miR-552和HSP90α與喉癌臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性研究

曾妮,高芳芳,王愛華,陳應(yīng)超,盧嶺,李鵬程

隨著對喉癌發(fā)病機制研究深入,基因水平的標志物在喉癌病情及預(yù)后中因敏感度及特異度高而更具有臨床價值[1-2]。miR-552具有調(diào)控腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等功能,與多種惡性腫瘤發(fā)病機制、病情及預(yù)后密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-552通過靶向p53基因而促進喉癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[4]。熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α,HSP90α)與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān),在多種惡性腫瘤中表達顯著升高,可作為病情及預(yù)后評估的標志物[5]。研究發(fā)現(xiàn)喉癌患者血清HSP90α蛋白表達顯著升高,可提高喉癌診斷的敏感度及特異度[6]。目前miR-552及HSP90α與喉癌臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性尚未明確,本研究對此進行探討,為提高喉癌的臨床診療水平提供客觀證據(jù),報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2017年1月武漢市第三醫(yī)院耳鼻喉科診治的喉癌患者87例為研究對象(LGC組),另選擇同期喉良性疾病患者(聲帶息肉、慢性喉炎等)45例為對照(非LGC組),LGC組和非LGC組患者在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern cooperative oncology group,ECOG)評分、吸煙史、糖尿病、高血壓及家族史等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),具有可比性,見表1。本研究經(jīng)武漢市第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(YLL071),全部患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 非LGC組和LGC組患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between non LGC group and LGC group patients

1.2 病例選擇標準 納入標準:(1)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、病理組織學(xué)檢查等確診為喉癌;(2)首次起病,既往無喉癌相關(guān)病史,未行手術(shù)、放療、化療等相關(guān)治療;(3)可配合本研究,隨訪過程中無脫落;(4)臨床病理資料完整;(5)預(yù)計生存期≥6個月,ECOG評分≤3分。排除標準:排除合并嚴重心腦肺血管疾病、其他喉部良惡性腫瘤、神經(jīng)精神疾病、嚴重肝腎功能異常等。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 組織miR-552和HSP90α表達檢測:2組患者均行電子喉鏡檢查取病灶活檢組織, 存于液氮中待后續(xù)檢測。采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)檢測miR-552和HSP90α表達,檢測試劑盒購自武漢博士德公司(批號分別為20150623、20150418)。提取活檢組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR擴增(美國ABI公司,型號為HT 7500),miR-552上游引物5’-GTTTAACCTTTTGCCTGTTGG-3’,下游引物5’-CGAACGCTTCACGAATTTG-3’;HSP90α上游引物5’-CTAGTTAATGCTGCGGACAACA-3’,下游引物5’-CATTTCGACCACCTGTCACTT-3’。反應(yīng)體系25 μl,反應(yīng)條件為:50℃孵育20 min,95℃預(yù)變性1 min;56℃退火1 min,65℃延伸擴增45 s,共計35個循環(huán),最后一輪72℃反應(yīng)8 min。HSP90α選擇β-actin為內(nèi)參,miR-552選擇U6為內(nèi)參,采用2-△△ct法分別計算miR-552和HSP90α相對表達量。

1.3.2 隨訪情況:LGC組患者每3個月隨訪1次(電話或門診),隨訪內(nèi)容包括生存狀況、預(yù)后狀況,隨訪時間終點為2023年1月,統(tǒng)計患者生存期及預(yù)后狀況(存活或死亡)。

2 結(jié) 果

2.1 2組組織miR-552和HSP90α表達比較 LGC組患者miR-552和HSP90α表達高于非LGC組患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2。

表2 LGC組和非LGC組患者miR-552和HSP90α表達比較Tab.2 Patients in the LGC and non LGC groups miR-552 and HSP90 α Expression comparison

2.2 組織miR-552和HSP90α表達在不同臨床病理因素中的差異 LGC組患者miR-552和HSP90α在性別、年齡、腫瘤部位和病理組織學(xué)類型方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),低分化、腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者miR-552和HSP90α表達高于中—高分化、腫瘤最大徑<3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.01),見表3。

表3 LGC組患者miR-552和HSP90α表達在不同臨床病理因素中比較Tab.3 LGC group patients miR-552 and HSP90 α Comparison of expression in different clinical pathological factors

2.3 組織miR-552及HSP90α表達預(yù)測喉癌患者死亡效能 繪制miR-552及HSP90α表達預(yù)測喉癌患者死亡效能的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示:miR-552、HSP90α及二項聯(lián)合預(yù)測喉癌患者死亡效能的AUC分別為0.812、0.806、0.925,二項聯(lián)合的AUC最大(Z/P=4.218/0.009、4.416/0.007),見表4、圖1。

圖1 miR-552和HSP90α 預(yù)測喉癌患者死亡ROC曲線Fig.1 miR-552 and HSP90 α Predicting the ROC curve for mortality in laryngeal cancer patients

表4 miR-552和HSP90α預(yù)測喉癌患者死亡的效能分析Tab.4 miR-552 and HSP90 α Efficiency analysis of predicting mortality in laryngeal cancer patients

2.4 喉癌患者死亡危險因素分析 以喉癌患者死亡為因變量(賦值:是為“1”;否為“0”),以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量,進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,miR-552≥1.7(賦值:<1.7=0,≥1.7=1)、HSP90α≥0.8(賦值:<0.8=0,≥0.8=1)、腫瘤分化程度低(賦值:中—高分化=0,低分化=1)、腫瘤最大徑≥3 cm(賦值:<3 cm=0,≥3 cm=1)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值:無=0,有=1)、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期(賦值:Ⅰ+Ⅱ期=0,Ⅲ+Ⅳ期=1)為喉癌死亡的獨立危險因素(P<0.05),見表5。

表5 喉癌患者死亡多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of mortality in laryngeal cancer patients

2.5 miR-552和HSP90α與喉癌生存關(guān)系 LGC組患者隨訪至隨訪終點時死亡64例,存活23例。miR-552≥1.7且HSP90α≥0.8的喉癌患者中位生存期為(31.6±5.4)月,短于miR-552<1.7且HSP90α<0.8患者的(38.3±6.1)月 (Log-rank=7.412,P=0.003)。

3 討 論

miR-552為位于染色體1p34.3上的小非編碼RNA,其表達水平在多種惡性腫瘤的組織或細胞中顯著上調(diào)。miR-552可以靶向多個基因,這些靶基因在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、細胞周期進展、細胞增殖、凋亡、細胞遷移和侵襲等生物過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。miR-552可與細胞色素P450家族2亞家族E成員1(CYP2E1)形成DNA-RNA雜交體并調(diào)節(jié)CYP2E1的表達,從而抑制肝細胞癌細胞核和細胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。Han等[7]發(fā)現(xiàn)miR-552調(diào)節(jié)肝臟腫瘤起始細胞擴張和索拉非尼耐藥。miR-552抑制Wnt抑制因子1(WIF1)的表達,并可調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞的細胞周期,miR-552誘導(dǎo)的WIF1表達下調(diào)可導(dǎo)致膠質(zhì)母細胞瘤S期細胞數(shù)量顯著減少,G1期細胞數(shù)量增加,從而抑制細胞生長和分化[3]。張明等[8]發(fā)現(xiàn)miR-552-3p通過抑制Dachshund家族轉(zhuǎn)錄因子1(DACH1)促進肝細胞性肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-552在卵巢癌、喉癌等多種惡性腫瘤中表達上調(diào),與臨床病理因素密切相關(guān)[4,9]。基于目前的研究進展,推測miR-552在惡性腫瘤中具有促癌基因功能。本研究中,喉癌患者miR-552表達顯著高于喉良性疾病患者,進一步研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān),證實miR-552與喉癌發(fā)病機制及臨床病理因素存在關(guān)聯(lián)。

HSP90α作為分子伴侶主要參與蛋白質(zhì)新生肽鏈的正確折疊及穩(wěn)定性,在惡性腫瘤細胞中維持多種促癌基因相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性,并抑制抑癌基因的蛋白合成,在細胞周期、增殖侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)行為中具有重要調(diào)控作用[10- 11]。腫瘤細胞在應(yīng)對熱刺激及氧缺乏等應(yīng)激反應(yīng)時,熱休克因子1會從與HSP90、共伴侶蛋白p23和含有TPR結(jié)構(gòu)域的免疫親和素形成的抑制復(fù)合物中釋放出來,同時會三聚化遷移入核與HSP90上游的熱休克元件結(jié)合而誘導(dǎo)HSP90的表達[12-13]。HSP90α在腫瘤中主要為促癌作用,通過促進促癌基因相關(guān)蛋白表達及抑制降解而參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[14]。崔翠蓮等[15]檢測發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中HSP90水平異常增高且與病情及預(yù)后相關(guān),在非小細胞肺癌的診斷及鑒別診斷中具有一定價值。劉斌等[16]發(fā)現(xiàn)單獨檢測HSP90α較CA125在胰腺癌臨床分期中具有更高的特異度及敏感度。張芬等[6]檢測喉癌患者血清HSP90α蛋白表達,發(fā)現(xiàn)HSP90α水平顯著升高,可作為喉癌診斷的標志物。本研究檢測喉癌患者HSP90α表達,發(fā)現(xiàn)HSP90α表達顯著升高且與臨床病理因素、死亡及生存期密切相關(guān),提示HSP90α與喉癌病情及預(yù)后密切相關(guān)。

目前喉癌患者病情及預(yù)后評估主要依賴于MR檢查及術(shù)后病理組織學(xué)TNM分期,存在敏感度、特異度低及普適性差等缺點,尤其不適用于無法行根治手術(shù)取得病理標本的進展期喉癌患者,不依賴于術(shù)后病理標本的檢測,可能更具有臨床價值[17]。隨著對喉癌發(fā)病機制的深入研究及基因檢測水平的提高,基因水平標志物在喉癌病情及預(yù)后評估中可能具有更高的敏感度及特異度而更具有臨床應(yīng)用價值[18-19]。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-552和HSP90α在多種惡性腫瘤中水平顯著升高且與病情及預(yù)后相關(guān),可作為多種病情及預(yù)后評估標志物[20-22]。基于目前的研究及本研究發(fā)現(xiàn)推測miR-552和HSP90α可能在喉癌病情及預(yù)后評估中具有重要價值。本研究中,miR-552聯(lián)合HSP90α預(yù)測喉癌患者死亡的效能較高,進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-552≥1.7、HSP90α≥0.8、腫瘤分化程度低分化、腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期為喉癌死亡的獨立危險因素,miR-552≥1.7且HSP90α≥0.8喉癌患者中位生存期顯著縮短,表明miR-552和HSP90α在喉癌預(yù)后不良預(yù)測中具有重要價值,miR-552聯(lián)合HSP90α檢測可提高敏感度及特異度,臨床上應(yīng)密切檢測喉癌患者miR-552和HSP90α,為喉癌診療決策制定提供客觀證據(jù)。

綜上所述,喉癌患者miR-552和HSP90α顯著升高,與臨床病理因素及預(yù)后密切相關(guān),在喉癌患者病情及預(yù)后評估中具有重要臨床價值,可作為喉癌病情及預(yù)后評估的標志物,但本研究為單中心研究且臨床病例較少,喉癌患者miR-552和HSP90α與臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性亟需大規(guī)模臨床試驗證實。

利益沖突：所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

曾妮:設(shè)計研究方案,實施研究過程;高芳芳:統(tǒng)計學(xué)分析;王愛華:實施研究過程,論文修改;陳應(yīng)超:資料搜集整理;盧嶺:分析試驗數(shù)據(jù);李鵬程:課題設(shè)計,論文撰寫,論文審核