TLR4抑制劑預處理對膿毒性心肌病小鼠心肌損傷的改善作用及其機制研究

陳詩陽,王曉景,董玉杰,張美春

膿毒性心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy,SIC)是由膿毒癥(sepsis)引起的發生在膿毒性休克早期的可逆性心肌功能障礙[1],其為膿毒癥最嚴重的并發癥之一。最新研究表明膿毒癥伴有心功能障礙的患者病死率可高達70%,不伴有心功能障礙的膿毒癥患者病死率僅為20%[2]。機體失控性炎性反應學說被認為是膿毒癥發病機制的重要基礎。炎性細胞過度激活并釋放大量炎性細胞因子是膿毒癥發生發展的重要機制之一[3],其中cTnI、CK-MB、BNP等心肌損傷標志物以及 TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子在臨床常用且敏感性高,是膿毒癥患者疾病嚴重程度和預后的明確指標[4-5]。Toll樣受體4 (TLR4)/NF-κB信號通路在參與膿毒性心肌病調節中起著至關重要的作用。膿毒癥過程中,TLR4參與介導了NF-κB 信號途徑的激活,從而大量釋放TNF-α、IL-6、IL-1等炎性因子,對其后的級聯反應起引領作用,進而引起心肌功能障礙[6]。本研究旨在探討TLR4抑制劑對脂多糖(LPS)誘導SIC小鼠心肌損傷的改善作用,并進一步了解其潛在機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物:SPF級C57BL/6小鼠9只,雄性,6～8周齡,購自湖北省實驗動物研究中心[生產許可證號:SCXK(鄂)2020-0018,使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0045]。在光照 12 h / d、濕度 50%～65%、溫度20～24℃的環境下喂養 1 周。(2)試劑與設備:LPS、TLR4抑制劑(TAK-242)購自美國Sigma公司;cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司;兔多抗TLR4、兔多抗NF-κB購自江蘇親科生物研究中心有限公司;兔多抗GAPDH購自杭州賢至生物有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司;HRP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。 (3)儀器設備:顯微鏡(尼康Fi3型生物顯微鏡),脫水機(武漢俊杰JT-12J電腦生物組織脫水機),化學發光成像系統購自杭州申花科技有限公司,冷凍高速離心機購自湖南可成儀器設備有限公司,電熱恒溫培養箱購自日本ASONE,小動物超聲成像系統購自百勝公司。

1.2 實驗方法 本研究經武漢科技大學醫學倫理委員會批準(2023102),于2023年3—6月在武漢科技大學動物實驗中心進行實驗。將小鼠采用隨機數字表法分為對照組、SIC組、TLR4抑制劑干預組(干預組),每組3只。除對照組外,其余2組小鼠以LPS(15 mg/kg)腹腔注射構建膿毒性心肌病小鼠模型;干預組在腹腔注射LPS前1 h,經尾靜脈以0.3 mg·kg-1·h-1速度靜脈泵入TLR4抑制劑;對照組腹腔注射生理鹽水(15 mg/kg)代替LPS。采用小動物超聲成像系統測量小鼠24 h左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF),LVEF<50%證明SIC小鼠模型構建成功[7]。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 小鼠心肌組織形態學變化:采用HE染色觀察。造模完成24 h后,頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠左心室心室肌組織,首先對組織進行脫水、透明、浸蠟處理,12 h后從生物組織脫水機中取出,再次進行包埋、切片烤片以及脫蠟處理,再將切片行蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色處理,風干后中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察小鼠心肌組織的形態學變化。

1.3.2 血清心肌損傷和炎性標志物檢測:采用酶聯吸附實驗(ELISA)法檢測。小鼠造模24 h后,異氟烷吸入麻醉,從心臟取血1.0～1.5 ml,離心留取血清標本。使用cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒,嚴格按照廠家說明書檢測上述標志物含量。在酶標儀450 nm波長處測量每孔的光密度,并計算相應的濃度。

1.3.3 心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達檢測:采用蛋白質免疫印跡試驗(Western Blot)法檢測。將少量剪碎的小鼠心室肌組織塊置于冰上30 min充分裂解,4℃下離心,留取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-20℃保存。采用BCA法測定蛋白濃度,經電泳后轉移至PVDF膜上,隨后封閉,封閉完成后加入兔多抗GAPDH、兔多抗TLR4、兔多抗p65(均1∶1 000稀釋),4℃孵育過夜。第二日在洗去一抗液后,HRP標記羊抗兔二抗以1∶10 000稀釋,室溫搖床孵育2 h后再次洗去多余二抗,隨后將預混好的免疫熒光(ECL)發光液滴加于PVDF膜上,反應數分鐘待熒光帶明顯后,用濾紙吸去多余的底物液,覆上保鮮膜,X線膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影,沖洗、晾干、掃描膠片,用ipp6.0軟件分析膠片灰度值。

2 結 果

2.1 各組小鼠心肌組織病理形態變化 在各組小鼠造模完成24 h后顯微鏡下可見: 對照組心肌組織形態結構完整,心肌纖維排列規則,心肌細胞整齊未見明顯病變,未見炎性細胞浸潤; SIC組心肌組織形態結構相對完整,心肌纖維排列紊亂,部分心肌細胞水腫,胞體崩解消融(黑色箭頭),間質內可見明顯炎性細胞浸潤(黃色箭頭); 干預組心肌組織形態結構相對完整,心肌纖維排列規則,少量心肌細胞損傷伴有空泡樣變(黑色箭頭),間質內可見零散炎性細胞浸潤(黃色箭頭),見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態改變( HE 染色,×200)Fig.1 Pathological changes in myocardial tissue of rats in each group under light microscopy (HE staining, × 200)

2.2 各組血清心肌損傷標志物及炎性因子水平比較 在小鼠造模24 h后,與對照組比較,SIC組cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均升高(t=26.274、32.979、26.782、36.031、23.266、34.881,P均<0.001);與SIC組比較,干預組cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均下降(t=15.181、22.537、20.697、21.428、19.241、22.228,P均<0.001),見表1。

表1 3組小鼠血清心肌組織損傷標志物及炎性因子水平比較Tab.1 Comparison of serum myocardial tissue injury markers and inflammatory factor levels among three groups of mice

2.3 各組心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達比較 在小鼠造模24 h后,與對照組比較,SIC組TLR4、NF-κB蛋白表達顯著上調(t=15.611、9.977,P均<0.001),與SIC組比較,干預組TLR4、NF-κB表達下調(t=28.067、7.320,P均<0.01),見圖2、表2。

表2 3組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達比較Tab.2 TLR4 and NF in myocardial tissue of three groups of mice-κB Comparison of protein expression

圖2 各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白印記圖Fig.2 TLR4 and NF in myocardial tissue of mice in each group-κB protein blot

2.4 血清炎性因子水平與心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達的相關性 進一步行相關性研究分析示,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平與小鼠心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白表達呈高度正相關(P<0.01),見表3。

表3 炎性因子水平與TLR4、NF-κB蛋白表達的相關性Tab.3 Inflammatory factor levels and TLR4, NF-κB The correlation between protein expression

3 討 論

關于膿毒性心肌病的有效治療手段,至今仍是國內外懸而未決的一大難題。近年來,關于膿毒性心肌病的發生發展機制已有了一定的深入研究,其中由于炎性因子的過度表達而引起一系列的惡性循環基本取得了專家們的共識。因此在關于膿毒性心肌病的治療上,除了重視引起膿毒癥感染的原發病以外,抗炎治療現已成為首要的治療原則[8]。由于在發生膿毒性心肌病時,機體會釋放大量炎性因子,如果僅僅只是通過針對單一炎性因子的抑制來達到抗炎的目的,顯然是不足以改善機體發生的炎性瀑布反應。治療膿毒性心肌病的干預靶點應著眼于調節炎性因子的關鍵部位。目前膿毒性心肌病藥物治療效果不理想,研究者認為這可能與現階段治療膿毒性心肌病藥物的靶點共性不高,對于早期炎性因子表達的抑制作用較差相關。因此,在現有的介導炎性因子表達的信號通路上,探索各信號傳導通路之間的交互作用,在不同信號通路的交叉點上開發靶點藥物,為治療膿毒性心肌病提供新思路。

TLR4/NF-κB信號通路的異常調控與膿毒癥、缺血再灌注損傷、癌癥、消化性潰瘍、炎性腸病、肥厚性心肌病、COVID-19等多種疾病相關[9-15]。炎性因子的大量釋放也與TLR4信號通路的表達、激活密不可分。TLR4/NF-κB信號通路是膿毒性心肌病發生、發展、轉歸的一個重要的信號通路[16],當機體收到LPS刺激后,LPS與脂多糖結合蛋白(LBP)結合并轉移到細胞表面的CD14上。然后,TLR4作為一種Ⅰ型跨膜蛋白與LPS結合后再與輔助蛋白MD-2相互作用,激活下游各種信號傳導通路,包括NF-κB、JNK、p38MAPK以及PI3K/AKT信號通路[17],進而導致炎性因子的大量釋放引起心肌損傷。因此TLR4作為各傳導通路的共同上游信號通路,標志著TLR4可能成為有效治療膿毒性心肌病的新靶點。TLR4抑制劑作為治療某些疾病的藥物,糾正TLR4信號通路過度激活的主要方法有3種:包括下調TLR4的表達;直接與髓樣分化復合物2(MD2)結合抑制TLR4信號通路;直接與TLR4或TLR4/MD2復合物結合抑制TLR4活性[18]。在研究TLR4抑制劑干預膿毒癥的相關作用機制方面,國內外學者均做了大量的工作。Selfridge等[19]設計了一些納曲酮衍生物,構效關系表明,用納曲酮可以顯著提高TLR4的抑制活性。劉新強等[20]通過實驗得出TLR4抑制劑E5564可通過與TLR4結合并抑制其與LPS的結合,阻斷LPS-TLR4信號通路的激活,進而減輕心臟炎性反應,改善心功能。楊夢等[21]提出TLR4特異性抑制劑TAK-242是通過抑制TLR4/NF-κB通路的激活,從而減輕膿毒癥大鼠肝臟的炎性反應。Achek等[22]在小鼠實驗中證實磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)通過特異性結合TLR4上的MD2結合位點,從而抑制TLR4/MD2復合物的形成,進一步抑制LPS誘導的多種促炎因子的產生。

LPS常用于建立以心室擴張、左心室射血分數降低和心功能不全為特征的膿毒癥模型。本研究發現,LPS處理組(SIC組+干預組)小鼠血清cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高,且與TLR4、NF-κB蛋白表達呈正相關。經TLR4特異性抑制劑TAK-242干預后,上述損傷標志物及炎性因子較SIC組均明顯下降,進一步證實了該型抑制劑可通過下調TLR4、NF-κB蛋白表達有效降低心肌損傷標志物以及炎性因子的釋放,進而改善心功能。

綜上所述,TLR4抑制劑干預可改善LPS所致的心肌損傷,其機制推測與其下調TLR4/NF-κB信號通道蛋白表達從而抑制炎性反應相關。因此TLR4作為治療膿毒性心肌病一個重要的靶點,設計和開發針對這一靶點的抑制性藥物具有很高的治療潛力。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

陳詩陽:設計研究方案,實施研究過程,撰寫論文;王曉景:提出研究思路,設計研究方案;董玉杰:協作實施研究過程;張美春:提出研究方向、研究選題,論文審核