恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星在牛蛙體內(nèi)的殘留消除規(guī)律研究

董 軍，張思雨，房 迪，蘇澤輝，舒 銳，雷小婷，胡 鯤

(1.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306；2.國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(上海海洋大學(xué))，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海海洋大學(xué))，上海 201306；4.廣東省星蛙農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣東肇慶 526000)

恩諾沙星是一種具廣譜性的喹諾酮類藥物，因其具有強(qiáng)效抗菌性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用[1]。恩諾沙星在生物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為環(huán)丙沙星，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量 》(GB31650—2019)將水產(chǎn)動(dòng)物中恩諾沙星(含環(huán)丙沙星)的總殘留限量定為100 μg/kg[2]。針對(duì)魚類和甲殼類水產(chǎn)生物中恩諾沙星的藥代動(dòng)力學(xué)研究已經(jīng)有較多成果，如斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[3]、俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)[4]、石斑魚(Epinephelusspp)[5]、斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunetaus)[6]等。

牛蛙(Lithobatescatesbeiana)作為兩棲動(dòng)物，原產(chǎn)于北美洲地區(qū)，由古巴引入中國(guó)[7]。近年來牛蛙養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷增大，由2020年、2021年和2022年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)可知[8-10]，2018-2021年間蛙類養(yǎng)殖產(chǎn)量增幅為41.54%，而在追求高密度、高產(chǎn)量、高生長(zhǎng)速度的養(yǎng)殖過程中，常出現(xiàn)恩諾沙星濫用現(xiàn)象，通過中國(guó)質(zhì)量新聞網(wǎng)檢索發(fā)現(xiàn)，2021-2022年兩年檢出牛蛙產(chǎn)品中恩諾沙星超標(biāo)1 184例。足以說明近年來恩諾沙星在牛蛙養(yǎng)殖過程中的使用存在較大問題，但是至今為止，不曾有相關(guān)研究為牛蛙養(yǎng)殖過程合理使用恩諾沙星提供技術(shù)支持和科學(xué)指導(dǎo)。因此，本研究旨在探明恩諾沙星在牛蛙體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)原理與生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，并結(jié)合恩諾沙星藥效學(xué)規(guī)律推測(cè)其最大殘留限量，為其休藥期的制定和安全合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)規(guī)格為10%，購于南華千牧有限公司(獸藥GMP驗(yàn)收通過企業(yè))；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品Enrofloxacin和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品Ciprofloxacin(純度≥99.0%)，購于北京meilunbio公司；色譜純乙腈、甲醇、異丙醇均購于上海合勒化學(xué)科技有限公司，正己烷、三乙胺均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；2 mol/L、0.5 mol/L磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液購于平根科技檢測(cè)技術(shù)服務(wù)中心；肝素鈉為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó))；超聲波清洗機(jī)(D-78224 Singen/Htw，德國(guó))；水浴氮吹儀(ST-48，上海戶析實(shí)業(yè)有限公司)；電子分析天平(上海光正醫(yī)療器械有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(TG16 YQ-087，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；旋渦混合器(XW-80A，上海馳唐電子有限公司)；一次性無菌1 mL注射器(江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司)；一次性油系濾器(BS-QT-013，北京蘭杰柯科技有限公司)；0.22 μm微孔濾膜(上海吉至生化科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用牛蛙購自四川內(nèi)江市某養(yǎng)殖場(chǎng)，蛙體質(zhì)量(100±20)g。直徑100 cm、高70 cm的養(yǎng)殖缸，水深4 cm，水溫控制在25 ℃左右，準(zhǔn)備100只牛蛙，暫養(yǎng)7 d，分為給藥組和空白對(duì)照組兩組，給藥組將10%恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)用水混成勻漿，以20 mg/kg bw恩諾沙星濃度藥懸液從口灌入牛蛙體內(nèi)。所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守上海市有關(guān)動(dòng)物工作管理法規(guī)，并符合上海海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審核標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 取樣

空白組隨機(jī)取7只牛蛙作為空白對(duì)照，確定其體內(nèi)無恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留后，對(duì)各牛蛙進(jìn)行口灌給藥，分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、96、192、336、480 h對(duì)各組取樣，每次每組隨機(jī)取7只牛蛙分別進(jìn)行采樣測(cè)定，用1 mL注射器用肝素鈉抗凝劑潤(rùn)濕后，從腹壁靜脈抽取1 mL左右血液，注入用肝素鈉抗凝劑潤(rùn)濕的2 mL離心管，上下混勻后于8 000 r/min離心5 min，取上層血漿置于-20 ℃保存；同時(shí)采集肝臟、肌肉、腦和腎臟等組織，裝入5 mL離心管，置于-20 ℃保存。

1.4.2 樣品前處理

冷凍保存的樣品在室溫下自然解凍。解凍的血漿搖勻，取500 μL上清液置于2 mL離心管中，加入500 μL的甲醇，用漩渦混合儀震蕩混合2 min后，用高速冷凍離心機(jī)以13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，用1 mL注射器吸取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。肌肉、肝臟、腎臟和腦樣品室溫解凍后，稱取0.2 g樣品置于5 mL離心管中，勻漿后加入3 mL酸化乙腈(1 mol/L鹽酸 ∶乙腈=4∶500，V/V)，渦旋混勻后超聲10 min，9 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，重復(fù)提取兩次移入15 mL離心管中，于氮吹儀上40 ℃氮吹至干，用1 mL甲醇溶液溶解，超聲2 min后轉(zhuǎn)入2 mL離心管，10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，用1 mL注射器吸取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。

1.4.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸(用三乙胺調(diào)pH至2.5)=19∶81(體積比)，使用前進(jìn)行抽濾、超聲脫氣；流速1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)Ex=280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=450 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

10 mg恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品和10 mg環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品分別用流動(dòng)相0.05 mol/L磷酸溶液配置成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，放于4 ℃?zhèn)溆茫缓笠来蜗♂尀?.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，均取10 μL進(jìn)樣檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線以藥物的峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度C(μg/mL)作為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.5 回收率和精密度

取空白血液、肌肉、腎臟、腦和肝臟，添加標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，使得各組織恩諾沙星和環(huán)丙沙星藥物濃度為0.05、0.5、5 mg/kg，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行處理取得藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線和藥時(shí)曲線圖，采用DAS 3.0.5軟件分析取得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，采用WT 1.4軟件進(jìn)行分析計(jì)算休藥期。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為

恩諾沙星和環(huán)丙沙星的出峰時(shí)間分別為6.053、4.851 min，目標(biāo)藥物峰出峰明顯且尖銳，基線平穩(wěn)(圖1)。本方法可以有效地分離恩諾沙星和環(huán)丙沙星，并且與實(shí)驗(yàn)樣品中的其他色譜峰明顯分離，無干擾峰(圖2)

圖1 恩諾沙星(ENR)和環(huán)丙沙星(CIP)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(0.5μg/mL)Fig.1 Chromatograms of enrofloxacin (ENR)and ciprofloxacin (CIP)standard solutions(0.5 μg/mL)

圖2 空白色譜圖和加標(biāo)色譜圖(0.05 μg/mL)Fig.2 Blank chromatogram and spiked chromatogram (0.05 μg/mL)左為空白圖，右為加標(biāo)圖

2.2 分析方法驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)方法條件下，在0.01～20 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=229.99X-0.493 7，Y=127.27X-2.018 8，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，如圖3所示。如表1所示，各組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的平均回收率均在77.89%～124.05%，RSD<10%，且該方法檢出限為0.01 μg/mL，定量限為0.05 μg/mL，均低于歐盟(0.1 μg/mL)規(guī)定的最高殘留限量，說明本方法具有較高的精密度，適用于測(cè)定牛蛙體內(nèi)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的濃度。

表1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在各組織中回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Recovery and precision test results of Enrofloxacin and Ciprofloxacin in various tissues

圖3 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of Enrofloxacin and Ciprofloxacin

2.3 恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在牛蛙體內(nèi)的藥-時(shí)變化規(guī)律

口灌給藥后，恩諾沙星和環(huán)丙沙星在牛蛙各組織的藥-時(shí)曲線見圖4。由圖 4-①所示，血液中恩諾沙星和環(huán)丙沙星濃度在給藥后1 h同時(shí)達(dá)到峰值，分別26.592 μg/mL和2.256 μg/mL，血液中恩諾沙星隨后快速下降，給藥2 h后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，在480 h達(dá)到最低濃度0.044 μg/mL；血液中的環(huán)丙沙星濃度在給藥1～2 h快速降低后，在2～12 h再次回升達(dá)到第二個(gè)峰值1.688 μg/mL，隨后呈緩慢降低趨勢(shì)，在給藥480 h后未檢測(cè)出環(huán)丙沙星，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)血液中環(huán)丙沙星占恩諾沙星的百分比為14.42%。由圖4-②所示，在給藥后，肌肉中的恩諾沙星濃度呈快速上升趨勢(shì)，在給藥8 h達(dá)到峰值10.21 mg/kg，在8～48 h呈快速降低趨勢(shì)，48 h后恩諾沙星濃度緩慢降低，在480 h達(dá)到最低值0.037 5 mg/kg；在給藥4 h后肌肉中檢測(cè)出環(huán)丙沙星，隨后快速上升，在12 h達(dá)到峰值1.362 mg/kg，隨后呈快速降低趨勢(shì)，在給藥480 h未檢測(cè)出環(huán)丙沙星，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)肌肉中環(huán)丙沙星占恩諾沙星的百分比為10.89%。由圖4-③所示，肝臟中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星濃度0～2 h快速上升，在2 h分別達(dá)到13.63 mg/kg和8.54 mg/kg，2～4 h略有降低，在8 h達(dá)到峰值，分別為13.84 mg/kg和20.46 mg/kg，在8～48 h恩諾沙星濃度呈快速降低趨勢(shì)，48 h后呈緩慢降低趨勢(shì)，在480 h達(dá)到最低值，分別為0.81 mg/kg和0.16 mg/kg，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)肝臟中環(huán)丙沙星占恩諾沙星的百分比為82.14%。由圖4-④所示，腎臟中的恩諾沙星濃度在0～2 h呈快速上升趨勢(shì)，在2 h達(dá)到16.69 mg/kg，在2～4 h略有降低后升高，在8 h達(dá)到峰值17.52 mg/kg，在8～48 h呈快速降低趨勢(shì)，48 h呈緩慢降低趨勢(shì)，在480 h達(dá)到最低值0.29 mg/kg；腎臟在給藥0.5 h檢測(cè)出環(huán)丙沙星，環(huán)丙沙星濃度在0.5～4 h緩慢上升，4～12 h快速上升，在12 h達(dá)到峰值4.07 mg/kg，在12～96 h呈快速降低趨勢(shì)，96 h后呈緩慢降低趨勢(shì)，在480 h達(dá)到最低值0.14 mg/kg，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)腎臟中環(huán)丙沙星占恩諾沙星的百分比為14.02%。由圖4-⑤所示，腦中未檢測(cè)出環(huán)丙沙星，恩諾沙星在0.5～2 h呈緩慢上升趨勢(shì)，在2～8 h呈快速上升趨勢(shì)，在8 h達(dá)到峰值3.95 mg/kg，在8～48 h呈快速降低趨勢(shì)，48 h后呈現(xiàn)緩慢降低趨勢(shì)，在480 h達(dá)到最低值0.38 mg/kg。

圖4 牛蛙口灌給藥下血液、肌肉、肝臟、腎臟和腦的藥-時(shí)曲線Fig.4 Drug time curves of blood，muscles，liver，kidneys and brain in L.catesbeiana administered orally

如圖5所示，牛蛙血液中恩諾沙星(含環(huán)丙沙星)濃度在給藥1 h達(dá)到峰值28.85 μg/mL，1～48 h呈快速降低趨勢(shì)，48 h后呈緩慢降低趨勢(shì)，在480 h達(dá)到最低值0.044 μg/mL；而牛蛙的肌肉、肝臟、腎和腦均在給藥8 h達(dá)到峰值，分別為11.30、34.30、20.51、3.945 mg/kg，均在8～48 h呈快速降低趨勢(shì)，在48 h呈緩慢降低趨勢(shì)，均在480 h達(dá)到最低值，分別為0.037 5、0.975、0.430、0.378 mg/kg。

圖5 牛蛙口灌給藥后的恩諾沙星(含環(huán)丙沙星)的藥-時(shí)曲線Fig.5 Drug time curve of Enrofloxacin(including Ciprofloxacin) administered orally to L.catesbeiana

2.4 藥代動(dòng)力學(xué)特征

采用DAS 3.0.5房室模型的統(tǒng)計(jì)矩原理推算出恩諾沙星和環(huán)丙沙星在牛蛙體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分析其藥物動(dòng)力學(xué)特征，如表2和3所示。

表2 恩諾沙星在牛蛙體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in L.catesbeiana

表3 環(huán)丙沙星在牛蛙體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of ciprofloxacin in L.catesbeiana

恩諾沙星在牛蛙血液中的Tmax為1 h，在肌肉、腦、腎臟和肝臟中最大達(dá)峰時(shí)間均為8 h；藥物最大達(dá)峰濃度Cmax：血液>腎臟>肝臟>肌肉>腦；消除半衰期T1/2z：肝臟>腎臟>腦>血液>肌肉；總體清除率CL：血液>肌肉>腦>腎臟>肝臟；藥時(shí)曲線下面積AUC：肝臟>腎臟>肌肉>腦>血液；藥物平均保留時(shí)間MRT：肝臟>腦>腎臟>肌肉>血液。

環(huán)丙沙星最大達(dá)峰時(shí)間Tmax分別為血液1 h、肝臟為8 h、肌肉和腎臟均為12 h；藥物最大達(dá)峰濃度Cmax：肝臟>腎臟>血液>肌肉；消除半衰期T1/2z：肝臟>腎臟>血液>肌肉；總體清除率CL：血液>肌肉>腎臟>肝臟；藥時(shí)曲線下面積AUC：肝臟>腎臟>肌肉>血液；藥物平均保留時(shí)間MRT：腎臟>肌肉>血液>肝臟。

2.5 肌肉組織最大殘留限量和休藥期

由于牛蛙的肌肉是主要的可食用部位，因此把肌肉作為藥物殘留的靶組織，對(duì)肌肉組織的恩諾沙星和其代謝物環(huán)丙沙星的藥-時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，以100 μg/kg為殘留標(biāo)準(zhǔn)，通過WT1.4軟件進(jìn)行處理分析，結(jié)果如圖6所示，恩諾沙星(含環(huán)丙沙星)在肌肉中的殘留濃度在514.24 h達(dá)到殘留標(biāo)準(zhǔn)100 μg/kg。

圖6 肌肉中恩諾沙星(含環(huán)丙沙星)濃度—時(shí)間關(guān)系曲線Fig.6 Concentration time relationship curve of enrofloxacin(including ciprofloxacin)in muscle

3 討論

3.1 恩諾沙星在牛蛙體內(nèi)的代謝規(guī)律

Tmax是評(píng)價(jià)藥物在生物體內(nèi)吸收速率的重要參數(shù)。恩諾沙星在牛蛙血液Tmax為1 h，肌肉、肝臟、腎臟和腦Tmax均為8 h，說明與其他組織相比，牛蛙血液對(duì)恩諾沙星吸收速率最快，最早達(dá)到峰值，這一結(jié)果與鯽魚(Carassiusauratus)[11]、羅非魚(Oreochromismossambicus)[12]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[13]體內(nèi)恩諾沙星在血液中吸收速率較其他組織快的結(jié)論一致，即恩諾沙星最先進(jìn)入牛蛙血液，通過血液運(yùn)輸至各個(gè)組織。其中，恩諾沙星在牛蛙的肝臟、腎臟均在2 h、8 h出現(xiàn)兩次濃度高峰，即雙峰現(xiàn)象，與異育銀鯽(C.gibel)[14]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[15]變化規(guī)律相似，推測(cè)牛蛙體內(nèi)存在相同的肝腸循環(huán)現(xiàn)象。

AUC(0-∞)是表示生物體各組織對(duì)藥物吸收和藥物分布量大小，決定生物利用度的參數(shù)[16]。牛蛙各組織的恩諾沙星AUC(0-∞)：肝臟>腎臟>肌肉>腦>血液，其中肝臟、腎臟的AUC(0-∞)分別為：1 337.61、821.75(μg·h)/mL，肝臟對(duì)恩諾沙星的吸收量是血液吸收量的6.46倍，腎臟對(duì)恩諾沙星的吸收量是血液吸收量的3.97倍，說明牛蛙各組織對(duì)恩諾沙星的利用能力有較大差別，其中肝臟、腎臟對(duì)恩諾沙星的利用率較高，恩諾沙星在肝臟和腎臟中分布廣，與雜交鱘(施氏鱘Acipenserschrenckii♂×達(dá)氏鰉Husodauricus♀)[17]、紅笛鯛(Lutjanuserythropterus)[18]體內(nèi)恩諾沙星的分布結(jié)論相似，且符合藥物經(jīng)由肝臟代謝、通過腎臟排泄的理論[19]。

消除半衰期T1/2z是表現(xiàn)藥物在生物體內(nèi)消除快慢的主要參數(shù)。恩諾沙星在牛蛙各組織中的消除半衰期T1/2z：肝臟(459.88 h)>腎臟(206.33 h)>腦(179.70 h)>血液(161.05 h)>肌肉(94.07 h)，說明恩諾沙星在牛蛙肌肉中的消除速率最快，與牙鲆(Paralichthyslethostigma)(67.76 h)[20]、雜交鱘(114.90 h)[17]消除速率最快的結(jié)論一致。

3.2 環(huán)丙沙星在牛蛙體內(nèi)的代謝規(guī)律

實(shí)驗(yàn)中使用的10%恩諾沙星粉劑(水產(chǎn)用)在前期測(cè)定并未檢測(cè)出環(huán)丙沙星，而在0.5 h時(shí)，在血液和肝臟中檢測(cè)出環(huán)丙沙星含量分別為0.872、0.516 mg/kg，由于血液主要起到循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，而腎臟、肌肉和腦在0.5 h并未檢出環(huán)丙沙星，因此說明血液中的環(huán)丙沙星為肝臟代謝恩諾沙星的產(chǎn)物[21]。而腎臟和肌肉分別在1、8 h檢測(cè)出環(huán)丙沙星，推測(cè)檢測(cè)出的環(huán)丙沙星主要為肝臟代謝經(jīng)由血液轉(zhuǎn)運(yùn)蓄積在腎和肌肉中，其中腎臟作為牛蛙主要的恩諾沙星排泄器官[22]，并不直接參與恩諾沙星代謝為環(huán)丙沙星的過程，由于環(huán)丙沙星具有較強(qiáng)的親脂性，因而磷脂含量高的腎臟較脂質(zhì)少的肌肉，對(duì)環(huán)丙沙星的蓄積能力更強(qiáng)，更早檢測(cè)出環(huán)丙沙星[23]。

環(huán)丙沙星在牛蛙血液、肌肉、腎臟和肝臟中的Cmax分別為2.26、1.36、4.07和20.46 mg/kg，其中肝臟的環(huán)丙沙星含量最高，說明牛蛙肝臟具有較豐富的代謝酶，具有較強(qiáng)的去乙基代謝能力，是牛蛙主要的恩諾沙星代謝場(chǎng)所[21]。恩諾沙星進(jìn)入水生動(dòng)物體內(nèi)，主要以原藥形式存在[22、26]，環(huán)丙沙星與恩諾沙星AUC(0-∞)比值如羅非魚(肝：5.98%)[12]、中華草龜(Chinemysreevesiis)(血液：6.1%)[27]、鰻鱺(Anguillajaponica)(血液：9.9%、肌肉：5.54%、肝臟：40.3%)[28]等，但由于水生動(dòng)物種群差異性和養(yǎng)殖環(huán)境不同，恩諾沙星代謝水平不同，如俄羅斯鱘(血漿：51.6%、肝臟22.6%、腎臟27.4%、肌肉16.7%)[4]，而本實(shí)驗(yàn)中牛蛙血液、肌肉、腎臟和肝臟的環(huán)丙沙星與恩諾沙星AUC(0-∞)比值分別為：39.60%、21.90%、40.35%和37.31%，推測(cè)牛蛙作為兩棲動(dòng)物，且其養(yǎng)殖環(huán)境為水陸并存，導(dǎo)致其恩諾沙星代謝能力比水生動(dòng)物強(qiáng)，與陸生動(dòng)物相似[29、30]。環(huán)丙沙星在血液、肌肉和腎臟中的平均保留時(shí)間MRT(0-∞)：83.43、84.58、187.95 h，和恩諾沙星在血液、肌肉和腎臟中的平均保留時(shí)間MRT(0-∞)：90.48、79.03、167.26 h相近，但是牛蛙肝臟中恩諾沙星平均保留時(shí)間MRT(0-∞)：550.18 h是環(huán)丙沙星平均保留時(shí)間MRT(0-∞)：82.67 h的6.65倍，恩諾沙星在牛蛙肝臟中保留時(shí)間最長(zhǎng)，并且肝臟中環(huán)丙沙星含量也最高但保留時(shí)間短，進(jìn)一步說明牛蛙主要利用肝臟將恩諾沙星轉(zhuǎn)化為環(huán)丙沙星排出體外，與虹鱒類似[15]。

牛蛙的腦中可檢測(cè)出低濃度的恩諾沙星(Cmax：3.95 mg/kg)，血液中恩諾沙星(Cmax：26.59 mg/kg)為其6.73倍，說明恩諾沙星可突破牛蛙的血腦屏障，但是透過性較差，與魚類不同[12]，而牛蛙腦中未檢測(cè)出環(huán)丙沙星，推測(cè)牛蛙腦部不含恩諾沙星轉(zhuǎn)為環(huán)丙沙星的酶，且環(huán)丙沙星不易透過牛蛙的血腦屏障。環(huán)丙沙星的消除半衰期T1/2z：肝臟(164.80 h)>腎臟(137.48 h)>血液(104.35 h)>肌肉(65.62 h)，牛蛙肌肉中的環(huán)丙沙星消除速率最快，與其恩諾沙星消除規(guī)律一致，且與25 ℃溫度下的克氏原螯蝦具有相同的消除規(guī)律[31]，并且與恩諾沙星相比，環(huán)丙沙星更易消除，各組織的消除半衰期都更短，與羅非魚的消除規(guī)律相反[12]。

3.3 恩諾沙星在牛蛙肌肉中的最大殘留限量

根據(jù)FAO/WHO下屬的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)的評(píng)估結(jié)果[32]，恩諾沙星的ADI(每日安全攝取量)為0～2 μg/kg·bw，以60 kg成人計(jì)算，即每人每日安全攝取量為120 μg，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中恩諾沙星拌飼投喂10～20 mg/kg，在高劑量(20 mg/kg)的條件下牛蛙肌肉中恩諾沙星占總殘留量的90.18%，其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星占總殘留量的9.82%，因此根據(jù)《動(dòng)物性食品中獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)規(guī)范(試行)》，結(jié)合食物消費(fèi)系數(shù)確定恩諾沙星MRL，即恩諾沙星MRL牛蛙(肌肉)=120×90.18%=108.22 (μg/kg)，取整之后為100 μg/kg，該結(jié)論與《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650-2019)規(guī)定的恩諾沙星(含環(huán)丙沙星)的最大殘留限量≤100 μg/kg[2]一致。

3.4 恩諾沙星的給藥方案

牛蛙主要致病菌嗜水氣單胞菌[33]，恩諾沙星對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC為0.25 μg/mL[34]，從同批病蛙中提取出的嗜水氣單胞菌，測(cè)得恩諾沙星的MIC為0.1 μg/mL，而牛蛙單次口灌10%恩諾沙星粉混懸液(20 mg/kg bw)，血液中恩諾沙星在192 h后低于0.1 μg/mL，肌肉中的恩諾沙星在336 h后低于0.1 μg/mL，并且恩諾沙星(含環(huán)丙沙星)的最大殘留限量≤0.1 mg/kg，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得低于0.1 μg/mL的時(shí)間(即休藥期時(shí)間)為514.24 h，因此在本實(shí)驗(yàn)劑量(20 mg/kg bw)下的恩諾沙星藥劑濃度適用于治療由于嗜水氣單胞菌致病的病蛙，且能夠在休藥期內(nèi)保持牛蛙健康。