黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾的藥效學(xué)及安全性臨床評(píng)價(jià)

程安達(dá)，艾曉輝，于 江，楊移斌

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102600；3.赤峰市農(nóng)牧業(yè)綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古赤峰 024000)

黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)是從黃芪植物的根部提取的多糖成分，包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等，具有免疫調(diào)節(jié)作用[10]，能夠廣泛提高機(jī)體免疫功能，而其同時(shí)又具備自然資源豐富、價(jià)格低廉、毒性弱及無(wú)殘留等優(yōu)勢(shì)[11]，因此常作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于醫(yī)療、畜牧行業(yè)。目前，很多研究顯示，黃芪多糖可以有效激活水生動(dòng)物如中華鱉(Pelodiscussinensis)、雜交鱧(Channamaculate♀×Channaargus♂)及齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)等[12-14]非特異性免疫，增強(qiáng)其抗感染能力。因此，本研究擬開展黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾的藥效學(xué)及安全性臨床評(píng)價(jià)，為其在斑點(diǎn)叉尾中的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)藥物：黃芪多糖(APS)，由愛迪森(北京)生物科技有限公司提供，獸藥生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字(2009)010125236，生產(chǎn)批號(hào)：1108071；含量：每1 g含黃芪多糖應(yīng)不少于450 mg。

對(duì)照藥物：芪參散(Qishen San，Qs)，購(gòu)自成都通威三新藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字(2007)220309219 ，生產(chǎn)批號(hào)：11071502。

1.2 方法

1.2.1 含黃芪多糖和芪參散飼料的制作

按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的劑量準(zhǔn)確稱取各組試驗(yàn)和對(duì)照藥物，分別加入到適量潔凈水中，用玻璃棒攪拌混合均勻，轉(zhuǎn)移至小型噴壺中；稱取正常斑點(diǎn)叉尾膨化顆粒飼料(武漢通威股份有限公司提供)，均勻鋪在預(yù)先準(zhǔn)備好的塑料薄膜上，使飼料在塑料薄膜上呈薄薄的一層。將配制好的藥液噴灑在飼料表面，并充分混勻，在陰涼避光處風(fēng)干；將制作好的藥飼每組分成7等份，4 ℃冰箱中保存，待試驗(yàn)魚馴化至吃食正常后每4 d使用1份。

1.2.2 II期臨床實(shí)驗(yàn)

(1)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

將馴養(yǎng)1周體質(zhì)量(20.00±0.56)g的規(guī)格一致、體格健壯、采食活躍、無(wú)病無(wú)傷的斑點(diǎn)叉尾隨機(jī)分為6個(gè)組，即空白對(duì)照組、對(duì)照藥物組和4個(gè)劑量試驗(yàn)組，每組各設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾。空白組對(duì)照組投喂正常日糧，對(duì)照藥物組投喂添加芪參散(1 kg魚體重添加0.1g)的日糧，試驗(yàn)組按每千克魚體重添加5、10、20及40 mg黃芪多糖。試驗(yàn)周期為28 d，每天投喂2次，每次按魚體重3%～5%進(jìn)行投喂。

(2)血樣采集

對(duì)照組和試驗(yàn)組連續(xù)投喂7 d，在第7、14、21、28 d進(jìn)行尾靜脈采血，取樣時(shí)分別從各組隨機(jī)取3尾魚，從尾靜脈取血。將所得的血液分為2份，其中1份以1%肝素抗凝，用于血液白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定，另1份于4 ℃條件下以4 000 r/min離心10 min，收集血清，用于測(cè)定血清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)。

(3)吞噬原準(zhǔn)備及白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定

將華中農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)接種在FWA培養(yǎng)基(淡水魚類瓊脂)中，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，2 500 r/min離心5 min集菌，然后在金黃色葡萄球菌菌液中加入終濃度為0.5%的福爾馬林，37 ℃下滅活24 h。經(jīng)過平皿法證實(shí)此菌已被徹底滅活，用滅菌生理鹽水清洗3次，并調(diào)成濃度為1.0×105CFU/mL的菌懸液，即為福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌菌體(formalin killedS.aureus，F(xiàn)-SA)，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

血液白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定參照陳昌福等[15]的方法并加以改進(jìn)。即將0.2 mL抗凝血加入約0.l mL的金黃色葡萄球菌懸液，充分混勻后置于28 ℃下水浴，孵育45 min。水浴期間每隔10 min搖勻1次。用吸管吸取血細(xì)胞涂片，每個(gè)血樣涂5片。自然晾干后，滴加甲醇固定3 min，蒸餾水沖洗，瑞士-吉姆薩混合染色5～10 min，迅速用蒸餾水沖洗，晾干。油鏡觀察，按下式分別計(jì)算吞噬百分比和吞噬指數(shù)：

吞噬百分比(PP)=(100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100)×100%

吞噬指數(shù)(PI)=吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)/參與吞噬的吞噬細(xì)胞數(shù)

(4)血清相關(guān)酶指標(biāo)測(cè)定

血清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)和溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)的測(cè)定所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所，嚴(yán)格按照其說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3 III期臨床試驗(yàn)

(1)試驗(yàn)地點(diǎn)與試驗(yàn)分組

分別選擇湖北省仙桃市龍華山辦事處付光明養(yǎng)殖場(chǎng)的4個(gè)池塘及湖北省宜都市青林寺清江名優(yōu)魚專業(yè)合作社4個(gè)網(wǎng)箱用于試驗(yàn)，4個(gè)池塘及4個(gè)網(wǎng)箱的位置、面積、環(huán)境條件基本相似，分別命名為1#、2#、3#及4#與。每個(gè)試驗(yàn)池或網(wǎng)箱相對(duì)獨(dú)立，1#、2#設(shè)為對(duì)照藥物組(芪參散，每日按100 mg/kg魚體重的劑量拌飼投喂)，3#、4#設(shè)為推薦劑量組(黃芪多糖，每日按20 mg/kg魚體重的劑量拌飼投喂)，其它未用藥池塘或網(wǎng)箱為自然的空白對(duì)照組。池塘面積皆為7 333 m2，水深1.4～1.5 m；試驗(yàn)期間測(cè)得各試驗(yàn)池的水溫22～26 ℃、溶解氧≥5 mg/L、pH 6.8～7.0、氨氮≤0.05 mg/L、亞硝酸鹽≤0.05 mg/L。4口池塘皆主養(yǎng)斑點(diǎn)叉尾1齡魚種，每池投放魚種12 萬(wàn)尾，平均體重25 g/尾，規(guī)格整齊，無(wú)病無(wú)傷。

網(wǎng)箱面積皆為4 m×5 m，深3.5 m；試驗(yàn)期間測(cè)得各試驗(yàn)水體的水溫18～22 ℃、溶解氧≥5 mg/L、pH 7.0～7.2、氨氮<0.05 mg/L、亞硝酸鹽<0.05 mg/L。4只網(wǎng)箱皆單養(yǎng)斑點(diǎn)叉尾1齡魚種，每池投放魚種2 000 尾，平均體重50 g/尾，規(guī)格整齊，無(wú)病無(wú)傷。

兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)每組均每天早上9：00 和下午16：00分別飼喂一次，每日按體重的3%～5%進(jìn)行投喂，以飽食為準(zhǔn)。

(2)觀察指標(biāo)

各組投喂7 d后停止喂食，并連續(xù)觀察至15 d。記錄每天各組受試斑點(diǎn)叉尾的采食量、應(yīng)激、活動(dòng)狀態(tài)、癥狀等，在第15 d抽樣測(cè)定血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)、溶菌酶(LSZ)、堿性磷酸酶(AKP)，取樣及測(cè)定方法與1.2.1(4)所述一致，記錄每天的死亡數(shù)。

(3)生產(chǎn)性能指標(biāo)

試驗(yàn)開始時(shí)抽取30 尾魚測(cè)量初體重，試驗(yàn)結(jié)束后抽取30尾魚測(cè)定末體重，并計(jì)算生產(chǎn)性能。

增重(WG)=FW-IW

增重率(WGR)= WG/IW×100%

特定生長(zhǎng)率(SGR)=(lnFW-lnIW)/t×100%

注：IW：初體重，F(xiàn)W：末體重，t：養(yǎng)殖時(shí)間。

(4)攻毒試驗(yàn)

病原菌的準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)所用的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)購(gòu)自中科院水生生物研究所，將菌株接種在TSB培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)24 h后，5 000 r/min離心10 min收集菌體。用0.15 mol/L滅菌生理鹽水稀釋菌體至液體培養(yǎng)原體積，活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度，用滅菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)至為1.0×108CFU/mL，將菌液保存于4 ℃冰箱。

免疫保護(hù)率RPS=[1-(試驗(yàn)魚死亡率/對(duì)照魚死亡率)]×100%

1.2.4 安全性評(píng)估

(1)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及觀察

將馴養(yǎng)1周的規(guī)格一致、體格健壯、采食活躍、無(wú)病無(wú)傷的斑點(diǎn)叉尾隨機(jī)分為4個(gè)組，即空白對(duì)照組、推薦劑量組(1倍)、3倍推薦劑量組、5倍推薦劑量組，空白組投喂正常日糧，試驗(yàn)組按劑量添加黃芪多糖，用藥21 d。每個(gè)濃度各設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾。觀察和記錄斑點(diǎn)叉尾的一般健康情況、中毒表現(xiàn)和死亡過程，包括呼吸頻率、外觀體征、行為活動(dòng)、攝食量等。測(cè)定并記錄試驗(yàn)前及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)動(dòng)物體重。用藥停止后4 h(0 d)和第21天進(jìn)行斑點(diǎn)叉尾血液生理指標(biāo)、血液生化指標(biāo)取樣檢驗(yàn)。血液樣品采集使用一次性無(wú)菌注射器尾靜脈抽血，注入添加1%肝素鈉的采血管中，取全血用貝克曼Coulter LH750全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定，血液生化指標(biāo)采用日本Sysmex，Chenix-180 多功能生化分析儀。血液生理檢測(cè)參數(shù)主要有血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞數(shù)(WBC)、白細(xì)胞數(shù)(HTC)、血小板數(shù)(PLT)等；血液生化檢測(cè)參數(shù)有總膽固醇(TCH)、肌酐(CRE)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、血清總蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)及血清尿素氮(BUN)等。

(2)剖檢和組織病理學(xué)檢查

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行方差分析、顯著性及相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著，P< 0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 研究結(jié)果

2.1 II期臨床試驗(yàn)研究

由圖1可知，在7、14、21 d添加5 mg/kg黃芪多糖對(duì)白細(xì)胞吞噬百分率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)差異不顯著；添加10 mg/kg黃芪多糖的實(shí)驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)白細(xì)胞吞噬百分率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)差異顯著高于空白對(duì)照組；添加20、40 mg/kg黃芪多糖的實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)對(duì)白細(xì)胞吞噬百分率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)差異極顯著高于空白對(duì)照組。添加10、20、40 mg/kg黃芪多糖的實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照藥物組相比，差異不顯著。

圖1 不同劑量黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾血液中白細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.1 Effect of each group of drugs on leukocyte phagocytosis activity in blood of I.punctatus

由圖2A可知，添加黃芪多糖的四個(gè)實(shí)驗(yàn)組總超氧化物歧化酶的活力都高于空白對(duì)照組，其中，實(shí)驗(yàn)至第7、28天時(shí)，添加10、20和40 mg/kg組T-SOD活力與空白對(duì)照組相比差異顯著；除添加5 mg/kg組T-SOD活力比對(duì)照藥物組低以外，其余三個(gè)實(shí)驗(yàn)組T-SOD活力與對(duì)照藥物組相比差異不顯著。

圖2 黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾血清總超氧化物歧化酶T-SOD、過氧化氫酶CAT和溶菌酶LSZ、酸性磷酸酶ACP和堿性磷酸酶AKP活力的影響Fig.2 Effect of APS on the activities of total superoxide dismutase，catalase，lysozyme，acid phosphatase and alkaline phosphatase in serum of I.punctatus

由圖2B可知，添加黃芪多糖的四個(gè)實(shí)驗(yàn)組除5 mg/kg組外，其余三個(gè)實(shí)驗(yàn)組過氧化氫酶CAT的活力都高于空白對(duì)照組，其中，添加10 mg/kg實(shí)驗(yàn)組在第21天，其CAT活力與空白對(duì)照組相比，差異顯著，添加20 mg/kg實(shí)驗(yàn)組在第7、14、21、28天，其CAT活力與空白對(duì)照組相比，差異均極顯著，添加5 mg/kg組CAT活力比對(duì)照藥物組低，其余三個(gè)實(shí)驗(yàn)組CAT活力與對(duì)照藥物組相比差異不顯著。

由圖2C可知，四個(gè)黃芪多糖添加組溶菌酶活力都比空白對(duì)照組有不同程度的提高，實(shí)驗(yàn)至第21天以后各組溶菌酶的活力比第14天前有所提高。實(shí)驗(yàn)至第21、28天時(shí)，添加10 mg/kg和20 mg/kg兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組LSZ活力與空白對(duì)照組相比，差異均極顯著，四個(gè)實(shí)驗(yàn)組LSZ活力與對(duì)照藥物組相比差異不顯著。

由圖2E可知，飼料中添加不同劑量的黃芪多糖在一定程度上提高了斑點(diǎn)叉尾血清堿性磷酸酶的活力，且同一組堿性磷酸酶的活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，至用藥后第21天時(shí)達(dá)到最大，隨后稍微有所降低。至第21天時(shí)，添加量為20 mg/kg實(shí)驗(yàn)組AKP活力與空白對(duì)照組相比差異顯著，除添加量為5 mg/kg實(shí)驗(yàn)組AKP活力比對(duì)照藥物組低以外，添加量為10、20和40 mg/kg 三個(gè)實(shí)驗(yàn)組AKP活力與對(duì)照藥物組相比差異均不顯著。

2.2 III期臨床試驗(yàn)研究

表1 黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾T-SOD、LSZ及AKP活性的影響Tab.1 Effect of APS on T-SOD，LSZ and AKP activities of I.punctatus

表1 黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾T-SOD、LSZ及AKP活性的影響Tab.1 Effect of APS on T-SOD，LSZ and AKP activities of I.punctatus

試驗(yàn)地點(diǎn)組別T-SODLSZAKP空白對(duì)照組72.53±1.723.22±0.4335.30±2.75仙桃市付光明養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)照藥物組90.67±1.13*4.08±0.15*38.12±3.10*推薦劑量組97.79±0.92*4.11±0.12*39.33±1.91*空白對(duì)照組74.30±1.613.39±0.4234.39±2.36宜都市廖斌遠(yuǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)照藥物組93.58±1.28*4.30±0.24*38.12±0.97*推薦劑量組100.71±1.63*4.58±0.61*38.56±1.96*

注：*表示P< 0.05，差異顯著。

由表2可見，與空白對(duì)照組相比，黃芪多糖推薦劑量組和芪參散對(duì)照藥物組都可以提高斑點(diǎn)叉尾的增重率和特定生長(zhǎng)率，其中，推薦劑量組提高斑點(diǎn)叉尾的增重率和特定生長(zhǎng)率差異顯著。

表2 黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Effect of APS on growth performance of I.punctatus

表2 黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Effect of APS on growth performance of I.punctatus

試驗(yàn)地點(diǎn)組別初始尾重/g終末尾重/g增重率/%特定生長(zhǎng)率/(%/d)空白對(duì)照組25.36±8.9031.45±7.3224.01±0.121.00±0.12仙桃市付光明養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)照藥物組25.83±8.7833.52±7.6029.77±0.231.18±0.21推薦劑量組24.91±7.9233.95±7.8336.29±0.12*1.41±0.11*空白對(duì)照組50.56±11.3856.68±10.6412.10±0.110.55±0.23湖北省宜都市青林寺清江名優(yōu)魚專業(yè)合作社對(duì)照藥物組50.12±10.6358.95±9.6117.62±0.360.77±0.14推薦劑量組50.42±10.8060.24±9.8619.47±0.12*0.82±0.13*

注：*表示P< 0.05，差異顯著。

從表3可知，在仙桃市付光明養(yǎng)殖場(chǎng)，黃芪多糖推薦劑量組免疫保護(hù)率達(dá)到88.9%，高于對(duì)照藥物組；在湖北省宜都市青林寺清江名優(yōu)魚專業(yè)合作社，黃芪多糖推薦劑量組免疫保護(hù)率達(dá)到84.2%，也高于對(duì)照藥物組。結(jié)果表明，在飼料中按每日20 mg/kg魚體重的劑量添加黃芪多糖，可以提高斑點(diǎn)叉尾的免疫力。

表3 黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾的免疫保護(hù)率Tab.3 Immune protection rate of APS on I.punctatus

表3 黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾的免疫保護(hù)率Tab.3 Immune protection rate of APS on I.punctatus

試驗(yàn)地點(diǎn)組別死亡數(shù)免疫保護(hù)率/%空白對(duì)照組18/仙桃市付光明養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)照藥物組477.8%*推薦劑量組288.9%*空白對(duì)照組19/湖北省宜都市青林寺清江名優(yōu)魚專業(yè)合作社對(duì)照藥物組573.7%*推薦劑量組384.2%*

注：*表示P< 0.05，差異顯著。

2.3 安全性研究

2.3.1 臨床觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間，4個(gè)組實(shí)驗(yàn)魚均未出現(xiàn)死亡，體格健壯、采食活躍、呼吸正常。魚體重結(jié)果如表4可知推薦劑量組魚體重增加顯著高于其他劑量組和對(duì)照組。隨著劑量倍數(shù)的增加，魚體重增長(zhǎng)趨緩，低于空白對(duì)照組。

表4 飼喂黃芪多糖的斑點(diǎn)叉尾體質(zhì)量Tab.4 Weight of I.punctatus after feeding APS

表4 飼喂黃芪多糖的斑點(diǎn)叉尾體質(zhì)量Tab.4 Weight of I.punctatus after feeding APS

分組0 d體質(zhì)量/g21d體質(zhì)量/g對(duì)照組54.67±16.9260.84±13.60推薦劑量54.33±17.6266.01±19.01*3倍劑量55.11±14.2659.21±10.315倍劑量54.36±17.6657.42±12.80

2.3.2 血液生理指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果

由表5可見，與空白對(duì)照組相比，在停藥后0 d和21 d，推薦劑量組斑點(diǎn)叉尾HGB、WBC、HCT和PLT都有一定增加，但都屬于正常范圍；3倍推薦劑量組斑點(diǎn)叉尾血液HGB、WBC、HCT和PLT有增有減，差異不顯著；5倍推薦劑量組斑點(diǎn)叉尾HGB、WBC、HCT和PLT都有一定減少，但均在正常范圍內(nèi)[16]。

表5 添加黃芪多糖后斑點(diǎn)叉尾血液生理指標(biāo)變化情況Tab.5 Changes of blood physiological indexes of I.punctatus after adding APS

表5 添加黃芪多糖后斑點(diǎn)叉尾血液生理指標(biāo)變化情況Tab.5 Changes of blood physiological indexes of I.punctatus after adding APS

組別采樣時(shí)間HGB/(1012/L)WBC/(109/L)HCT/(g/L)PLT/(109/L)空白對(duì)照組0 d2.48±0.096223.65±10.74125.18±3.9424.80±5.3821 d2.52±0.17225.84±5.64126.76±3.6524.81±3.18推薦劑量組0 d2.65±0.30230.25±5.56129.68±2.0928.61±2.1021 d2.75±0.11238.81±7.83128.28±2.2230.15±2.063倍劑量組0 d2.35±0.21220.72±5.68114.07±3.7523.86±1.3121 d2.38±0.25224.50±5.80127.07±3.7522.91±1.485倍劑量組0 d2.26±0.08218.35±16.13110.52±2.8121.33±1.2521 d2.24±0.05213.78±18.07107.93±2.9720.38±0.61

2.3.3 血液生化指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果

由表6可見，推薦劑量組和3倍推薦劑量組血清ALT、AST、AKP活性與對(duì)照組相比，差異不顯著；5倍推薦劑量組血清ALT、AST、AKP 活性在0d和21d都比對(duì)照組有一定提高，但差異不顯著，表明添加推薦劑量和3倍推薦劑量的黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾肝細(xì)胞無(wú)影響，而5倍推薦劑量對(duì)斑點(diǎn)叉尾肝細(xì)胞有一定影響，但不顯著。各試驗(yàn)組的ALB、TP、TCH與對(duì)照組相比，差異都不顯著，表明各添加劑量對(duì)斑點(diǎn)叉尾肝功能無(wú)明顯影響。推薦劑量組和3倍推薦劑量組BUN、CRE與對(duì)照組相比，差異不顯著；5倍推薦劑量組CRE在0d和21d都比對(duì)照組有一定提高，但差異不顯著，表明添加推薦劑量和3倍推薦劑量的黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾腎功能無(wú)影響，而5倍推薦劑量對(duì)斑點(diǎn)叉尾腎功能有一定影響，但不明顯。

表6 添加黃芪多糖后斑點(diǎn)叉尾血液生化指標(biāo)變化情況Tab.6 Changes of blood biochemical indexes of I.punctatus after adding APS

表6 添加黃芪多糖后斑點(diǎn)叉尾血液生化指標(biāo)變化情況Tab.6 Changes of blood biochemical indexes of I.punctatus after adding APS

組別采樣時(shí)間AST/(U/L)ALT/(U/L)AKP/(金氏單位/100mL)BUN/(mmol/L)CRE/(μmol/L)TCH/(mmol/L)ALB/(g/L)TP/(g/L)空白對(duì)照組0 d147.00±12.1619.00±0.0029.33±2.080.80±0.1312.00±1.739.35±0.0911.00±0.0029.33±0.5821 d158.67±14.6416.00±1.0042.67±5.861.05±0.0912.33±1.536.08±0.429.00±0.0028.00±2.00推薦劑量組0 d144.35±9.6218.12±2.0529.85±2.310.75±0.1211.63±1.287.35±0.1611.43±0.6829.96±0.8721 d140.67±18.6113.67±0.5845.00±6.080.79±0.05613.67±2.525.89±0.429.00±1.0025.67±0.583倍劑量組0 d149.77±10.0318.95±1.5631.52±1.970.97±0.1112.88±2.548.63±1.5410.38±0.7227.81±1.5721 d169.67±22.9016.33±1.5353.33±2.521.02±0.06413.00±3.608.27±1.369.67±0.5828.00±0.005倍劑量組0 d153.12±11.3420.48±0.8334.26±2.130.88±0.3414.65±1.189.17±2.7110.88±0.9327.13±2.5521 d180.33±22.1417.67±1.5342.86±4.581.06±0.1115.33±2.089.01±2.0410.00±0.0028.00±0.00

2.3.4 剖檢和組織病理學(xué)檢查結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中無(wú)死亡個(gè)體，解剖后未見明顯組織形態(tài)異常，經(jīng)制作石蠟切片染色也未發(fā)現(xiàn)重要免疫器官頭腎及脾臟出現(xiàn)病理變化，如圖3所示。

圖3 不同劑量的黃芪多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾頭腎及脾臟的組織病理學(xué)影響Fig.3 Histopathological effect on head kidney and spleen of I.punctatus with different doses of APS

3 討論

目前，關(guān)于黃芪多糖對(duì)水生動(dòng)物生長(zhǎng)的影響研究較多。向梟等[14]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖添加水平為0.04%時(shí)，齊口裂腹魚的增重率(WGR)、特定生長(zhǎng)率(SGR)、飼料蛋白效率(PER)均達(dá)到最大；孫永欣等[17]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可明顯提高刺參特定生長(zhǎng)率(SGR)，與對(duì)照組相比增加了20.94%；黃玉章等[18]發(fā)現(xiàn)各個(gè)階段黃芪多糖添加組奧尼羅非魚的絕對(duì)增重量都比對(duì)照組有所提高；楊移斌等[12]也曾研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對(duì)中華鱉生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。以上研究結(jié)果均與本研究中飼喂黃芪多糖可提高斑點(diǎn)叉尾增重率及特定生長(zhǎng)率結(jié)果一致。究其原因可能因?yàn)辄S芪多糖中含有較多的活性物質(zhì)，可在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞代謝合成[19]，同時(shí)也在一定程度上可加強(qiáng)動(dòng)物胃液分泌及食物消化，參與機(jī)體的物質(zhì)代謝過程，促進(jìn)腸道益生菌繁殖，加強(qiáng)消化酶分泌，提高動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化及蛋白質(zhì)合成能力，從而提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度[20，21]。

非特異性免疫是機(jī)體抗感染的重要屏障，而總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)及白細(xì)胞吞噬活性等指標(biāo)是衡量機(jī)體非特異性免疫的重要指標(biāo)。通過II期及III期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可明顯提高斑點(diǎn)叉尾以上指標(biāo)，以添加量為20 mg/kg魚體重最優(yōu)，故也可提高機(jī)體抗細(xì)菌感染的能力，這與黃芪多糖可提高雜交鱧抗嗜水氣單胞菌感染的能力研究結(jié)果一致[12]。以往研究也顯示黃芪多糖添加水平為0.04%時(shí)，齊口裂腹魚堿性磷酸酶(ALP)活性最高，酸性磷酸酶(ACP)活性在黃芪多糖添加水平0.06%時(shí)最大[14]，在雜交鱧、黃顙魚及鯉中均得到類似研究結(jié)果[12，22，23]。另外，隨黃芪多糖添加水平的升高，黃顙魚吞噬百分比與吞噬指數(shù)顯著上升(P<0.05)[22]，也與本研究結(jié)果一致。曹麗萍等[24]利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了黃芪多糖作用于魚類頭腎巨噬細(xì)胞后IL-1β的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其明顯上調(diào)，表明黃芪多糖可誘導(dǎo)IL-1β的表達(dá)，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力，但黃芪多糖調(diào)節(jié)魚類免疫機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

目前關(guān)于黃芪多糖對(duì)動(dòng)物安全性研究不多，僅見昭日格圖等[25]利用黃芪多糖飼喂大鼠30d，發(fā)現(xiàn)5.00、2.50和1.25 g/kg 體重劑量均沒有對(duì)動(dòng)物的身體、臟器的生長(zhǎng)發(fā)育及血液生化指標(biāo)等產(chǎn)生明顯的影響。研究也發(fā)現(xiàn)飼喂50 mg/kg魚體的黃芪多糖，草魚的血常規(guī)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，而且草魚肝、腎、脾細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)上也無(wú)異常[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)每日按20 mg/kg魚體重投喂黃芪多糖不會(huì)對(duì)斑點(diǎn)叉尾產(chǎn)生毒性作用，即黃芪多糖安全性較好，具備作為水產(chǎn)免疫增強(qiáng)劑的條件。

4 結(jié)論

飼料中添加不同劑量的黃芪多糖在一定程度上可以提高斑點(diǎn)叉尾血液中吞噬百分比(PP)、吞噬指數(shù)(PI)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)等各項(xiàng)免疫指標(biāo)值，且效果優(yōu)于芪參散。每日以20 mg/kg魚體重為最優(yōu)添加劑量。

在實(shí)際生產(chǎn)條件下，在飼料中按每日20 mg/kg魚體重的劑量添加黃芪多糖，可有效提高斑點(diǎn)叉尾非特異免疫功能，在此劑量下使用對(duì)斑點(diǎn)叉尾是安全性，未見不良反應(yīng)。