‘金湘玉’黃桃果實糖與類黃酮代謝及轉錄組測序分析

陳為峰，王春發，黃 佳，李 杜，張良波

（1.湖南省園藝研究所，湖南 長沙 410125；2.衡陽市農業科學院，湖南 衡陽 421100；3.衡南鴻祥種養專業合作社，湖南 衡陽 421125）

果實的甜酸風味主要由糖和有機酸的含量及比例決定，是影響水果感官特性的重要因素[1-2]。黃酮醇類化合物是重要的次生代謝物質，不僅能影響植物的生長發育，在植株抗菌防病方面也發揮了重要作用[3]。近年來，隨著分子生物技術和生物信息學的發展，轉錄組學的應用越來越廣泛，對果實品質的研究也已進入轉錄水平階段[4-5]。例如：李文彬[6]在‘紅陽’獼猴桃果實中發現與蔗糖相關的基因SPS、SPP以及與代謝相關的基因AI、NI、SuSy、FK和HK，這些基因的表達水平都隨著果實糖含量的增加而升高。Zhang 等[7]從桃果實中克隆出蔗糖代謝酶及碳水化合物變化相關基因CINV1、CWINV1、CINV2、SUS1、SUT1及SPS1。周蘭[8]的研究表明，CHI、F3H、PAL、FLS等基因在類黃酮化合物合成中起作用，但果實不同部位這些基因的表達量不同，在栽培型蘋果的果肉中，類黃酮物質的含量遠遠低于果皮。這些與生物代謝相關的研究結果為探明果實生長發育過程有機物積累的機理奠定了堅實基礎。

‘金湘玉’黃桃（Prunus persica'Jinxiangyu'）是湖南省林業科學院最新選育出的湖南省首個自主知識產權的早熟黃桃新品種，為了探明該品種黃桃果實的糖成分及類黃酮物質的積累代謝規律，筆者分析了相關代謝關鍵基因的表達差異，以期挖掘出調控果實優良品質形成的關鍵基因，為實現黃桃分子育種，加快黃桃新品種更新提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試‘金湘玉’黃桃取自湖南省沅陵縣太常安置區果園（110°21'8.09″E，28°28'7.15″N，海拔120 m）。采樣是從桃樹謝花后20 d 開始，每隔10 d 采摘1 次，果實開始成熟后5 d 采摘1 次，直到果實完全成熟。從樹勢健壯、栽培管理基本一致的3 棵‘金湘玉’果樹樹冠中部位置上分別采摘5 個大小均勻、無損傷、無蟲害的果實，去皮切碎后用液氮速凍，置于-70℃超低溫冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 果實可溶性糖含量的測定 可溶性固形物含量參照NY/T2637—2014 采用數顯手持折光儀進行測定；可溶性總糖含量采用蒽酮硫酸法測定[9]；果實中蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇含量采用索萊寶科技有限公司的相關試劑盒進行測定。

1.2.2 果實黃酮類化合物含量的測定 稱取0.25 g 果實樣品，用1.5 mL 酚類提取液（水∶甲醇∶甲酸=25 ∶24 ∶1，體積比，下同）研磨混勻，10 400 r/min離心20 min；經0.22 μm 濾膜過濾上清液，然后用液相色譜檢測類黃酮含量。流動相A（乙腈∶甲酸=9 ∶1）與流動相B（水∶甲酸=9 ∶1）的梯度洗脫程序設置為：95%A 0 min、85%A 25 min、78%A 42 min、64%A 60 min、95%A 65 min，最后平衡5 min，共70 min；流速為1 mL/min；分析柱和保護柱為ODS-3 色譜柱（5.0 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫35℃；在365 nm 波長下檢測黃酮醇類化合物的含量。

1.2.3 轉錄組測序 根據‘金湘玉’果實發育過程糖分的積累規律，選取花后30 d（A2）、花后60 d（A5）、花后90 d（A9）3 個不同發育期的果實，作為RNA提取和轉錄組測序的材料。采用Nano Drop 2000 分光光度計檢測RNA 濃度與純度，RNA 條帶完整性質量結果用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗；RNA 質檢合格后，用 Illumina Hiseq 測序平臺進行高通量測序，該步驟委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。參考基因組版本為Prunus_persica_genome_v2.0.a1（https://www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_v2.0.a1）。

1.2.4 qRT-PCR 驗證 取1μL 質檢合格的RNA 樣品按照M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。利用Primer 3 Plus軟件對7 個基因的CDS（Coding sequence）序列設計特異性引物，選擇Pp RPL13作為內參基因。引物序列見表1，所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。qRT-PCR 反應體系（20 μL）：Template DNA 2 μL，2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH） 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）or ROX Reference Dye II 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。qRT-PCR 反應程序：95℃ 30 s 預變性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環。按照2-ct 法計算基因相對表達水平，每個樣品進行3 次生物學重復。

表1 基因引物序列

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件處理原始數據，SPSS19.0 軟件進行相關性分析，Primer3Plus 在線軟件設計引物，Origin 2021 軟件作圖或進行圖片處理。

2 結果與分析

2.1 ‘金湘玉’黃桃果實糖積累動態變化規律

由圖1 可知，在花后20～90 d 期間，隨著黃桃果實的不斷發育，可溶性總糖含量總體呈上升趨勢，可溶性固形物含量總體呈先降后升的趨勢。花后20～50 d，黃桃果實的葡萄糖、蔗糖、果糖含量均呈先升后降的趨勢；花后50～90 d，蔗糖和果糖含量均迅速上升，果糖含量在花后85 d 達到峰值，含量為54.38 mg/g，蔗糖含量在花后90 d 達到峰值；山梨醇含量隨果實成熟整體呈現下降趨勢，在花后85 d 含量最低。

圖1 ‘金湘玉’黃桃果實發育過程糖含量的變化

2.2 ‘金湘玉’黃桃果實類黃酮物質的積累動態變化

由圖2 可知，‘金湘玉’黃桃果實中，槲皮素苷含量在花后20～50 d 含量較高，隨著果實逐漸成熟其含量有所下降；山奈素苷含量總體上呈先升后降的變化趨勢，但波動較為平穩，在花后80 d 達到最大值。

圖2 ‘金湘玉’黃桃果實發育過程類黃酮物質含量的變化

2.3 ‘金湘玉’黃桃果實轉錄組測序數據的分析

對處于發育關鍵期（花后30、60、90 d）的‘金湘玉’果實樣品進行轉錄組測序，結果如表2 所示，共獲得3 612 萬～ 4 489 萬條Raw reads，單個樣品平均獲得40 173 908 條Raw reads，經質量過濾后平均得到39 969 440 個Clean reads，且堿基Q20 百分比在96.59%～97.97%之間，均超過了95%，Q30 的百分比在91.09%～93.97%之間，均超過了90%，核苷酸GC 含量在45.81%～47.56%之間，且數據整體測序錯誤率小于0.03%，說明轉錄組測序質量較好，測序結果可進行后面的數據組裝。

表2 ‘金湘玉’黃桃果實轉錄組測序數據統計

2.4 ‘金湘玉’黃桃果實糖代謝關鍵基因的篩選

對3 個發育關鍵時期樣品的轉錄組數據進行篩選，結果如圖3 所示，共發現181 個基因參與果實果糖和甘露糖代謝（ko00051）、糖酵解/糖異生代謝（ko00010）、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化（ko00040）、半乳糖代謝（ko00052）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）。其中，有26 個差異基因參與果實果糖和甘露糖代謝，有34 個差異基因參與果實糖酵解/糖異生代謝，有30 個差異基因參與戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化，有22、69 個差異基因分別參與半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝。由此可知，在‘金湘玉’黃桃果實中參與淀粉和蔗糖代謝的差異基因數量最多，參與半乳糖代謝的差異基因數量最少。

圖3 糖代謝途徑差異表達基因個數統計

2.5 糖代謝關鍵基因在‘金湘玉’果實3 個發育關鍵時期的表達分析

進一步對‘金湘玉’果實3 個發育關鍵時期轉錄組數據進行兩兩對比，以3 個生物學重復的基因表達量求平均值，篩選滿足|log2(fc)|＞1、P＜0.05、FDR＜0.05 的顯著表達的差異基因，結果如圖4 所示，在淀粉與蔗糖代謝過程中INVA、INV*DC4和SUS3在果實發育的過程中表現為顯著下調，SUS3、INVA基因在花后30 d 的表達量較高，隨果實的成熟在花后90 d 幾乎不表達；SS、SS1、SPS1基因在果實發育的過程中表現為顯著上調，花后90 d 表達量較高，這與果實發育過程中蔗糖逐漸積累的結果一致。在果糖和甘露糖代謝過程中，PMI1在果實發育的過程中表現為顯著下調；SDH、PFK3基因在果實發育的過程中表現為顯著上調，其中SDH（Prupe.2G288800_v2.0.a1）基因在3 個時期的表達量都很高，FPKM 值分別為697.63、1 140.78、1 853.14。

圖4 ‘金湘玉’果實3 個發育關鍵時期糖代謝基因的差異表達分析

2.6 類黃酮代謝關鍵基因在‘金湘玉’果實3 個發育關鍵時期的表達分析

由圖5 可知，在類黃酮生物合成過程中，ANS、DFR、F3H及FLS基因的表達量在花后30～60 d 呈顯著上調趨勢，花后60～90 d 呈顯著下調趨勢，基因表達量的FPKM 值在花后90 d 很低；CHI基因的表達量在花后30～90 d 表現為顯著下調。苯丙烷類物質生物合成中，4CL3基因的表達量在花后30～90 d 呈顯著下調趨勢，4CL1、PAL1基因的表達量在花后30～60 d 呈顯著上調趨勢，在花后60～90 d 呈顯著下調趨勢。

圖5 ‘金湘玉’果實3 個發育關鍵時期類黃酮代謝基因的差異表達分析

2.7 qRT-PCR 驗證測序結果

為了進一步驗證‘金湘玉’果實轉錄組測序結果的準確性，從RNA-Seq 測序數據中挑取與糖代謝相關的7 個差異表達基因（SUS3、SS、SDH、PFK3、SS1、AMY3、SPS1），通過qRT-PCR 對基因的表達量進行檢驗，結果如表3 所示，這7 個基因的qRT-PCR 相對表達量與轉錄組測序的FPKM 值相對表達量的動態變化趨勢基本一致。這表明轉錄組測序表達譜結果是可靠的。

表3 不同方法對‘金湘玉’黃桃果實各發育時期差異表達基因表達量的檢測結果

3 討 論

果實的內外在品質是水果質量評估的重要指標，是影響果農收益和商品市場競爭力的重要因素[10-11]。前人研究發現，不同植物果實中的糖組分及含量不同，甚至同一種果實不同品種間的糖組分及含量也存在較大差異。張穎[12]的研究發現，4 種不同桃品種間果糖含量和蔗糖含量存在差異，花后90 d，‘菁香’桃果實蔗糖含量較高，‘錦繡’黃桃果糖含量最高。前人研究還發現，桃果實栽培種的糖類型大多以蔗糖為主。該試驗結果顯示，‘金湘玉’黃桃幼果發育期的蔗糖含量極低，該時期糖分主要以果糖和山梨醇為主，山梨醇含量在整個果實生長發育過程中呈現明顯的下降趨勢，說明山梨醇進入果實后不是一直以山梨醇的形式存在，而是會逐漸轉化為果糖和葡萄糖；成熟的‘金湘玉’黃桃果實中果糖的含量最高，使其具有較高的口感甜度。大多數桃品種的果實生長期為110～140 d，而‘金湘玉’的果實生長期較短，為85 d 左右，為早熟品種，由于‘金湘玉’果實發育時間短，因此成熟果實中蔗糖積累較少。

糖代謝是在相關酶基因的調節下完成的，果實生長發育不同階段相關代謝基因表達的差異可能導致不同階段糖積累出現差異[13-14]。該研究對‘金湘玉’果實發育3 個不同時期的轉錄組數據進行差異基因分析發現，具有顯著表達差異的基因中SS與SS1基因的表達量水平相差較大，SS基因的表達量遠遠高于SS1，這2 個基因都可以調控果實糖分的積累，其中SS基因的調控作用更明顯；在果實發育過程中，SPS1與SPS4的表達量變化趨勢不同，其中SPS1基因在花后30 和60 d 幾乎不表達，在花后90 d 表達量升高，SPS4花后30 和90 d 表達量較低，在花后60 d 表達量稍有升高；INV*DC4和INVA均只在花后30 d 表達量很高，在花后90 d 幾乎不表達，且INVA基因表達量遠高于INV*DC4。前人研究表明，幼果中的SUS1更接近典型的SUS。在植物中，SUS1在蔗糖的分解中發揮主要作用，為細胞壁構建或糖酵解提供底物，隨著果實的成熟，SUS2活性增加，并在蔗糖的快速積累中發揮作用[15]。該試驗結果顯示，SUS2在整個發育過程表達量極低（3個時期FPKM 值分別為0.30、25.78、0.01），SUS3基因在幼果期表達量較高（FPKM 值達439.96），但隨著果實的成熟呈下調趨勢，因而推測INVA、SUS3基因在花后30 d 是使蔗糖分解為果糖和葡萄糖的關鍵基因；2 個SDH基因的表達量在花后30～90 d均表現為上升趨勢，其中SDH（Prupe.2G288800_v2.0.a1）表達水平較高且持續上調，推測該基因對果實發育后期果糖含量的積累調控作用較強。綜上所述，隨著果實的成熟，蔗糖合成方向基因SPS1、SS與SS1的表達水平持續上調，對果實中蔗糖含量起著關鍵作用；SUS3、INVA基因在果實發育前期表達水平較高促進蔗糖的降解，這些基因的調控影響著‘金湘玉’果實糖類含量的變化。

該研究還發現，參與類黃酮物質代謝的相關基因如ANS、DFR、F3H、FLS、4CL1和PAL1等基因在‘金湘玉’果肉中的表達量較低，這與果肉中測出槲皮素苷及山奈素苷含量較低的結果一致，而這些結構基因相互作用共同影響了類黃酮物質的合成。