電刺激C2C12細胞構建運動損傷修復模型

鄭婭雯 袁夢 劉秀娟 張欣

(1.南京體育學院研究生部;2.南京體育學院運動健康學院 江蘇南京 210014)

電脈沖刺激（Electrical Pulse Stimulation，EPS）應用于細胞系和培養的原代骨骼肌細胞的骨骼肌肌管已被證明是研究收縮誘導運動性適應的主要工具［1］，其中C2C12細胞是體外研究骨骼肌內部機制的常用細胞模型［2］，可以表達各種成熟骨骼肌中存在的標志蛋白，因此為體外研究成肌細胞增殖和分化的首選模型［3］。用電脈沖刺激模擬神經元刺激激活體外培養的骨骼肌細胞，從而促進骨骼肌細胞收縮達到模擬運動的效果。已有研究表明，人體肌管的體外EPS（急性、高頻和慢性、低頻）可用于研究運動的效果，目前有關的電脈沖刺激骨骼肌細胞構建生物實驗模型的實驗逐漸增多，電刺激方案中可變換的維度較多，故產生了模擬各類運動類型的電刺激骨骼肌細胞模型，例如：急性或慢性抗阻運動模型、耐力運動模型［4］、向心運動模型等，其依據是許多研究發現EPS能夠誘發骨骼肌細胞相關基因表達和代謝特征的變化［5］，在骨骼肌內，各類運動類型變化包括基因（例如GLUT4表達增加）、代謝（例如葡萄糖攝取增加）和形態學變化（例如肥大）。因此，體外運動實驗模型必須證明在該模型中觀察到轉錄、信號傳導或代謝變化等方面的運動效應，才可以做出實驗模型的刺激強度可以類比鍛煉程度的結論。例如選用IL-6（白細胞介素6）、P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38）作為骨骼肌細胞收縮指標［6-7］。此外，在小鼠在體實驗中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）可作為骨骼肌損傷指標［8］，而將CK和LDH作為骨骼肌損傷指標的細胞實驗鮮有，以此為創新點之一。選用CK、LDH 作為骨骼肌損傷指標，探究可行的電脈沖刺激方案，本研究著重探究不同電壓（10 V、23 V、40 V）刺激條件下的EPS對C2C12 細胞收縮與損傷的影響，試圖建立由EPS 誘發的C2C12細胞離心運動損傷模型。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與器材

細胞培養基（gibco：DMEM培養基）、青霉素鏈霉素溶液（biosharp）、胰蛋白酶（gibco）、胎牛血清、馬血清、PBS（中喬新舟）、鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（欣友生物技術有限公司）、六孔細胞培養板（costar）、培養瓶（CORNING）、肌酸激酶（CK）測定試劑盒（南京建成）、乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（貨號A020-2）、RIPA 裂解液（碧云天）、蛋白酶/磷酸酶抑制劑（碧云天）混合溶液、Loading Buffer（生工）、P38 一抗（巴傲得）、二抗（巴傲得）、離心管（15ml/50ml）、電刺激儀、細胞培養箱（調至37℃、5%CO2飽和濕度）、超凈臺、顯微鏡、離心機、細胞刮刀、0.5 mlEP 管、細胞計數器、電泳儀、轉印機、發光機（Bio-Rad Laboratories）

1.2 細胞培養

在細胞培養前做好高壓滅菌耗材以及試劑準備工作，之后進行細胞復蘇、細胞換液、細胞傳代，待細胞傳代至實驗所需細胞量，將細胞平均種于六孔板中，細胞計數后進行分化，分化經過5至8天，細胞分化為肌管，進行后續實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 電刺激

將電刺激儀分別調至10 V、23 V、40 V 的刺激強度，刺激時間40 min，頻率1 Hz、20 ms，隨后將電刺激板插入六孔板，確保電極接觸細胞培養基，將六孔板連帶電刺激板放入細胞培養箱，之后開始電刺激。

1.3.2 形態學觀察

每天在顯微鏡40倍物鏡下觀察分化期間的C2C12細胞形態學變化。經過觀察發現，隨著分化時間的延長，細胞間距逐漸縮小，形態逐漸拉長形成肌管，彼此之間縱橫交錯，相互融合。

1.3.3 Western Blot檢測P38蛋白變化

將六孔板中的蛋白經過PBS 沖洗后刮下收于EP管中，加入適量細胞裂解液，經過裂解、吸取上清、蛋白定量和蛋白變性后，用于WB檢測，最后使用Image Lab分析軟件對其進行定量分析

1.3.4 比色法檢測CK活力

吸取細胞培養液測量CK 活力。依照肌酸激酶（CK）測定試劑盒說明書進行，之后使用分光光度計在波長660 nm 下讀取吸光度，根據標準曲線查找CK 酶活力。

1.3.5 ELISA法檢測LDH活性

吸取細胞培養液測量LDH活性。依照乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒說明書進行，之后使用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度值，經過計算得出LDH活性。

1.3.6 統計學分析

數據以平均值±標準差表示，采用 SPSS 26.0 統計軟件進行單因素方差分析。顯著水平取P＜0.05，極顯著水平取P＜0.01，作圖軟件采用Excel 和GraphPad Prism 6。

2 實驗結果

2.1 電刺激強度對C2C12細胞P38蛋白表達的影響

如圖1所示，V1組細胞經10 V、20 ms、1 Hz、40 min的電脈沖刺激后，與C組相比，刺激結束后4 h、8 h、24 h后的H4、H8、H24 組細胞內P38 蛋白含量呈極顯著性增加。

圖1 各組C2C12細胞內P38蛋白相對含量

V2組細胞經23 V、20 ms、1 Hz，40 min的電脈沖刺激后，與C 組相比，H0、H4 組細胞內P38 蛋白含量呈顯著性增加；與H0組相比，H48組細胞內P38蛋白含量呈顯著性下降；與H4 組相比，H2、H8、H48 組細胞內P38含量顯著性下降。

V4組細胞經40 V、20 ms、1 Hz、40 min的電脈沖刺激后，與C組相比，H0組細胞內P38蛋白含量呈極顯著性增加，H24、H48 組呈極顯著性下降，H8 組呈顯著性下降；與H0 組相比，H2、H4、H8、H24、H48 組細胞內P38蛋白含量呈極顯著性下降。

2.2 電刺激強度對C2C12細胞CK活力的影響

如圖2所示，V4組細胞經40 V、20 ms、1 Hz，40 min的電脈沖刺激后，與C 組相比，H0、H2、H4、H8 組細胞內CK 活力呈極顯著性增加，H24 組呈顯著性增加；與H0 組相比，H8 組細胞內CK 活力呈顯著性增加，H8 組呈顯著性下降，H24組呈極顯著性下降；與H8組相比，H2、H24 和H48 組細胞內CK 活力呈極顯著性下降，H4組呈顯著性下降。

圖2 V4組C2C12細胞培養基內肌酸激酶（CK）活性

2.3 電刺激強度對C2C12細胞LDH活性的影響

如圖3所示，V4組細胞經40 V、20 ms、1 Hz、40 min的電脈沖刺激后，與C組相比，H0、H2組細胞內LDH活性呈顯著性增加；與H0 組相比，H24 組呈極顯著性下降，H48 組呈顯著性下降；與H4 組相比，H24 組呈極顯著性下降，H48組呈顯著性下降。

圖3 V4組C2C12細胞培養基內乳酸脫氫酶（LDH）活性

3 結論

本實驗分別以10 V、23 V、40 V的電壓，及20 ms、1 Hz的頻率持續40 min刺激C2C12細胞，發現在這3種電壓強度下，P38 蛋白均有不同程度的增加，證明這3 種電壓均可引起C2C12 細胞收縮。選擇增加幅度最大、恢復趨勢最穩定的V4組進行進一步的損傷指標檢測，發現經40 V電脈沖刺激方案的刺激后，細胞液中的CK極顯著增加，LDH顯著增加，進一步證明該電刺激方案不僅能夠引起細胞收縮，并且能夠導致細胞損傷。綜上所述，用40 V、20 ms、1 Hz、40 min的電脈沖刺激C2C12細胞可以構建骨骼肌離心運動損傷模型，且隨著指標的恢復進程發現，這種損傷在4～8 h內得以恢復。

4 不足與展望

電刺激方案可變換與可探究的維度還有許多，本研究以電壓強度為變量，探究出了可以建立運動損傷修復細胞模型的電刺激方案，但由于實驗設計存在不足，一方面，忽略了電刺激頻率的影響，未來可以設計更加精確的電脈沖刺激時間與刺激頻率的方案，進而構建出更多、更精確的實驗模型；另一方面，指標的選擇也有待進一步優化，排除不可控的代謝干擾，進一步彌補組織培養和分離技術逐漸顯露的弊端，能夠有助于利用細胞實驗模型解決更多科學問題。