結直腸鋸齒狀息肉發病機制及微小RNA作用的研究進展

楊凱惠,馬瑞軍綜述 汪嶸審校

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化系統常見的惡性腫瘤。據2020年全球癌癥統計,結直腸癌居全球發病譜第3位,死亡譜第2位[1]。近年來,我國結直腸癌的發病率和病死率逐年上升。Ⅰ期結直腸癌的5年生存率>90%,但Ⅳ期的5年生存率下降至11%～15%[2]。CRC的發生途徑包括腺瘤—癌、炎—癌、denovo-癌、鋸齒狀息肉—癌。其中,腺瘤—癌途徑導致70%～80%的結直腸癌,其典型特征是染色體不穩定和微衛星穩定。鋸齒狀癌變途徑以CpG島甲基化表型(CpG island hypermethylator phenotype,CIMP)、微衛星不穩定性(microsatellite instability,MSI)、BRAF/KRAS突變和WNT通路激活為特點,此種途徑導致15%～30%的結直腸癌[3]。miRNA是長度為18～24個核苷酸序列的小分子RNA,可通過影響靶基因mRNA的表達來影響腫瘤的進程,被證明在鋸齒狀息肉中存在表達失調。文章對結直腸鋸齒狀息肉的發病機制及miRNA的作用研究進展予以綜述。

1 鋸齒狀息肉分類

直至2010年,人們普遍認為鋸齒狀息肉(serrated polyps,SP),一般不具惡性潛能。此后,研究者們又創造了許多術語來描述這些病變,增加了對SP術語和分類的誤解。2019年第五版WHO消化系統腫瘤分類將鋸齒狀息肉分為5類,包括增生性息肉(hyperplastic polyp,HP)、無蒂鋸齒狀病變(sessile serrated lesion,SSL)、無蒂鋸齒狀病變伴異型增生(SSL with dysplasia,SSLD)、傳統鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)和鋸齒狀腺瘤—未分類[4]。新分類法去除了HP亞型中的黏蛋白缺乏型(mucin-poor type,MPHP)。其中,SSL和TSA被認為是癌前病變,具有一定的惡性潛能。SP亞型之間在細胞學、結構特征等方面的差異可能是由負責細胞增殖和分化的基因突變或表觀遺傳改變引起[5]。

1.1 增生性息肉(HP) HP是最常見的亞型,大多數位于遠端結腸,通常<5 mm,約占鋸齒狀息肉的75%,惡性潛能小,包括微囊泡型增生性息肉(microvescicular type,MVHP)和富含杯狀細胞型增生性息肉(goblet-cell rich type,GCHP)。由于內鏡下特征相似,這2種亞型的鑒別診斷存在一定的挑戰性。在分子水平上,MVHP通常帶有BRAF V600E突變和CIMP-H,被認為是SSL的前體,GCHP表現為KRAS突變和CIMP-L。據報道,HP可以在7.5年內發展為SSL或TSA,且位于近端結腸的HP更具惡變潛能[6]。

1.2 無蒂鋸齒狀病變(SSL) SSL是第二常見的鋸齒狀病變類型,約占SP的25%,平均大小為5～7 mm,外觀為界限不清、形態不規則的蒼白病變,組織學上表現為結構扭曲的鋸齒狀隱窩。BRAF突變和CIMP是SSL典型的分子特征。大約10%的SSL可通過鋸齒狀癌變途徑導致CRC[6]。由于SSL好發于腸道皺褶較多的近端結腸,內鏡下不易發現且癌變率較高,因此有研究認為發生在結腸鏡篩查后的結直腸癌可能由漏檢和未處理的SSL發展而來。

1.3 無蒂鋸齒狀病變伴異型增生(SSLD) 當SSL惡性進展時,會出現異型增生的關鍵過渡,有4%～8%的SSL伴有異型增生。在一項包含266例鋸齒狀病變的研究中,SSLD的中位大小為12 mm,超過20 mm的SSL中有高達32%伴有異型增生,且多伴有MLH1表達缺失[7-8]。因此,MSI可能是SSLD發生的重要機制。

1.4 傳統鋸齒狀腺瘤(TSA) 與HP類似,TSA常位于遠端結腸,占鋸齒狀息肉的1%～2%,組織學上表現為扭曲的絨毛或管狀結構伴鋸齒狀病變。TSA通常較SSL大,在白光下表現為紅色、突出、帶蒂的外觀。與SSL相比,TSA的分子譜具有更大的異質性,其發生惡性腫瘤的風險以及進展為癌的速度尚不清楚。

2 鋸齒狀息肉的危險因素

目前研究已經確定了一些SP的危險因素。與傳統腺瘤相比,年齡較大和男性不是主要的危險因素。一項包含141 143例患者的研究表明,吸煙、飲酒、體質量指數、服用非甾體抗炎藥與鋸齒狀息肉(尤其是SSL)有關聯。吸煙人群患SP的風險增加近2.5倍[9],飲酒可使患SP的風險增加33%[10]。與正常體質量患者相比,體質量指數高的患者患SP的風險增加30%[11]。有研究表明,非甾體抗炎藥的使用與SSL的發生呈負相關,阿司匹林可將近端結腸SP風險降低約40%[12-13]。有CRC家族史和癌前鋸齒狀息肉個人史的患者患SSL的風險增加。

3 鋸齒狀息肉癌變的發病機制

一般認為,鋸齒狀息肉癌變途徑的發生過程是MAPK信號通路相關基因改變(如BRAF/KRAS)引起CPG島甲基化表型,導致一些腫瘤抑制基因沉默,進而發生MSI引起腫瘤。WNT/β-catenin通路激活也參與腫瘤的發生。CIMP和MSI是表觀遺傳DNA變化的結果。鋸齒狀息肉的癌變途徑見圖1。

注:MVHP.微囊泡型增生性息肉;GCHP.富含杯狀細胞型增生性息肉;SSL.無蒂鋸齒狀病變;SSLD.無蒂鋸齒狀病變伴異型增生;TSA.傳統鋸齒狀腺瘤;CIMP-H.CIMP高;CIMP-L.CIMP低;MSI-CRC.微衛星不穩定型結直腸癌;MSS-CRC.微衛星穩定型結直腸癌;miRNA.微小RNA。圖1 鋸齒狀息肉的癌變途徑示意圖

3.1 CPG島甲基化表型(CIMP) Toyota等[14]于1999年提出這一概念,后來被認為是鋸齒狀通路中的致癌機制。CPG島(胞嘧啶和鳥苷酸以一個磷酸連接)是胞嘧啶—鳥苷酸殘基以200～1 000 bp的重復序列出現的DNA區域,常位于基因啟動子附近區域,大多數處于非甲基化狀態,參與基因表達的調控。CPG二核苷酸中的胞嘧啶通過甲基轉移酶轉化為5-甲基胞嘧啶,誘導DNA空間結構發生變化,使染色質凝縮成團,導致轉錄因子不能結合,從而引起相關基因沉默。由DNA異常甲基化(即CIMP)引起重要抑癌基因沉默可以促進腫瘤生長。在SSLD中,75%的病例存在MLH1基因及其啟動子甲基化[15],被認為是鋸齒狀通路中最重要的致癌機制。

目前,用來檢測CIMP狀態的基因組合、實驗室技術和標記閾值無通用標準,最簡單常用的2種方法是甲基化特異性PCR(MSP)和MethyLight測定(甲基化特異性實時定量PCR),可對CIMP進行分級:CIMP高(CIMP-H)、CIMP低(CIMP-L)和CIMP陰性。CIMP的預后作用在不同的腫瘤分期中可能不同,不同的研究得出了不同甚至相反的結論[16-17]。一項包含15 315例CRC患者生存數據表明:在Ⅲ～Ⅳ期的CRC中,CIMP-H的患者較CIMP-L的患者總體死亡風險增加1.52倍,而在Ⅰ～Ⅱ期CRC中,2組的總生存期無明顯差異[18]。除了預后價值外,CIMP在預測化療療效中的作用也存在爭議,不同的研究結果并不一致。這可能是由于不同CIMP狀態的CRC在藥物轉運蛋白、藥物受體、藥物代謝酶或與化療藥物藥代動力學等相關的基因表達之間存在差異,導致化療敏感性不同[18]。

3.2 微衛星不穩定性(MSI) CRC中的MSI機制首次在Lynch綜合征中被發現。MSI是由DNA錯配修復(MisMatch Repair,MMR)基因活性喪失引起的。MMR基因可以識別和修復DNA復制過程中出現的堿基錯配、插入和缺失,對維持基因組穩定性具有重要作用。MMR基因在人類中多達12個,最主要的4個基因為MLH1、PMS2、MSH2和MSH6,其中MLH1和MSH2是MMR家族中的主要成員(發生突變占90%以上)。一般使用5個微衛星標記(稱為Bethesda組,包括BAT25、BAT26等2個單核苷酸標記和D2S123、D5S346、D17S250等3個雙核苷酸標記)來識別MSI狀態,當沒有標記物改變時,腫瘤被定義為微衛星穩定(MSS),有一個標記物改變時,腫瘤被定義為低度微衛星不穩定(MSI-low,MSI-L),有2個或2個以上的標記物改變時,腫瘤被定義為高度微衛星不穩定(MSI-high,MSI-H)。有研究表明,在具有MSI表型的SSLs、TSA和CRC中,存在多種miRNA及其下游靶基因的異常表達(包括miRNA-5787、miRNA-182-5p、miRNA-200b-3p、miRNA-222-3p、miRNA-6753-3p和SRRM2、POLR2J3、ETF1、MYB、SLC26A3、OLFM4)[19]。一般來說,MSI發生在致癌序列的后期,與SSLD的發生有關。

3.3 MAPK途徑信號通路的改變:BRAF/KRAS突變 不同于腺瘤—癌途徑,鋸齒狀息肉很少發生APC突變,最常見的為BRAF突變,偶見KRAS突變[6],并且,這2種突變在鋸齒狀息肉中是互斥的。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一組能被不同的細胞外刺激,如細胞因子、神經遞質、激素等激活的絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶,負責把信息從細胞表面傳導到細胞核內部。BRAF基因編碼一種名為B-raf的蛋白質,在MAPK通路中發揮重要作用。根據BRAF突變的狀態可以將結直腸癌分為2種表型:BRAF V600E突變和非V600突變的CRC[20]。在鋸齒狀病變通路中,BRAF常見的突變位點為BRAF V600E,該突變抑制腸黏膜的正常凋亡,誘導CIMP和MLH1啟動子甲基化[6],導致異常隱窩灶轉變為MVHP,被認為是腫瘤的早期啟動事件。在一項對137例鋸齒狀病變的研究中,BRAF突變占92.7%[15]。目前,有許多證據表明,部分SSL或HP可以轉變為帶有BRAF突變的TSA[5]。在鋸齒狀病變通路中,KRAS突變通常發生在TSA中,多位于遠端結腸,表現為CIMP-L或MSS。

3.4 WNT/β-catenin通路 Nourbakhsh等[21]通過使用β-catenin抗體和對下游靶基因(包括C-MYC、MMP7和AXIN2)的測定發現該通路在SSLD中存在激活。在鋸齒狀息肉中,WNT通路的激活并不常由APC突變引起[13],主要是由RNF43-ZNRF3復合物突變引起的。RNF43是一種下調WNT/β-catenin信號通路的腫瘤抑制基因,該基因的失活意味著WNT通路的激活。Hashimoto等[22]認為WNT通路相關基因突變(主要是RNF43)在SSLD中比SSL中更常見,參與SSLD的進展,并根據MLH1的表達狀態具有不同的突變譜。Tsai等[23]的研究表明,RNF43突變在TSA(28%)和BRAF突變MSS CRC(29%)中的發生率較SSL(10%)更高,與BRAF突變密切相關,但在TSA中與KRAS突變呈負相關。

4 miRNA在鋸齒狀息肉中的作用

Lee等[24]于1993年研究lin-14基因時在秀麗隱桿線蟲中發現了miRNA,這是一種內源性的小的非編碼RNA(長度18～24個核苷酸),可以與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(untranslated region,UTR)結合,促進其降解或抑制翻譯功能,調節腫瘤進展過程中編碼重要蛋白質的基因的表達(如PTEN、PDCD4),參與細胞的增殖、分化、遷移、侵襲、凋亡等過程[25]。在結直腸中,miRNA失調可能會影響結直腸腫瘤的內鏡外觀和發育途徑[26],導致不同類型的息肉的發生。有研究認為,在鋸齒狀息肉中,SSL和HP的miRNA表達譜相似,并且二者具有相似的基因組特征[27],這可能表明了HP在累積基因突變或表觀遺傳突變后可以進一步發展為SSL。在鋸齒狀病變中,miRNA的表達水平與MSI和CIMP狀態有關。

4.1 miR-31 許多研究表明,miR-31在鋸齒狀癌變中起重要作用。Aoki等[28]認為SSL進展為惡性腫瘤可能與miR-31的過度表達有關。Kanth等[29]在鋸齒狀病變中發現了23個miRNA的差異表達,其中miR-31的表達量較對照組高45倍,較HP高26～129倍,高表達的miR-31與BRAF V600E突變、CIMP-H和晚期腫瘤有關[30-31]。此外,在SSL中有許多差異表達的miRNA,可以將其與HP分開,如miR-31、miR-135b、miR-1247和miR-204。miR-31在鋸齒狀通路中的潛在機制仍然未知,據報道,miR-31增強了核梭桿菌對自噬通量的抑制,通過靶向抑制4F結合結合蛋白1/2(4F-binding protein 1/2,eIF4EBP1/2)促進CRC細胞增殖[32]。Kubota等[30]認為miR-31抑制SATAB2和RAS p21 GTP酶激活蛋白1(RASA1)來促進上皮—間充質轉化(EMT)和上調BRAF表達來促進腫瘤的發展,與腫瘤的晚期和低分化有關,是一種有潛力的預后生物標志物和有希望的治療靶點。

4.2 miR-135b miR-135b過表達與APC功能障礙有關,促進腫瘤的增殖和侵襲,Kanth等[29]首次顯示了miR-135b在SSL中過表達,并且與HP之間存在表達差異。此外,他們對SSL中的miRNA表達進行了全面分析(包括miR-135b、miR-378a、miR-548、miR-9、miR-196b),認為miRNA是SSL轉化為癌癥的良好預測因子。

4.3 miR-21 miR-21是參與CRC發生發展最為經典的miRNA之一,與腫瘤的TNM分期、組織學類型、浸潤深度、淋巴結轉移有關,通過下調PTEN和PDCD4等的表達來促進腫瘤細胞的增殖、侵襲[33-34]。Kanth等[29]研究表明,miR-21在SSL中較對照組升高1.5倍,但差異無統計學意義。

4.4 其他差異表達的miRNA 在SSL中,還有許多差異表達的miRNA,如miR-584、miR-3614-5p、miR-378a-3p等[29]。一些miRNA(miR-9、miR-31、miR-196b、miR-584、miR-615)與CIMP-H和BRAF突變高度相關,并且有可能隨CPG島甲基化水平而分級,而miR-196b和miR-615的表達與MSI高度相關[31]。Tsikitis等[35]分析了不同類型結腸息肉的miRNA特征,發現miR-222和miR-214在鋸齒狀息肉中分別顯著下調2.35倍和1.51倍,miR-335在非鋸齒狀組織中顯著過表達2倍,基于這3種miRNA可以將SP與非鋸齒狀息肉區分開,被認為是鋸齒狀通路潛在的生物標志物[31],并發現在TSA中miR-125b和miR-199a發生下調。

Slattery等[27]對正常腸黏膜和不同類型息肉之間的miRNA表達譜進行研究,鑒定出了19個在腺瘤性息肉和HP之間差異表達的miRNA,包括let-7i-5p、miR-1229-5p、miR-1234-5p、miR-1249、miR-1268b、miR-1275、miR-194-5p、miR-215、miR-2392、miR-30b-5p、miR-331-3p、miR-3653、miR-3960、miR-4281、miR-4689、mR-4739、miR-518a-5p、miR-6510-5p和miR-939-5p等,認為腺瘤性息肉會上調miRNA的表達。SSL和HP會下調miRNA的表達,并且二者之間的表達差異很小,與MSI和CIMP水平有關。

5 小結及展望

近年來,人們對結直腸鋸齒狀息肉的研究取得了很大進展,但鋸齒狀通路仍有不少的空白。文章概述了鋸齒狀息肉的新分類、命名和發病特征,并對發病機制及miRNA的差異表達進行了初步探討。基于CIMP、MSI、BRAF/KRAS突變、WNT/β-catenin通路以及miRNA之間的相互關系,鋸齒狀通路的致癌機制變得更加明確,結合WHO對鋸齒狀息肉的規范分類、命名,有助于臨床醫生制定合理的治療方案。而miRNA在CRC中是一種有潛力的生物標志物和有希望的治療靶點,在鋸齒狀通路中的作用仍需進一步探究。