感染組和1個(gè)對(duì)照組，感染組每組15尾魚，分別腹腔注射0.1 mL的不同濃度的菌液，對(duì)照組按照同樣方式注射等量無菌生理鹽水。感染試驗(yàn)期間，水溫18～20 ℃，溶氧5.0 mg/L以上。連續(xù)觀察7 d，記錄河川沙塘鱧發(fā)病與死亡情況，同時(shí)將死亡的河川沙塘鱧重新分離細(xì)菌并鑒定，半數(shù)致死濃度(LD50)計(jì)算參考張慶萍等[8]方法進(jìn)行。

1.3 組織病理觀察

取對(duì)照組和G2-4-1菌株感染組河川沙塘鱧的肝臟、鰓、脾臟和腎臟組織于Bouin’s液固定24 h后，用70%酒精保存。將固定的樣品經(jīng)脫水、透明、打蠟、石蠟包埋后，用切片機(jī)切片(3～6 μm)，然后蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹脂膠密封后于光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.4 分離菌形態(tài)觀察和理化特性測(cè)定

取分離菌G2-4-1進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)將分離菌G2-4-1滴于經(jīng)聚醋酸甲基乙烯脂膜包被的銅網(wǎng)上并靜置1 min，用0.5%磷鎢酸水溶液負(fù)染1 min，最后自然干燥后利用Tecnai 12透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。另外將分離菌G2-4-1接種于微量生化管測(cè)定精氨酸水解酶、賴氨酸脫羧酶、纖維二糖、麥芽糖等理化指標(biāo)，并對(duì)照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[9]對(duì)分離菌進(jìn)行種屬判定。

1.5 gyrB序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

采用煮沸法提取分離菌的DNA作為模板，對(duì)菌株gyrB基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由南京擎科生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。應(yīng)用NCBI 中BLAST對(duì)測(cè)得的基因序列進(jìn)行比對(duì)，選擇相關(guān)序列，利用 ClustaW進(jìn)行同源性比對(duì)，通過 Mega4 軟件中鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 毒力基因檢測(cè)

選擇氣單胞菌的氣溶素(aer)、溶血素(hly)、封閉帶毒素(zot)、DNA酶(exu)、絲氨酸蛋白酶(ser)、磷脂酶(lip)、S層蛋白(sp)、熱不穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)和細(xì)胞毒性腸毒素(act)共9個(gè)毒力相關(guān)基因，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由南京擎科生物有限公司合成(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系：2 × EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL,引物各0.5 μL,DNA模版1 μL,最后加ddH2O至25 μL，并以ddH2O替代DNA模板作為空白對(duì)照；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸5 min。1.0 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，以擴(kuò)增片段的有無及大小判斷相應(yīng)毒力基因的存在情況。

表1 殺鮭氣單胞菌毒力基因引物序列Tab.1 Primer sequences of virulence genes of A.salmonicida

1.7 分離菌G2-4-1胞外酶與溶血素的測(cè)定

參考周麗穎等[10]采用平板法測(cè)定分離菌G2-4-1的蛋白酶、明膠酶、脂酶、卵磷脂酶、淀粉酶、DNA酶以及溶血素活性。

1.8 耐藥性分析

采用紙片擴(kuò)散法(K-B)對(duì)分離菌G2-4-1進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，將分離菌G2-4-1的濃度調(diào)整至1.5 × 108CFU/mL，吸取100 μL菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，將藥敏紙片(杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品)貼于平板上，28 ℃中培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑(mm)。根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品說明書：抑菌圈直徑大于等于17(mm)為敏感，抑菌圈直徑大于等于14(mm)小于17(mm)為中介，抑菌圈直徑小于14(mm)為抗性，根據(jù)抑菌圈直徑判定分離菌G2-4-1的耐藥性。

1.9 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析

將健康的河川沙塘鱧分為感染組和對(duì)照組，每組50尾，實(shí)驗(yàn)組每尾魚腹腔注射100 μL殺鮭氣單胞菌菌液，濃度為1.8×105CFU/mL。對(duì)照組按同樣的方式和劑量注射無菌生理鹽水，在注射6、12、24、48和72 h后，分別取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的鰓、脾臟和腎臟組織，利用Trizol法提取RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；qRT-PCR在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行，采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒；本實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參基因，免疫相關(guān)引物信息見表2，并通過解離曲線分析確定引物特異性，每個(gè)樣品重復(fù)3次，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，0.01

表2 熒光定量PCR相關(guān)引物序列Tab.2 Fluorescence quantitative PCR related primer sequence

2 結(jié)果

2.1 患病河川沙塘鱧癥狀及分離菌形態(tài)特征

患病河川沙塘鱧表現(xiàn)為體表嚴(yán)重潰瘍，體表嚴(yán)重潰爛，泄殖孔紅腫、潰瘍，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟嚴(yán)重出血。從肝臟分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌株G2-4-1為革蘭氏陰性短桿菌，在瓊脂培養(yǎng)基上菌落圓形、邊緣整齊、中間凸起、白色不透明、表面濕潤(rùn)、直徑為1～2 mm；經(jīng)負(fù)染色后，透射電子顯微鏡下觀察菌株G2-4-1呈桿狀，兩端鈍圓，無芽孢，單鞭毛(圖1)，大小多為0.5～1.0 μm。

圖1 自然感染河川沙塘鱧的發(fā)病癥狀及分離菌形態(tài)特征Fig.1 Clinical signs of naturally infected A.salmonicense and colony morphologies of the isolatea.背部潰瘍的河川沙塘鱧(△)，b.泄殖孔紅腫、潰瘍(★)，c.肝臟嚴(yán)重出血(□)，d.分離菌G2-4-1革蘭氏染色 e.優(yōu)勢(shì)菌株G2-4-1在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落形態(tài)，f.分離菌G2-4-1電鏡照片

2.2 分離菌G2-4-1的致病性

分離菌G2-4-1腹腔注射感染健康的河川沙塘鱧數(shù)小時(shí)后，河川沙塘鱧出現(xiàn)游泳遲緩、體色發(fā)暗等體征，背部出現(xiàn)潰瘍，鰓嚴(yán)重受損，泄殖孔腫脹等癥狀(圖2)，并陸續(xù)死亡，其發(fā)病癥狀與自然條件下發(fā)病河川沙塘鱧的癥狀相似，死亡情況見表3；對(duì)照組河川沙塘鱧在7 d內(nèi)均正常。分離菌G2-4-1對(duì)河川沙塘鱧的7 d LD50為1.8×106CFU/mL。從人工感染殺鮭氣單胞菌中重新分離菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果均與原感染菌一致。以上結(jié)果表明可確定該菌株為患病河川沙塘鱧的病原菌。

圖2 人工感染河川沙塘鱧的發(fā)病癥狀Fig.2 Clinical signs of artificially infected A.salmonicensea.背部潰瘍的河川沙塘鱧(△)，b.背部潰瘍(□)，鰓嚴(yán)重受損，c.泄殖孔紅腫、潰瘍(☆)

表3 分離菌G2-4-1人工感染河川沙塘鱧試驗(yàn)Tab.3 Results of artificial infection of the strain G2-4-1 to healthy O.potamophilus

2.3 組織病理分析

健康對(duì)照組和患病感染組河川沙塘鱧的組織切片結(jié)果如圖3。對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，細(xì)胞邊界明顯(圖3-a)；感染組肝臟出血嚴(yán)重，細(xì)胞排列紊亂松散，細(xì)胞核染色較深，部分肝臟細(xì)胞溶解壞死，細(xì)胞核溶解消失(圖3-b)。對(duì)照組的鰓絲表面舒展平滑，細(xì)胞分布均勻，排列緊密(圖3-c)；感染組的鰓小片呼吸上皮細(xì)胞腫脹變性，出現(xiàn)壞死脫落，鰓細(xì)胞排列疏松紊亂，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞空泡化(圖3-d)。對(duì)照組的脾臟細(xì)胞分布均勻、排列緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(圖3-e)；感染組的脾臟細(xì)胞排列松散紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、空泡、壞死(圖3-f)。對(duì)照組的腎臟細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3-g)；感染組的部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死、脫落，細(xì)胞排列疏松，腎間組織細(xì)胞空泡，出現(xiàn)大片壞死(圖3-h)。

圖3 殺鮭氣單胞菌感染河川沙塘鱧的組織病理學(xué)變化(×200)Fig.3 The histopathological changes of A.salmonicida infection in O.potamophilus(×200)a.健康魚肝臟，b.患病魚肝臟，c.健康魚鰓，d.患病魚鰓，e.健康魚脾臟，f.患病魚脾臟，g.健康魚腎臟，h.患病魚腎臟 ★表示細(xì)胞核染色較深。☆表示肝細(xì)胞溶解壞死，細(xì)胞核溶解消失。□表示細(xì)胞腫脹變性，壞死脫落。▲表示細(xì)胞空泡化。→表示細(xì)胞腫脹、空泡、壞死。*表示細(xì)胞腫脹、壞死、脫落，細(xì)胞排列疏松。#表示細(xì)胞空泡，大片壞死。

2.4 分離菌G2-4-1理化特征

分離菌G2-4-1的精氨酸二水解酶呈陽性，且多項(xiàng)理化特性與《Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology》[9]中描述殺鮭氣單胞菌理化特性一致，詳情見表4。

表4 分離菌G2-4-1的理化特性Tab.4 Physicochemical properties of the strain G2-4-1

2.5 gyrB基因序列同源性分析

分離菌G2-4-1的gyrB基因序列在GenBank中登錄號(hào)為OM203113，所擴(kuò)增gyrB基因序列長(zhǎng)度為1 116 bp。將分離菌G2-4-1的gyrB序列在NCBI進(jìn)行Blast對(duì)比，結(jié)果顯示分離菌G2-4-1的gyrB序列與殺鮭氣單胞菌的gyrB序列(GenBank登錄號(hào)為：JN711839.1)相似性為99.63%，并且進(jìn)化樹分析顯示分離菌G2-4-1與所選擇的殺鮭氣單胞菌聚為一支(圖4)，表明分離菌G2-4-1與殺鮭氣單胞菌親緣關(guān)系最近。

圖4 基于分離菌G2-4-1和其他細(xì)菌gyrB基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The neighbor joining(NJ)phylogenetic tree based on the partial gyrB gene sequences

綜合供試菌株的表型特征、理化特性及gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，判定分離菌G2-4-1為殺鮭氣單胞菌。

2.6 殺鮭氣單胞菌毒力基因和毒力因子檢測(cè)結(jié)果

毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明，分離菌G2-4-1攜帶aer、hly、exu、ser、alt、act和lip共7個(gè)毒力相關(guān)基因(圖5)；胞外酶及溶血活性檢測(cè)結(jié)果表明，分離菌G2-4-1具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明膠酶和溶血素活性，但不具有DNA酶活性(圖6)。

圖5 殺鮭氣單胞菌毒力相關(guān)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification of the virulence-related genes of A.salmonicida M.marker；1.aer；2.hly；3.exu；4.ser；5.alt；6.act；7.lip

圖6 殺鮭氣單胞菌胞外酶和溶血素的檢測(cè)Fig.6 Determination of extracellular enzymes and hemolysin of A.salmonicida a，b：溶血素活性；c，d：蛋白酶活性；e，f：卵磷脂酶活性；g，h：明膠酶活性；i，j：淀粉酶活性；k，l：脂酶活性；a.c.e.g.i.k：實(shí)驗(yàn)組；b.d.f.h.j.l：對(duì)照組。

2.7 殺鮭氣單胞菌耐藥性分析

分離菌G2-4-1對(duì)青霉素G、氨芐西林、苯唑西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩、麥迪霉素、多粘菌素B和克林霉素8種藥物耐藥，對(duì)克拉霉素和大觀霉素2種藥物中介，對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考等24類藥物敏感(表5)。

表5 殺鮭氣單胞菌對(duì)34種抗菌藥物的敏感性Tab.5 Sensitivity of A.salmonicide to 34 antimicrobial agents

2.8 殺鮭氣單胞菌感染對(duì)河川沙塘鱧免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.8.1 殺鮭氣單胞菌感染對(duì)鰓組織中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖7可知，MHCⅡB免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量在感染6 h后顯著上調(diào)表達(dá)，在48 h達(dá)到峰值，上調(diào)0.84倍，在48 h后開始逐漸下降；MyD88、TLR和SOD共3個(gè)免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量在感染 6 h后顯著上調(diào)表達(dá)，在24 h達(dá)到峰值，分別上調(diào)1.83、1.8和1.47倍，在24 h后開始逐漸下降。結(jié)果表明河川沙塘鱧感染初期這些免疫相關(guān)基因的表達(dá)量在鰓組織中都迅速上調(diào)。

圖7 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12、24、48、72 h)鰓組織中免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)情況Fig.7 Analysis of immune-related genes expression in O.potamophilus gill in response to A.salmonicida challenge by qRT-PCR at 0，6，12，24，48，72 h post-injection**表示極顯著性差異(P≤0.01)

2.8.2 殺鮭氣單胞菌感染對(duì)脾臟組織中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖8可知，MHCⅡB免疫相關(guān)基因的表達(dá)量在感染 6 h后相對(duì)顯著上調(diào)表達(dá)，在12 h達(dá)到峰值，上調(diào)2.58倍，在12 h后開始逐漸下降；MyD88、TLR和SOD共3個(gè)免疫相關(guān)基因的表達(dá)量在感染 6 h后相對(duì)顯著上調(diào)表達(dá)，在24 h達(dá)到峰值，分別上調(diào)1.37、1.6和1.38倍，在24 h后開始逐漸下降。結(jié)果表明河川沙塘鱧感染初期這些免疫相關(guān)基因的表達(dá)量在脾臟組織中都迅速上調(diào)。

圖8 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12、24、48、72 h)脾臟組織中免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)情況Fig.8 Analysis of immune-related genes expression in O.potamophilus spleen in response to A.salmonicida challenge by qRT-PCR at 0，6，12，24，48，72 h post-injection**表示極顯著性差異(P≤0.01)

2.8.3 殺鮭氣單胞菌感染對(duì)腎臟組織中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖9可知，MyD88免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量在感染12 h后顯著上調(diào)表達(dá)，在24 h達(dá)到峰值，上調(diào)1.13倍，然后在24 h后開始逐漸下降；MHCⅡB、TLR和SOD共3個(gè)免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量在感染6 h后顯著上調(diào)表達(dá)，在24 h達(dá)到峰值，分別上調(diào)2.62、0.89和1.47倍，在24 h后開始逐漸下降。結(jié)果表明河川沙塘鱧感染初期這些免疫相關(guān)基因的表達(dá)量在腎臟組織中均迅速上調(diào)。

圖9 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12、24、48、72 h)腎臟組織中免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)情況Fig.9 Analysis of immune-related genes expression in O.potamophilus kidney in response to A.salmonicida challenge by qRT-PCR at 0，6，12，24，48，72 h post-injection*表示顯著性差異(0.01

3 討論

3.1 殺鮭氣單胞菌的致病性

殺鮭氣單胞菌是革蘭氏陰性短桿菌，屬氣單胞菌屬 (Aeromonas)，可導(dǎo)致魚類發(fā)生癤瘡病或潰瘍病[12]。殺鮭氣單胞菌菌體主要集中在魚的肌肉和免疫器官，特別是在魚的脾臟、腎臟和肝臟組織，被其感染的魚類經(jīng)常出現(xiàn)體表潰爛，器官發(fā)黑甚至嚴(yán)重出血[13]。本實(shí)驗(yàn)中，感染殺鮭氣單胞菌的河川沙塘鱧臨床表現(xiàn)主要癥狀為體表不同程度地潰瘍，并且鰭條充血、出血，解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)肝臟出血，這與雷美華等[14]報(bào)道殺鮭氣單胞菌可導(dǎo)致鰻鱺(Anguillajaponica)體表潰瘍，皮膚出現(xiàn)少量變色斑點(diǎn)，鰓傷，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)死亡一致；COSCELLI等[15]報(bào)道殺鮭氣單胞菌能引起大菱鲆(Scophthatmusmaximus)肝臟出血，體表潰瘍；THOMAS等[16]發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌引起胡鯰(Clariasbatrachus)體表粘液減少，鰓絲損傷，肝臟組織空泡化，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)大量死亡等研究報(bào)道結(jié)果存在一致性，但并不完全相同，推測(cè)為同一種病原菌感染不同水產(chǎn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)不同的臨床癥狀表現(xiàn)，也可能是因?yàn)轲B(yǎng)殖水體溫度不同，病原菌理化特性存在差異性。據(jù)報(bào)道，感染殺鮭氣單胞菌患病或死亡的水產(chǎn)動(dòng)物包括雜交鱘(Hybridsturgeon)[17]、鯽(Carassiusauratus)[18]、鯉(Lyprinuscarpio)[18]、長(zhǎng)江江豚(Neophocaenaasiaeorientalis)[18]、裸蓋魚(Anoplopomafimbria)[19]和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[20]等，可見其致病性較強(qiáng)且宿主范圍較廣。

3.2 殺鮭氣單胞菌的毒力因子

殺鮭氣單胞菌的強(qiáng)致病性是由其多個(gè)毒力因子共同作用的[14]，郝婧薇等[21]研究發(fā)現(xiàn)，殺鮭氣單胞菌毒力基因主要包括aer和hly等。本研究通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分離菌G2-4-1攜帶aer、hly、exu、ser、alt、act和lip共7個(gè)毒力基因，具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明膠酶和溶血素活性，但不具有DNA酶活性。這與張飄等[17]在感染殺鮭氣單胞菌的雜交鱘中的檢測(cè)結(jié)果一致；與刁菁等[22]在感染殺鮭氣單胞菌的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中的檢測(cè)結(jié)果基本一致，其還檢測(cè)出封閉帶毒素，而本實(shí)驗(yàn)中并未檢出，推測(cè)這一差異是由于感染方式、劑量不同和菌株親緣性較遠(yuǎn)。而ser、alt、act、exu和lip同樣與氣單胞菌的致病性有著重要聯(lián)系，ser能夠幫助細(xì)菌破壞并溶解宿主蛋白，可導(dǎo)致宿主結(jié)構(gòu)損傷[23]，alt和act具有溶血性和細(xì)胞毒性，可裂解細(xì)胞和損壞組織，引發(fā)魚源出血和敗血等癥狀[24]，同時(shí)exu和lip可激活氣單胞菌的氣溶素活性，并增強(qiáng)細(xì)菌在宿主細(xì)胞中的黏附能力及降解宿主細(xì)胞成分[25]。本實(shí)驗(yàn)中，感染河川沙塘鱧的肝、鰓、脾臟和腎臟組織均出現(xiàn)了不同程度的損傷，最為嚴(yán)重的是肝臟大量出血，根據(jù)組織病理觀察發(fā)現(xiàn)部分肝細(xì)胞溶解壞死，細(xì)胞核溶解消失，推測(cè)這一現(xiàn)象由殺鮭氣單胞菌攜帶的alt和act所引起。鰓組織中，鰓小片呼吸上皮細(xì)胞腫脹變性，出現(xiàn)壞死脫落，鰓細(xì)胞排列疏松紊亂，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞空泡化，這與雜交鱘[17]感染殺鮭氣單胞菌后的組織病理變化一致。脾臟細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、空泡、壞死，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死、脫落，腎間組織細(xì)胞出現(xiàn)空泡、壞死，綜合分析推測(cè)殺鮭氣單胞菌的主要靶器官為肝臟。

3.3 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后免疫相關(guān)基因差異表達(dá)分析

本實(shí)驗(yàn)鰓組織中，MHCⅡB表達(dá)量在48 h達(dá)到峰值，上調(diào)0.84倍，MyD88、TLR和SOD表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值，分別上調(diào)1.83、1.8和1.47倍；脾臟組織中，MHCⅡB表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值，上調(diào)2.58倍 ，MyD88、TLR和SOD表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值，分別上調(diào)1.37、1.6和1.38倍；腎臟組織中，MHCⅡB、MyD88、TLR和SOD表達(dá)量均在24 h達(dá)到峰值，分別上調(diào)2.62、1.13、0.89和1.47倍，這與LIU等[4]研究發(fā)現(xiàn)河川沙塘鱧感染維氏氣單胞菌后，短時(shí)間內(nèi)相關(guān)免疫基因的表達(dá)量顯著上調(diào)的結(jié)果相似，包括MHCⅡB、SOD等。龐紀(jì)彩等[26]和鄭風(fēng)榮等[27]研究表明，MHCⅡB的特異免疫和氧化壓力成正相關(guān)，在細(xì)胞免疫和體液免疫中起著重要作用。范澤軍等[28]研究發(fā)現(xiàn)TLR負(fù)反饋機(jī)制對(duì)信號(hào)的平衡調(diào)節(jié)在抗感染免疫中起著重要作用。KAWAI等[29]研究指出MyD88是Toll樣受體信號(hào)中重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，能在信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用，還可以調(diào)控細(xì)胞因子的分泌從而影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。楊新良等[30]研究發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞吞噬細(xì)菌后會(huì)激活胞內(nèi)NADPH氧化酶，從而產(chǎn)生殺菌物質(zhì)和一系列活性氧(ROS)。但是何勤等[31]研究指出當(dāng)魚體長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，機(jī)體的免疫器官會(huì)受到不同程度的損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，最終引發(fā)疫病或死亡。LIN等[32]研究指出SOD可以清除ROS從而維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，LIU等[33]研究指出SOD清除機(jī)體的ROS能力可以作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫力的重要指標(biāo)。大西洋鮭(S.salar)感染殺鮭氣單胞菌后，其肝臟和血清SOD活性顯著提高，表明了實(shí)驗(yàn)魚感染殺鮭氣單胞菌后體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基并促進(jìn)其抗氧化酶活性的提高[34]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其結(jié)論具有相似之處。本實(shí)驗(yàn)中隨著感染時(shí)間的增加，鰓、脾臟和腎臟組織中不同免疫相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào)，大部分在24 h達(dá)到峰值，可推測(cè)河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后特異性免疫增強(qiáng)，抗感染免疫能力增強(qiáng)，適應(yīng)性免疫能力增強(qiáng)，并且體內(nèi)抗氧化酶活性明顯提高，體現(xiàn)出當(dāng)河川沙塘鱧遇到殺鮭氣單胞菌入侵時(shí)，這些基因均參與了河川沙塘鱧對(duì)殺鮭氣單胞菌的免疫應(yīng)答，通過不同免疫防護(hù)機(jī)制共同抵抗病原菌入侵從而保護(hù)機(jī)體，這些結(jié)果為進(jìn)一步了解河川沙塘鱧和殺鮭氣單胞菌的相互作用提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從患病河川沙塘鱧體內(nèi)分離獲得1株具有致病性的殺鮭氣單胞菌 G2-4-1，其對(duì)河川沙塘鱧7 d LD50為1.8×106CFU/mL，該病原菌感染可導(dǎo)致河川沙塘鱧肝臟、鰓、脾臟和腎臟不同程度的變性、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。該菌株攜帶aer、hly、exu、ser、alt、act和lip等毒力相關(guān)基因，具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明膠酶和溶血素活性，對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考等藥物敏感。