一測多評法測定大花龍膽中環烯醚萜類和黃酮類成分的含量

李燦琳，劉海洋，李 思，李廷菊，黃 茜，古 銳*

1.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都 611137

2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

大花龍膽GentianaszechenyiiKanitz 收載于《四川省藏藥材標準》“白花龍膽（榜間嘎保）”項下，入藥部位為除去基生葉的帶花地上部分。大花龍膽味苦，性涼，具有解毒、利咽的功效，是白花龍膽的主流藥材[1-3]，臨床上治療哮喘、急慢性咽喉炎、急慢性支氣管炎等疾病效果明顯。由于市場需求量大，資源緊缺，目前已被列入一級瀕危藏藥。指紋圖譜研究表明，大花龍膽主要成分包括以大花龍膽苷A、平龍膽酯苷、馬錢苷酸、獐芽菜苷、烏奴龍膽苷D 等為主的環烯醚萜類和以異葒草苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷（或稱為異金雀花素苷）、異金雀花素為代表的黃酮類成分。目前，在四川省藏藥材標準（2020年版）中，建立了大花龍膽苷A 的含量測定方法，缺陷在于不能很好地控制藥材中多種成分的質量；受需要對照品的數量和種類較多，成本高且部分對照品未有出售的影響，外標法存在一定局限性，并不適宜于民族地區藥檢系統檢測需要[4-5]。為更好地控制藏藥大花龍膽的質量，本研究提出采用“一測多評法”[6-11]，此法已廣泛應用于藏藥的質量控制。通過一測多評技術實現同時測定大花龍膽中的多個指標性成分，為提升大花龍膽藥材的質量控制標準提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260A 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；島津LC2030 高效液相色譜儀（日本島津公司）；SB-5200DT 超聲清洗儀器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；UPT-11-10T 優普系列超純水器（四川優普超純科技有限公司）；CAP2250 賽多利斯電子分析天平（白山市玖久儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥

甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。對照品馬錢苷酸（批號PS000658，質量分數≥98%）、獐牙菜苷（批號PS011123，質量分數≥98%）、異金雀花素（批號PS010491，質量分數≥98%）、烏奴龍膽苷D（批號PS010489，質量分數≥98%）、平龍膽酯苷（批號PS010487，質量分數≥98%）購自成都普思生物科技股份有限公司。異葒草苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、大花龍膽苷A 為成都中醫藥大學民族醫藥學院自制，經峰面積歸一化法計算質量分數為98%以上。24 批大花龍膽藥材自采或購買于西藏、青海、四川等地，經成都中醫藥大學民族醫藥學院古銳教授鑒定為大花龍膽G.szechenyiiKanitz 的干燥花枝，見表1。

表1 24 批樣品來源信息Table 1 Source information of 24 batches of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.2%磷酸水溶液（A 相），甲醇（B 相），梯度洗脫：0～5 min，20%～27% B；5～12 min，27% B；12～55 min，27%～45% B；55～62 min，45%～48% B；62～82 min，48%～56% B；82～85 min，56% B；85～90 min，56%～20% B；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長254 nm；柱溫35 ℃，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液 (A) 和大花龍膽樣品 (B) HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatographs of mixed reference substances (A) and sample of G.szechenyii (B)

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品馬錢苷酸17.09 mg、獐牙菜苷17.92 mg、異葒草苷17.20 mg、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷20.24 mg、異金雀花素16.78 mg、烏奴龍膽苷D 17.82 mg、平龍膽酯苷19.15 mg、大花龍膽苷A 67.27 mg 分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇至相應刻度，搖勻。分別精密移取上述8 個對照品溶液適量，置于50 mL 量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為153.90、71.68、51.60、253.00、178.13、89.10、143.63、605.43 mg/L 的混合對照品溶液。于4 ℃冰箱避光保存，備用，濾過，取續濾液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過3 號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍考察 精密吸取上述混合對照品溶液，加甲醇稀釋制成系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件下測定其峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標，各待測對照品濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程和線性相關系數（R2），結果R2均大于0.999，表明進樣濃度與峰面積有良好的線性關系，見表2。

表2 大花龍膽中8 種成分的線性回歸方程Table 2 Linear regression equations of eight components in G.szechenyii

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次進行分析，每次進樣10 μL，記錄大花龍膽苷A、馬錢苷酸、獐牙菜苷、異葒草苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷的峰面積，計算峰面積的RSD 值，結果顯示上述各成分的峰面積RSD 分別為0.87%、0.76%、0.47%、0.89%、0.90%、0.88%、0.69%、0.82%，說明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取大花龍膽藥材（DH6），按“2.3”項下制備供試品溶液，置于室溫下，分別于配制后的0、2、4、8、12、24、48 h 進樣，記錄峰面積，結果大花龍膽苷A、馬錢苷酸、獐牙菜苷、異葒草苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷的峰面積RSD 別為0.87%、0.52%、1.35%、0.97%、0.80%、0.77%、1.10%、0.74%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取大花龍膽藥材（DH6），按照“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，依照“2.1”項下條件進樣，測定馬錢苷酸、獐牙菜苷、異葒草苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷、大花龍膽苷A 的平均含量分別為2.668、0.782、1.227、9.560、6.719、1.395、1.852、13.962 mg/g，RSD 值分別為1.20%、1.02%、0.65%、0.75%、0.49%、0.38%、0.91%、0.64%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取0.25 g 已知含量的大花龍膽藥材粉末（DH6）6 份，加入一定量混合對照品溶液適量（相當于藥材中各被測成分含量的100%），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算大花龍膽苷A、馬錢苷酸、獐牙菜苷、異葒草苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷的平均回收率分別為99.65%、96.51%、100.87%、96.65%、99.82%、99.84%、103.33%、100.91%；RSD 分別為1.66%、2.36%、1.90%、1.34%、1.77%、1.63%、2.24%、2.45%。

2.5 相對校正因子（fs/i）的計算

采用多點矯正法，取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣2、4、6、8、10、15 μL，以大花龍膽苷A 和異葒草苷為內參物，分別計算大花龍膽苷A 對馬錢苷酸、獐牙菜苷、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷的相對校正因子（f）和異葒草苷對異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素的f，見表3、4。

表3 大花龍膽中環烯醚萜類的相對校正因子Table 3 RCF of iridoids in G.szechenyii

表4 大花龍膽中黃酮類的fs/iTable 4 RCF of flavonoids in G.szechenyii

fs/i＝fs/fi=(As×Ci)/(Cs×Ai)

As為內參物s 峰面積，Cs為內參物s 濃度，Ai為待測成分i峰面積；Ci為待測成分i濃度。

2.6 fs/i 的耐用性考察

2.6.1 不同高效液相色譜儀和色譜柱對fs/i的影響 試驗考察了儀器安捷倫1260、島津LC2030 2種不同的高效液相色譜系統和Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SWELL-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Comatex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Sepax GP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）4 種不同的色譜柱，對大花龍膽中6 種有效成分馬錢苷酸、獐牙菜苷、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素的fs/i的影響，結果各成分的RSD 值＜5.0%，表明fs/i在不同的色譜柱和儀器下具有較好的適用性，見表5。

表5 不同儀器和色譜柱對大花龍膽中各成分的fs/i 影響Table 5 Effects of different columns and different instruments on RCF of ingredients in G.szechenyii

2.6.2 柱溫對fs/i的影響 其他色譜條件不變，在不同柱溫(30、35、40 ℃)下測定馬錢苷酸、獐牙菜苷、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素的fs/i，RSD 分別為0.57%、1.47%、0.30%、2.93%、0.99%、0.27%，說明不同柱溫對fs/i的影響無顯著性差異。

2.6.3 不同體積流量對fs/i的影響 其他色譜條件不變，在不同體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）測定馬錢苷酸、獐牙菜苷、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素的fs/i，RSD 值為0.34%、1.53%、0.91%、3.38%、0.18%、0.58%，說明不同體積流量下fs/i具有良好適用性。

2.7 一測多評法（ quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）中待測成分色譜峰定位

本研究采用相對保留時間（ti/s）進行待測成分色譜峰的定位，分別計算馬錢苷酸、獐牙菜苷、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷對參照物大花龍膽苷A 的相對保留時間（tR）以及異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素對參照物異葒草苷的tR，對各成分進行色譜峰定位。結果如表6 所示，各成分tR的RSD 均小于5%，表明可利用tR對各成分進行定位。

表6 不同儀器和色譜柱測得的相對保留值Table 6 Relative retention time of different columns and different instruments

2.8 QAMS 與外標法（external standard method，ESM）的比較

分別精密吸取24 批供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。采用ESM 和QAMS 計算藥材中大花龍膽苷A、馬錢苷酸、獐牙菜苷、異葒草苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷的含量，結果見表7。結果表明，2 種方法測得的含量無顯著性差異，表明建立的QAMS 在環烯醚萜成分與黃酮類成分檢測中的適宜性良好，可為大花龍膽的多指標質量控制標準提供理論參考。

表7 QAMS 與ESM 測得24 批大花龍膽中5 種環烯醚萜類和3 種黃酮類的含量Table 7 Content of five iridoids and three flavones in 24 batches of G.szechenyii by QAMS and ESM

2.9 結果與分析

將24 批不同產地藥材高相液相色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 版）中，以DH6 藥材色譜圖為參照色譜，構建指紋圖譜并進行相似度分析（圖2）。結果發現24 批大花龍膽共有12 個共有峰，保留時間分別為9.934、16.927、28.806、30.25、37.618、40.509、53.446、55.202、65.426、74.451、77.451、81.102 min。24 批大花龍膽藥材與DH6 的相似度在0.956～1.000，這表明不同產地的大花龍膽藥材具有較高的一致性24 批藥材疊加圖譜見圖2。以8 個有效成分含量作為評價指標，運用 GraphPad Prism 進行熱圖分析，見圖3。

圖2 24 批大花龍膽藥材HPLC 圖Fig.2 HPLC chromatograms of 24 batches of G.szechenyii

圖3 不同產地成分差異熱圖Fig.3 Heat map of ingredients of different producing areas

由圖3 可知，大花龍膽中有效成分含量差異顯著，大花龍膽苷A 含量顯著高于其他成分，而獐芽菜苷顯著低于其他成分。結合含量測定結果發現，DH13（四川省阿壩州若爾蓋日爾郎山2 號大橋）樣品中各成分（馬錢苷酸、烏奴龍膽苷D 除外）的質量分數均顯著低于其他產地，分別為1.725、0.125、0.920、1.434、2.710、1.891、0.495、5.943 mg/g。馬錢苷酸、獐芽菜苷、異金雀花素、大花龍膽苷A含量最高的批次均為DH4（質量分數分別為7.911、1.779、8.586、31.593 mg/g）；異葒草苷含量最高的批次為DH14（2.28 mg/g），與最低的DH13（0.920 mg/g）相差2.48 倍；異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷含量最高的批次為DH24，與最低的DH13（1.437 mg/g），相差7.76 倍；烏奴龍膽苷D 含量最高的批次為DH19（4.765 mg/g），與最低的DH6（1.337 mg/g）相差3.56 倍；平龍膽酯苷含量最高的批次為DH3，與最低的DH13（0.502 mg/g）相差10.96 倍。綜上所述，不同產地樣品中成分含量差異十分顯著，四川省甘孜州理塘縣德達鄉小毛亞壩村采集的藥材質量較好，四川省阿壩州若爾蓋日爾郎山2 號大橋采集的藥材質量較差。

將24 批大花龍膽藥材的馬錢苷酸、獐牙菜苷、異紅草苷、異金雀花素苷、異金雀花素、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷、大花龍膽苷A 的含量原始數據導入SIMCA.14.1 統計分析軟件中，進行主成分分析（principal component analysis，PCA），結果見圖4。PCA 結果表明，不同批次大花龍膽分布較為分散，整體離散度較大，這可能與其產地不同有關，不同土壤及氣候對藥材中有效成分含量影響較大。尤其是，四川省甘孜州理塘縣德達鄉小毛亞壩村、四川省阿壩州若爾蓋日爾郎山2 號大橋采集的藥材與其余批次差異較明顯。

圖4 不同產地PCA 得分圖Fig.4 Score plot of PCA of different producing areas

3 討論

大花龍膽作為白花龍膽的主流藥材，主要成分為大花龍膽苷A、馬錢苷酸、獐牙菜苷、異葒草苷、異金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、異金雀花素、烏奴龍膽苷D、平龍膽酯苷[1-4]。其中，大花龍膽苷A和異葒草苷是大花龍膽中環烯醚萜類和黃酮類成分的主要活性成分，含量高且穩定性好，因此選擇大花龍膽苷A 和異葒草苷為內標物，建立QAMS 法，彌補了對照品不足的缺點，實現藏藥材多成分質量控制，也體現了一測多評法低成本的優勢。

參考相關文獻報道[14-18]，本研究采用2 個不同的高效液相色譜儀和4 種不同的色譜柱對相對校正因子進行考察，同時，對柱溫和體積流量也進行了相對校正因子的耐用性考察，結果RSD 值都小于5.0%，說明QAMS 法的系統耐用性良好。

本研究共收集得到不同產地的藥材24 批，根據QAMS 法和ESM 法進行含量測定與分析，結果表明2 種方法的結果基本一致，無顯著差異。驗證了QAMS 法的可行性與準確性。對24 批藥材進行指紋圖譜相似度評價、熱圖分析、PCA，發現不同產地藥材具有較高的一致性，但質量差異顯著。其中，四川省甘孜州理塘縣德達鄉小毛亞壩村地區藥材質量最優。本試驗建立的一測多評法適用于大花龍膽中8 種有效成分的含量測定，相對校正因子穩定；該法不僅節約檢測成本、縮短檢測時間，而且簡化了大花龍膽的定量檢測方法，具有很強的實用性，可為大花龍膽后續的質量評價提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突