慢性心力衰竭合并心房顫動患者血清miR-126、miR-222與心功能和主要不良心血管事件的關系

王玉巧,趙艷麗,宋夢仙,張歡,何紅,王瑩

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)為各種慢性心臟病基礎上逐年發展為心臟疾病的終末階段,心房顫動(atrial fibrillation,AF)是CHF患者常見的心律失常,可進一步加劇CHF患者心功能惡化,增加主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)發生風險[1-2]。尋找可準確評估CHF合并AF患者心功能和預測MACE發生的血清標志物對預后改善至關重要。相關報道證實,炎性反應介導的心肌纖維化參與了CHF合并AF過程[3]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miR)可通過調控多種機制參與AF發生發展[4]。miR-126是一種血管內皮特異表達miR,能通過抑制血管細胞黏附分子1表達抑制心肌炎性反應發生發展[5]。miR-126與心力衰竭和AF患者病情程度相關[6]。miR-222是一種心血管系統特異性表達miR,能通過調節多種靶基因抑制心肌炎性反應,miR-222與心力衰竭患者AF發生有關[7]。現分析CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222與心功能和MACE的關系,以期為降低CHF合并AF患者的MACE發生率提供理論依據,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2022年10月徐州醫科大學附屬連云港醫院心內科收治的CHF合并AF患者120例為AF組,男76例、女44例,年齡36～82(55.81±9.65)歲;CHF病程1～7(4.87±1.83)年;根據紐約心臟病協會(New York Heart Association,NYHA)心功能分級[8]:Ⅰ級22例,Ⅱ級29例,Ⅲ級26例,Ⅳ級43例;合并癥:高血壓37例,糖尿病28例,高脂血癥18例;吸煙40例;飲酒18例。未合并AF的CHF患者100例為非AF組,男63例、女37例,年齡37～79(55.89±9.04)歲;CHF病程1～8(4.67±1.59)年。另選取醫院同期體檢健康者80例為健康對照組,男51例、女29例;年齡18～75(54.47±8.51)歲。3組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(XYFY2019-0648),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 納入標準:(1)CHF診斷標準參考《慢性心力衰竭基層診療指南(2019年)》[8]:具備心力衰竭癥狀和/或體征,利鈉肽升高并符合以下任一條:①心臟舒張功能異常;②左心室肥厚和/或左心房擴大;(2)AF診斷標準參考《心房顫動基層診療指南(2019年)》[9]:經體表心電圖或單導聯心電記錄裝置記錄到心房顫動心電圖且持續超過30 s;(3)臨床資料完整。排除標準:(1)退行性病變、器質性心臟病、遺傳等非CHF導致的AF;(2)合并急慢性感染、自身免疫性疾病;(3)急性心力衰竭或慢性心力衰竭急性失代償;(4)妊娠及哺乳期婦女;(5)精神疾病;(6)伴有惡性腫瘤;(7)肝腎功能不全;(8)先天性、風濕性心臟病所致心力衰竭。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-126、miR-222水平檢測:收集患者入院次日和健康對照組體檢時空腹肘靜脈血3 ml,離心留取上層血清待測。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測血清miR-126、miR-222水平。具體過程如下:使用TRIzol試劑盒[購自生工生物工程(上海)股份有限公司,貨號 B511321]提取血清總RNA。按照TaKaRa逆轉錄試劑盒(購自上海金畔生物科技有限公司,貨號 RR013B)說明書將RNA逆轉錄為cDNA。最后使用RT-PCR系統(購自西安天隆科技有限公司,型號 Genesy 96T)并按照PCR試劑盒(購自北京百邁客生物科技有限公司,貨號 RK02006)說明書進行擴增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計、合成,以U6作為內參。內參U6上游引物5’-AGAAACACGTCTGGCTAGGAG-3’、下游引物5’-GCATGAAGGCAAGTTGGGTAG-3’;miR-126上游引物5’-TGGCAGAAAACAACCTGAACC-3’、下游引物5’-CCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG-3’;miR-222上游引物5’-TGATTGCACCCACCCTGTAG-3’、下游引物5’-GGTTCCCAGCTTTTCCGTTC-3’。反應總體積共25 μl,cDNA 1 μl、上下游引物各1 μl、2×Hieff?PCR Master Mix 10 μl、去離子水7 μl;擴增循環參數:90℃ 5 min ,90℃ 30 s、60℃ 25 s、70℃ 26 s ,共計35次。采用2-ΔΔCT法計算血清miR-126、miR-222相對表達量。

1.3.2 心功能檢測:所有患者入院次日使用美國GE公司生產的Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀行超聲心動圖檢測,通過Simpson法測量左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD);并于入院次日采集空腹肘靜脈血3 ml使用武漢明德生物科技股份有限公司提供的免疫層析法試劑盒檢測N末端前體B型鈉尿肽(N-terminal pro B type natriuretic peptide,NT-proBNP)水平。

1.3.3 預后及分組:CHF并發AF患者出院后通過門診復查或電話回訪的方式隨訪3個月,隨訪起始于患者出院當天,隨訪終止事件為隨訪至2023年1月或發生MACE;MACE包括再發心力衰竭入院、嚴重心律失常、心絞痛、心源性死亡、缺血性腦卒中、急性心肌梗死等[9]。根據是否發生MACE分為MACE亞組和非MACE亞組。

2 結 果

2.1 3組血清miR-126、miR-222水平比較 血清miR-126、miR-222水平AF組<非AF組<健康對照組(P<0.01),見表1。

表1 健康對照組、非AF組、AF組血清miR-126、miR-222水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-126 and miR-222 levels among healthy control group, non AF group, and AF group

2.2 不同NYHA心功能分級CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平比較 血清miR-126、miR-222水平Ⅰ級>Ⅱ級>Ⅲ級>Ⅳ級,差異均有統計學意義(P<0.01),見表2。

表2 不同NYHA心功能分級CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平比較Tab.2 Comparison of serum miR-126 and miR-222 levels in CHF patients with AF and different NYHA heart function grades

2.3 AF組與非AF組心功能指標比較 AF組LVEF低于非AF組,LVEDD、NT-proBNP高于非AF組(P<0.01),見表3。

表3 AF組與非AF組心功能指標比較Tab.3 Comparison of cardiac function indicators between AF group and non AF group

2.4 CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平與NYHA心功能分級的相關性 Spearman相關性分析顯示,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222與NYHA心功能分級呈負相關(rs=-0.501、-0.496,P均<0.001 )。

2.5 2亞組患者臨床資料比較 隨訪3個月,120例CHF合并AF患者發生MACE 38例(31.67%)。 2亞組患者的性別、年齡、吸煙、飲酒、合并癥、用藥情況、WBC、Hb、ALT、AST、SCr、BUN、血鈣、血鈉、APTT、LVEF、LVEDD比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。而MACE亞組患者CHF病程、NYHA分級Ⅲ～Ⅳ級、血鉀、PT、NT-proBNP高于非MACE亞組,miR-126、miR-222水平低于非MACE亞組(P<0.05),見表4。

表4 非MACE亞組及MACE亞組患者臨床資料比較Tab.4 Comparison of clinical data between non MACE subgroup and MACE subgroup patients

2.6 CHF合并AF患者發生MACE的多因素Logistic回歸分析 以CHF合并AF患者發生MACE為因變量(賦值:是為“1”;否為“0”),以上述結果中P<0.05項目為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示:NYHA心功能分級Ⅲ～Ⅳ級、NT-proBNP升高為CHF合并AF患者發生MACE的獨立危險因素,血清miR-126升高、miR-222升高則為獨立保護因素(P<0.05),見表5。

表5 CHF合并AF患者發生MACE的多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of MACE occurrence in patients with CHF combined with AF

2.7 血清miR-126、miR-222水平預測CHF合并AF患者發生MACE的效能 繪制血清miR-126、miR-222水平預測CHF合并AF患者發生MACE的效能ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示:血清miR-126、miR-222及二者聯合預測CHF合并AF患者發生MACE的AUC分別為0.734、0.741、0.839,二者聯合優于各自單獨預測效能(用DeLong法對其差異進行比較)(Z=4.235,4.136,P=0.013,P=0.014),見表6、圖1。

圖1 血清miR-126、miR-222水平預測CHF合并AF患者發生MACE的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum miR-126 and miR-222 levels predicting MACE in patients with CHF and AF

表6 血清miR-126、miR-222水平預測CHF合并AF患者發生MACE的效能分析Tab.6 Efficacy analysis of serum miR-126 and miR-222 levels in predicting MACE in patients with CHF and AF

3 討 論

CHF主要通過促進心肌纖維化、自主神經興奮、心房結構重構等導致心房動作電位和自律性異常,從而誘發AF,AF會通過不規則心室節律、心房收縮喪失、心動過速、彌漫性纖維化等過程進一步降低CHF患者心功能,二者相互促進形成惡性循環加速疾病進展[1]。CHF合并AF不僅能加劇心功能惡化,同時還能降低心臟泵血功能引起心房內血流淤積形成血栓,增加急性心肌梗死、缺血性腦卒中等栓塞疾病風險,導致MACE發生率增加,導致不良預后[10]。因此,尋找與CHF合并AF患者心功能以及與MACE發生有關的血清標志物,對指導臨床預防MACE發生和改善患者預后具有重大意義。

AF的發生和持續發展受到多種因素的共同影響,心肌纖維化導致的心房重構被認為是AF發生中重要病理生理機制之一,炎性反應能通過誘導心肌細胞凋亡引起心肌纖維化,再通過心房重構導致AF發生[11]。近年研究表明,miR作為一類短鏈非編碼RNA,能通過調節神經激素、炎性反應、心房重構、電重構等機制參與AF發生發展[12]。miR-126是位于人染色體9q34.3上的一個miR,因其特異性表達于血管內皮細胞,并能通過抑制血管細胞黏附分子1表達發揮抗炎作用,通過保護血管功能發揮心腦血管保護作用,因此在心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病中得以廣泛研究[5]。既往實驗指出[13],上調miR-126表達能抑制心臟肥大和心肌梗死大鼠的心肌纖維化,反之會促進心肌纖維化發展。同時有研究報道,內皮祖細胞中miR-126表達能預測CHF患者心血管疾病死亡風險[14]。miR-222是位于人染色體Xp11.3上的一個miR,特異性表達于心肌細胞、血管平滑肌細胞、內皮細胞等心血管系統,具有重要的心血管系統保護作用[7]。近年研究表明[15],miR-222不僅能通過抑制單核細胞趨化蛋白1、血管細胞黏附分子1等促炎因子生成發揮抗炎作用,同時還能通過抑制Wnt/β-連環蛋白、轉化生長因子-β/母親抗肢癱同系物信號通路活化,抑制糖尿病和心力衰竭引起的心肌纖維化。Lu等[16]通過基因芯片檢測發現,心力衰竭合并AF患者血漿miR-222低于心力衰竭患者。同時有學者通過生物信息學方法分析發現,miR-222有助于心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病的預測[17]。然而關于miR-126、miR-222與CHF合并AF患者心功能和MACE的關系尚未可知。

本結果顯示,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平降低,這與既往研究報道結果相符[6];血清miR-126、miR-222水平隨著NYHA心功能分級增加而降低,且血清miR-126、miR-222水平升高是近期MACE發生的獨立保護因素。這說明血清miR-126、miR-222水平降低與CHF合并AF患者心功能降低密切相關,并且會增加CHF合并AF患者近期MACE的發生風險。分析原因可能是血清miR-126、miR-222均具有抗纖維化作用有關。血清miR-126、miR-222水平降低可使血管細胞黏附分子1等促炎因子活化,激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、Wnt/β-連環蛋白、轉化生長因子-β/母親抗肢癱同系物信號通路,促進心肌纖維化導致AF加重,進一步減少心排血量和加重心房內血流淤積,導致心功能持續降低并增加MACE發生風險[18]。本研究結果還顯示,NYHA心功能分級Ⅲ～Ⅳ級和NT-proBNP升高為CHF合并AF患者發生MACE的獨立危險因素,其原因可能是NYHA心功能分級和NT-proBNP越高表示患者心功能越差,因此MACE發生風險更高。目前臨床主要依靠B型利鈉肽或NT-proBNP預測CHF合并AF患者預后,但其受影響因素較多,預測效能存在一定局限性。 血清miR-126、miR-222水平在0.65、0.45時預測CHF合并AF患者發生MACE的AUC為0.734、0.741,聯合預測的AUC為0.839,提示聯合預測較單一指標預測效能更佳。說明血清miR-126、miR-222水平可能成為CHF合并AF患者發生MACE的輔助預測指標,且聯合檢測血清miR-126、miR-222水平能提升預測價值。

綜上所述,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平下降,是MACE發生的獨立影響因子,血清miR-126、miR-222水平聯合預測CHF合并AF患者MACE的效能較高。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王玉巧:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫,論文修改;趙艷麗、宋夢仙:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;張歡、何紅:進行統計學分析;王瑩:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核