基于ITS 和ITS2 序列的藥用石斛DNA 條形碼鑒定研究

張高曼，趙立佳，劉光富，王正亮

中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018

石斛是蘭科（Orchidaceae）石斛屬DendrobiumL.多年生草本植物，我國(guó)有近80 種，其中一半以上種類具有藥用價(jià)值，是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，素有“人間仙草”之稱[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藥用石斛富含多糖、黃酮、生物堿和香豆素等化學(xué)成分，在抗衰老、抗腫瘤、降血糖和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等方面功效顯著[2]。隨著居民生活水平的提高和對(duì)健康飲食的追求，近年來我國(guó)藥用石斛市場(chǎng)需求量逐年增加。然而，石斛對(duì)生長(zhǎng)條件要求苛刻、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖率低，無法滿足日益增長(zhǎng)的消費(fèi)需求。在高額利益的驅(qū)動(dòng)下，一些不法商家在藥用石斛生產(chǎn)和銷售過程中摻偽造假、以次充好，如以相對(duì)廉價(jià)的紫皮石斛、棒節(jié)石斛、銅皮石斛冒充高價(jià)的鐵皮石斛和霍山石斛出售，嚴(yán)重影響了石斛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3-4]。因此，為有效保障消費(fèi)者權(quán)益和穩(wěn)定市場(chǎng)秩序，迫切需要建立快速準(zhǔn)確的藥用石斛種類鑒定技術(shù)體系。

目前，石斛種類鑒定技術(shù)主要包括傳統(tǒng)鑒定技術(shù)、光譜和色譜鑒定技術(shù)以及分子鑒定技術(shù)。傳統(tǒng)鑒定方法主要基于形態(tài)特征，而石斛在非花期及近緣種間外觀極其相似，精深加工后更加難以準(zhǔn)確區(qū)分[5]；光譜和色譜鑒定技術(shù)依據(jù)不同石斛理化特征差異進(jìn)行鑒別，但該方法依賴昂貴儀器，且存在樣品前處理過程復(fù)雜繁瑣、操作耗時(shí)、成本較高等缺點(diǎn)，無法滿足快速和低成本的需求[6-7]。基于核酸檢測(cè)的分子鑒定技術(shù)不受植物生長(zhǎng)環(huán)境、發(fā)育階段、樣品形態(tài)和組織部位的限制，是目前石斛種類鑒別過程中比較主流和權(quán)威的方法，具有操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)[8-10]。其中DNA 條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是利用生物體DNA 中一段標(biāo)準(zhǔn)化的短基因片段對(duì)物種進(jìn)行快速鑒定的新興分子鑒定技術(shù)，近年來已被廣泛應(yīng)用于包括石斛在內(nèi)的諸多藥用植物的種類快速鑒別[11-13]。如基于葉綠體trnH-psbA片段，邵世光等[14]和Yao 等[15]分別對(duì)我國(guó)15 種和17 種藥用石斛進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定；陳文強(qiáng)等[16]通過比較分析9 條候選DNA片段（ITS2、nad1、matK、ycbL、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS、rbcL和trnH-psbA）對(duì)11種藥用石斛的分辨率，最終推薦ITS2＋trnL-trnF組合片段作為鐵皮石斛及其近緣種鑒別的DNA條形碼。

研究表明，DNA 條形碼的物種鑒定效率與待測(cè)物種集的物種數(shù)量密切相關(guān)[17]。Asahina 等[12]和劉靜等[18]分別證明葉綠體序列matK可對(duì)常見的5 種和12 種藥用石斛進(jìn)行區(qū)分，而Singh 等[17]在評(píng)估常用植物DNA 條形碼（matK、rbcL、rpoB、rpoC1、trnH-psbA和ITS）對(duì)36 種石斛屬植物的種類鑒別效率時(shí)，發(fā)現(xiàn)matK僅能有效鑒別約80%的待測(cè)種類。徐素素等[19]對(duì)12 種藥用石斛及其3 種常見混偽品的4 種DNA 條形碼（ITS、ITS2、matK和trnH-psbA）進(jìn)行了序列分析，結(jié)果顯示ITS2 能夠成功區(qū)分12 種藥用石斛及其混偽品。然而，當(dāng)Nguyen 等[20]將石斛物種取樣數(shù)量擴(kuò)大到24 種時(shí)，發(fā)現(xiàn)ITS2 對(duì)石斛物種鑒別效率僅為79%。目前，針對(duì)我國(guó)藥用石斛DNA 條形碼的研究中物種取樣數(shù)量總體偏低，關(guān)于藥用石斛DNA 條形碼適用性相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。為此，本研究收集了鐵皮石斛、金釵石斛、細(xì)莖石斛和密花石斛等27 種藥用石斛樣本，以通用引物擴(kuò)增其ITS 和ITS2 序列，并結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)中其他14 種藥用石斛對(duì)應(yīng)序列，驗(yàn)證DNA 條形碼技術(shù)對(duì)我國(guó)41 種藥用石斛的鑒定能力，旨在進(jìn)一步充實(shí)我國(guó)藥用石斛的DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，為藥用石斛的質(zhì)量控制和市場(chǎng)監(jiān)管奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

本研究涉及藥用石斛共41 種，其中27 種藥用石斛樣本采自浙江、四川、云南、安徽和廣西等地區(qū)，經(jīng)中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉光富高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，分別為鼓槌石斛D.chrysotoxumLindl.、流蘇石斛D.fimbriatumHook.、金釵石斛D.nobileLindl.、鐵皮石斛D.officinaleKimura et Migo、霍山石斛D.huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng、細(xì)莖石斛D.moniliforme(L.) Sw.、束花石斛D.chrysanthumWall.ex Lindl.、兜唇石斛D.aphyllum(Roxb.) C.E.C.Fisch.、密花石斛D.densiflorumLindl.ex Wall.、球花石斛D.thyrsiflorumRchb.f.、玫瑰石斛D.crepidatumLindl.ex Paxt.、喇叭唇石斛D.lituiflorumLindl.、美花石斛D.loddigesiiRolfe、晶帽石斛D.crystallinumRchb.f.、疊鞘石斛D.aurantiacumKerr.、尖刀唇石斛D.heterocarpumLindl.、長(zhǎng)蘇石斛D.brymerianumRchb.f.、紫瓣石斛D.parishiiRchb.f.、短棒石斛D.capillipesRchb.f.、報(bào)春石斛D.primulinumWall.ex Lindl.、腫節(jié)石斛D.pendulumRoxb.、細(xì)葉石斛D.hancockiiRolfe、重唇石斛D.hercoglossumRchb.f.、廣東石斛D.wilsoniiRolfe、小黃花石斛D.jenkinsiiWall.ex Lindl.、杯鞘石斛D.GratiosissimumRchb.f.、大苞鞘石斛D.wardianumWarner、齒瓣石斛D.devonianumPaxt.、曲莖石斛D.flexicauleZ.H.Tsi, S.C.Sun et L.G.Xu、鉤狀石斛D.aduncumWall.ex Lindl.、蘇瓣石斛D.HarveyanumRchb.f.、滇桂石斛D.ScoriarumW.M.Sw、少花石斛D.parciflorumRchb.f.、杓唇石斛D.Moschatum(Buch.-Ham.) Sw.、曲軸石斛D.gibsoniiLindl.、梳唇石斛D.StrongylanthumRchb.f.、勐海石斛D.MinutiflorumS.C.Chen et Z.H.Tsi、聚石斛D.lindleyiStendel、黃石斛D.TosaenseLindl.、藏南石斛D.monticolaP.F.Hunt et Summerh.和串珠石斛D.falconeriHook.。取各樣本鮮莖或鮮葉，保存于?20 ℃冰箱，其余14 種藥用石斛和1 種石仙桃（用于系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的外群）序列信息來自GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)，具體信息見表1。

表1 藥用石斛樣本信息Table 1 Sample information of medicinal Dendrobium species

1.2 儀器與試劑

電子分析天平（Sartorius 公司，美國(guó)）；T100 PCR儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）；渦旋混合器（IKA 公司，德國(guó)）；核酸電泳儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）；自動(dòng)凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）；干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）；高速離心機(jī)（Thermo 公司，美國(guó)）；Nanodrop2000 微量核酸蛋白分析儀（Thermo公司，美國(guó)）；高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3780（Sanyo公司，日本）；DNA Maker（Takara 公司，日本）；植物DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國(guó)）；PrimeSTAR?HS（Premix）（Takara 公司，日本）；DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen 公司，美國(guó)）；引物由杭州有康生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1 基因組DNA 提取

選取藥用石斛新鮮組織（鮮莖或鮮葉），用75%乙醇溶液擦拭，待其表面干燥后稱取0.1 g 組織樣本，用液氮研磨至粉末。按植物基因組DNA 提取試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行基因組總DNA 提取。利用Nanodrop 超微量分光光度計(jì)測(cè)定基因組總DNA 濃度和純度測(cè)定，并通過1%的凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性，合格DNA 樣品置于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

采用通用引物 ITS-5F/ITS-4R （ 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGPCR-3’/5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’）和ITS2F/ITS2R（5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’/5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’）分別擴(kuò)增ITS 和ITS2 序列。PCR 擴(kuò)增體系為50 μL：2×Premix PrimeSTAR HS 25 μL，DNA 模板2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)Chromas 軟件評(píng)估序列峰圖質(zhì)量，除去低質(zhì)量的序列；利用Bioedit 7.0 軟件進(jìn)行正向序列拼接[21]，將所測(cè)序列在NCBI 中進(jìn)行Blast 相似性比對(duì)，驗(yàn)證所獲序列的準(zhǔn)確性。從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與本研究擴(kuò)增區(qū)段一致的藥用石斛ITS 和ITS2序列，通過比對(duì)BOLD 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列準(zhǔn)確性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。綜合本研究所得和公共下載序列數(shù)據(jù)，使用MEGA X 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，去除兩端冗余序列[22]。分析處理后序列的核苷酸組成、變異位點(diǎn)等，基于Kimura-2-parameter（K2P）模型計(jì)算種間和種內(nèi)遺傳距離。以石仙桃為外群，使用1 000 次重復(fù)的置信度以鄰接法（neighbor joining tree，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過在線網(wǎng)站（ http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/）預(yù)測(cè)ITS2 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

物種鑒別效率＝可鑒別的物種數(shù)/研究物種的總數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR 擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析

以各樣本的基因組總DNA 為模板，利用ITS和ITS2 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，序列擴(kuò)增效率達(dá)100%（圖1）。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化和測(cè)序后，共獲得82 條ITS 序列和102條ITS2 序列。NCBI 在線Blast 比對(duì)結(jié)果表明所獲序列均準(zhǔn)確可靠。從GenBank 上獲得41 種藥用石斛（包括本研究采集種類）ITS 和ITS2 序列分別為351 和308 條。

圖1 藥用石斛ITS (A) 和ITS2 (B) 序列擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳示意圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ITS (A) and ITS2 (B) sequence amplification products from medicinal Dendrobium species

本研究PCR 所獲ITS 序列及GenBank 下載序列共433 條，經(jīng)MEGA X 軟件比對(duì)后，修剪成長(zhǎng)度為612 bp 的共有片段進(jìn)行后續(xù)分析。結(jié)果顯示所有位點(diǎn)中保守位點(diǎn)189 個(gè)、可變位點(diǎn)407 個(gè)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)374 個(gè)、單一多態(tài)位點(diǎn)共有33 個(gè)。在堿基組成上，A、T、G、C 的平均含量分別為23.2%、23.7%、28.9%、24.2%。A＋T 總含量46.9%，C＋G 總含量為53.1%。ITS2 序列共410 條，經(jīng)序列對(duì)比并去除兩端冗余序列后長(zhǎng)度為256 bp，其中保守位點(diǎn)59個(gè)、可變位點(diǎn)194 個(gè)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)190 個(gè)、單一多態(tài)位點(diǎn)共有4 個(gè)，分別占序列長(zhǎng)度的23.0%、75.8%、74.2%和1.60%。在堿基組成上，A 占20.4%，T 占27.7%、G 占29.9%、C 占22.0%。A＋T 總含量48.1%，C＋G 總含量為51.9 %。

3.2 遺傳距離分析

基于ITS 序列的藥用石斛遺傳距離分析結(jié)果表明，少花石斛的種內(nèi)遺傳距離最大（0.019 5），鼓槌石斛、霍山石斛、玫瑰石斛等9 種藥用石斛的種內(nèi)遺傳距離均為 0，種內(nèi)平均遺傳距離為0.001 7。種間遺傳距離在0～0.140 7，種間平均遺傳距離為0.072 6，其中最小種間遺傳距離存在于廣東石斛和霍山石斛之間，而勐海石斛和腫節(jié)石斛之間的遺傳距離最大。基于ITS2 序列的藥用石斛種內(nèi)遺傳距離在0～0.012 4，種內(nèi)平均遺傳距離為0.001 0。鼓槌石斛、流蘇石斛、金釵石斛等26 種藥用石斛種內(nèi)遺傳距離均為0，最大種內(nèi)遺傳距離處于滇桂石斛種內(nèi)。種間遺傳距離大小范圍為0～0.199 7，種間平均遺傳距離為0.097 0，其中最小種間遺傳距離存在于黃石斛鐵皮石斛之間、廣東石斛和霍山石斛之間、勐海石斛和藏南石斛之間，而藏南石斛和玫瑰石斛之間的遺傳距離最大（表2）。

表2 基于ITS 和ITS2 序列的藥用石斛種內(nèi)和種間K2P 遺傳距離分析Table 2 Intra- and inter-specific K2P genetic distances of medicinal Dendrobium based on ITS and ITS2

盡管基于ITS和ITS2序列的藥用石斛種間平均遺傳距離均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)平均遺傳距離（分別為30.3 和97.0 倍），但種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離在分布上未出現(xiàn)條形碼間隙（barcoding gap）。基于ITS 序列的種內(nèi)遺傳距離集中于0～0.01 區(qū)域，種間遺傳距離集中分布于0.04～0.09，兩者在0～0.02區(qū)域存在少許重疊（圖2-A）。基于ITS2 序列的種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離之間分別集中0～0.02和0.06～0.12 區(qū)域，但在0～0.02 區(qū)域存在部分重疊（圖2-B）。以某一物種最小種間遺傳距離超過最大種內(nèi)遺傳距離為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估條形碼間隙時(shí)，ITS序列分析顯示可在30 種藥用石斛種類中鑒定到條形碼間隙，但金釵石斛、鐵皮石斛、滇桂石斛、黃石斛、勐海石斛、霍山石斛、廣東石斛、重唇石斛、曲莖石斛、細(xì)莖石和梳唇石斛11 種藥用石斛的最大種內(nèi)遺傳距離超過最小種間遺傳距離（圖2-C）；基于ITS2 序列的遺傳距離比較分析結(jié)果類似，除ITS 序列分析中的30 種藥用石斛外，勐海石斛ITS2 的種內(nèi)和種間遺傳距離之間亦存在條形碼間隙（圖2-D）。上述結(jié)果表明，ITS 和ITS2 作為DNA 條形碼可分別有效區(qū)分待測(cè)的30和31 種藥用石斛。

圖2 藥用石斛ITS 和ITS2 序列的種內(nèi)和種間K2P 遺傳距離分析Fig.2 Intra- and inter-specific K2P genetic distances analysis of medicinal Dendrobium based on ITS and ITS2 sequences

3.3 聚類分析

以石仙桃為外群，分別基于41 種藥用石斛植物的ITS 和ITS2 序列，利用鄰接法構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3、4）。結(jié)果顯示，基于ITS 序列的NJ 樹中，除金釵石斛和重唇石斛，霍山石斛和廣東石斛，曲莖石斛、鐵皮石斛、滇桂石斛和黃石斛，勐海石斛、細(xì)莖石斛和梳唇石斛4 組11 種藥用石斛外，其余30 種不同藥用石斛可各自單獨(dú)聚集于同一單系分支內(nèi)，表明以ITS 序列作為DNA 條形碼可有效區(qū)分本研究中73.2%的藥用石斛種類。由圖4 可知，ITS2 序列鑒定效率為75.6%，除與ITS 序列可有效鑒定的30 種藥用石斛外，還可將勐海石斛有效區(qū)分。可見，基于遺傳距離和聚類分析的物種鑒定效率一致。

圖3 基于41 種藥用石斛ITS 序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.3 Neighbor-joining (NJ) tree of 41 medicinal Dendrobium species based on ITS sequences

圖4 基于41 種藥用石斛ITS2 序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.4 Neighbor-joining (NJ) tree of 41 medicinal Dendrobium species based on ITS2 sequences

3.4 ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

針對(duì)ITS2 序列聚類分析中未能有效區(qū)分的10 種藥用石斛，預(yù)測(cè)其ITS2 序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖5 可知，10 種藥用石斛ITS2 序列均具有“一環(huán)四臂”的典型二級(jí)結(jié)構(gòu)，但螺旋臂的結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)短和復(fù)雜程度在部分石斛間存在明顯不同。如金釵石斛和重唇石斛在NJ 樹中聚為一支，但兩者在ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)上具有明顯差異，金釵石斛ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的Ⅲ臂上的莖環(huán)數(shù)目顯著多于重唇石斛，而重唇石斛近環(huán)端處具有頸環(huán)；在NJ 樹中聚為一支的細(xì)莖石斛和梳唇石斛在ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的“分子形態(tài)”上同樣存在明顯差異；滇桂石斛與曲莖石斛、鐵皮石斛和黃石斛相比，其I 臂Ⅲ臂上莖環(huán)數(shù)目明顯不同。可見，通過ITS2 序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較分析，可進(jìn)一步將金釵石斛、重唇石斛、滇桂石斛、細(xì)莖石斛和梳唇石斛5 種藥用石斛區(qū)分開來。因此，聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹與ITS2 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，ITS2 可有效鑒別36 種藥用石斛種類（NJ 樹分析31 種；二級(jí)結(jié)構(gòu)分析5 種），物種鑒別效率達(dá)到87.8%。

圖5 10 種藥用石斛的ITS2 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structures of ITS2 sequences of 10 medicinal Dendrobium species

4 討論

快速準(zhǔn)確的種類鑒別對(duì)于保障藥用石斛種質(zhì)資源和藥用安全至關(guān)重要。然而，藥用石斛種類眾多，許多種類形態(tài)特征相似，尤其是一些種類僅在花型結(jié)構(gòu)上存在細(xì)微區(qū)別，即使是專業(yè)的分類學(xué)家也很難在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)可以在保證鑒別結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上顯著提高鑒定工作效率，其中DNA 條形碼技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、通用性廣和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥用植物的基原鑒別過程中[23-25]。

本研究評(píng)估了核基因ITS 和ITS2 作為DNA 條形碼在我國(guó)41 種藥用石斛種類鑒別中的適用性。基于K2P 遺傳距離分析顯示，基于ITS 和ITS2 序列分析的藥用石斛平均種間遺傳距離分別為0.072 6 和0.097 0，平均種內(nèi)遺傳距離分別為0.002 4 和0.001 0。能否作為物種鑒別的有效DNA 條形碼，取決于物種種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離之間的差異，但其差異程度還有待商榷[26]。Herbert 等[27]認(rèn)為物種的種間平均遺傳距離大于種內(nèi)平均遺傳距離10 倍以上，且遺傳距離分布上存在“barcode gap”時(shí)，候選基因片段可以作為該研究類群的DNA 條形碼，而Meier 等[28]則建議物種最小種間遺傳距離大于最大種內(nèi)遺傳距離時(shí)即可有效區(qū)分物種。本研究中，基于ITS 和ITS2 序列分析的41 種藥用石斛的平均種間遺傳距離分別是平均種內(nèi)遺傳距離的30.3 和97.0 倍。然而，ITS 和ITS2 序列種內(nèi)最大遺傳距離與種間遺傳最小距離均存在少許重疊，不存在顯著的“barcode gap”。上述結(jié)果說明單一的ITS 和ITS2序列不能完全有效區(qū)分本研究待測(cè)的所有藥用石斛物種，該結(jié)果亦與目前諸多石斛屬植物DNA 條形碼研究結(jié)論一致[19-20,29]。

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹是評(píng)估DNA 條形碼物種鑒別效率的一種直觀的方法，同一物種聚類于同一分支表明該物種可被有效區(qū)分。以石仙桃為外群，基于本研究41 種藥用石斛ITS 和ITS2 序列構(gòu)建NJ 樹。結(jié)果表明，基于遺傳距離和聚類分析的物種鑒定效率完全一致，ITS 和ITS2 可分別有效區(qū)分待測(cè)的30和31 種藥用石斛，鑒別效率分別為73.2%和75.6%。中國(guó)植物DNA 條形碼研究組研究提出將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心DNA條形碼[30]，Chen等[31]則建議將ITS2 序列作為藥用植物鑒定的通用DNA條形碼。本研究中，ITS2 序列的物種鑒別效率稍優(yōu)于ITS 序列的物種分辨能力，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ITS2 作為藥用植物DNA 條形碼的優(yōu)先性。此外，有研究表明，ITS2 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)在藥用植物鑒定中具有著重要輔助作用，可提供物種分類水平上更多的信息，從而提高系統(tǒng)發(fā)育樹重建的穩(wěn)定性[32]。劉紅梅等[34]通過對(duì)14 種石斛屬植物的ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較分析，發(fā)現(xiàn)喉紅石斛與黑毛組石斛親緣關(guān)系最近，認(rèn)為其應(yīng)歸屬于黑毛組石斛[33]。ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)通常具有“一環(huán)四臂”的保守結(jié)構(gòu)，但其中心環(huán)大小以及四臂的長(zhǎng)度、角度和莖環(huán)數(shù)目在不同物種間存在一定差異。本研究結(jié)果表明，NJ 樹分析法無法區(qū)分的金釵石斛、重唇石斛、滇桂石斛、細(xì)莖石斛和梳唇石斛可通過ITS2 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行有效鑒別。因此，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)合ITS2 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，可有效提升藥用石斛種類的鑒定效率。

研究表明，物種取樣數(shù)量可顯著影響DNA 條形碼的物種鑒定效率[17]。Nguyen 等[20]研究顯示ITS和ITS2 作為DNA 條形碼在24 種石斛屬植物種類鑒定中成功率接近80%，但在Xu 等[35]的研究中，隨著石斛種類取樣數(shù)量的擴(kuò)大，發(fā)現(xiàn)ITS 和ITS2的鑒定效率均低于35%。Singh 等[17]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)石斛屬植物物種數(shù)量為36 種時(shí)，DNA 條形碼matK可有效區(qū)分80.56%的待測(cè)種類，但當(dāng)取樣物種數(shù)量擴(kuò)大到52 種時(shí)，其物種鑒別效率下降到76.92%。最近，徐素素等[19]研究表明ITS2 對(duì)我國(guó)12 種藥用石斛的鑒別效率可達(dá)100%，而基于相同分析方法，在本研究41 種藥用石斛中ITS2 的物種鑒定效率僅為75.6%。可見，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論相符，即隨著物種取樣數(shù)量的增加，DNA 條形碼的物種鑒別效率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

目前，關(guān)于DNA 條形碼研究中待測(cè)物種集的物種數(shù)量要求還沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。除物種取樣數(shù)量外，樣本取樣范圍，取樣個(gè)體數(shù)、候選條形碼在待研究類群中的進(jìn)化速度、干擾基因（假基因和內(nèi)生菌）等也是DNA 條形碼物種鑒定效率的重要影響因子[36-38]。鑒于不同候選條形碼在待研究類群中的進(jìn)化速度不同，諸多研究者提出使用不同DNA條形碼片段的組合方案，如生命條形碼聯(lián)盟植物工作組[39]推薦使用rbcL＋matK 組合作為陸生植物種類鑒定的DNA 條形碼。Xu 等[35]通過比較不同組合片段對(duì)亞洲大陸石斛屬植物的鑒定效率，提出ITS＋matK 為最優(yōu)DNA 條形碼組合。近年來，葉綠體全基因組因含有更豐富的變異位點(diǎn)和遺傳信息，已被證實(shí)比單個(gè)和組合DNA 條形碼片段具有更高的物種分辨率，可作為植物種類鑒定的超級(jí)條形碼[40]。我國(guó)石斛種類繁多，除藥用石斛外，還有諸多觀賞性石斛種類，后續(xù)研究有必要進(jìn)一步擴(kuò)大取樣數(shù)量、取樣范圍和取樣個(gè)體數(shù)，并評(píng)估組合條形碼和超級(jí)條形碼的物種鑒定能力，以期獲得可有效區(qū)分我國(guó)所有石斛屬植物的理想DNA 條形碼。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突