基于AMPK/SIRT1/SREBP1信號通路探究膜腎顆粒對膜性腎病大鼠蛋白尿的治療作用

王含香，林 威，崔師妍，徐榮佳，徐鵬昊，黃詩琦，李雨琛，戴欣晴，姜 晨*

1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381

2.廈門市中醫院，福建 廈門 361001

膜性腎病（membranous nephropathy，MN）是一種非炎癥性自身免疫性疾病，其特征是免疫復合物沉積于腎小球基底膜上皮細胞下，最終導致足細胞損傷，產生大量蛋白尿，進一步可發展為腎衰竭[1]。據調查研究顯示，近年來我國各地區MN 的發病率均顯著增加[2-4]，截止到2018 年，華中地區MN 發病率高達24.09%，已超過免疫球蛋白A 腎病（immunoglobulin A nephropathy，IgAN）成為成人最常見的原發性腎小球腎炎[4]。

慢性腎臟疾病中普遍存在脂質代謝異常，脂質積累是導致腎臟病快速進展的重要因素[5]。沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）可通過過氧化物酶體增生物激活受體γ 輔激活子-1α （ peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）的去乙酰化參與控制能量代謝，是肝臟脂質和膽固醇穩態的重要因素[6]，SIRT1 還可以通過激活單磷酸腺苷活化的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）抑制脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）的表達和脂質積累[7]。研究顯示，可以通過抑制SIRT1 介導的甾醇調節元件結合蛋白 1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）信號通路調節足細胞脂質代謝[8]。SIRT1 是AMPK/SREBP1 信號傳導連接的關鍵介質[9]。研究表明，通過抑制AMPK 和SIRT1 表達，介導SREBP1 信號傳導可以調節足細胞脂質合成[10]。

膜腎方是天津中醫藥大學第一附屬醫院楊洪濤教授創制出治療MN 的經驗方劑，由生黃芪、炒白術、枸杞、杜仲、蟬衣、青風藤、鬼箭羽、穿山龍、敗醬草、金櫻子、車前子、五味子、土元、當歸14味藥組成，具有健脾益腎、祛風通絡之效，據此研制的膜腎顆粒使臨床用藥更加方便快捷。前期研究發現膜腎方聯合基礎治療可有效降低患者蛋白尿水平，并且對調節血脂有輔助療效，膜腎顆粒不僅可以減輕MN 大鼠腎小球足細胞損傷，還可有效調節MN 大鼠血脂水平。故本研究將基于AMPK/SIRT1/SREBP1 信號通路觀察膜腎顆粒對MN 大鼠蛋白尿的影響，進一步揭示膜腎顆粒治療MN 的作用機制，為MN 的治療提供思路和方法。

1 材料

1.1 動物

80 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（200±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養于天津市中西醫結合醫院動物實驗室，動物實驗方案經過天津市南開醫院實驗動物倫理委員會審查，倫理編號為NKYY-DWLL-2021-001。

1.2 藥品與試劑

膜腎顆粒（批號20220603，20.5 g/袋）按GMP標準由江蘇九旭藥業有限公司生產，方藥采用免煎顆粒劑，每克膜腎顆粒含生藥5.75 g；環孢素（cyclosporin A，CsA）軟膠囊（國藥準字H10960122）購自杭州中美華東制藥有限公司；陽離子化牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA，批號10711454001）購自德國默克公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；基底膜六胺銀染色液（periodic acidsilver methenamine，PASM，批號DG0090）購自北京雷根生物技術有限公司；尿蛋白定量（urinary protein quantity，UTP）測試盒（批號C035-2-1）、膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號A111-1-1）、三酰甘油（triglyceride，TG）試劑盒（批號A100-1-1）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號C013-2-1）、血肌酐（serum creatinine，Scr）試劑盒（批號C011-2-1）購自南京建成生物有限公司；AMPKα 兔抗（批號2532）、p-AMPKα 兔抗（批號50081）購自美國CST 公司；Nephrin 兔抗（批號ab216692）、SREBP1兔抗（批號ab28481）購自英國Abcam 公司；SIRT1兔抗（批號MA5-27217）購自美國Invitrogen 公司；β-actin 鼠抗（批號UM4001）購自天津優抗生物技術有限公司；HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗（批號bs-0295G-HRP）、HRP 標記的羊抗小鼠IgG 二抗（批號bs-0296G-HRP）購自Bioss 公司。

1.3 儀器

Micro17 型低溫高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；全自動生化分析儀（日本Olympus公司）；E100 型正置光學顯微鏡（日本Nikon 公司）；PowerPac HC 型電泳儀、Trans-Blot SD 型轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；SpectraMaxM5 型酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；TS-200 型脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Tanon 5200 型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

80 只大鼠適應性喂養1 周后，收集24 h 尿液測定24 h-UTP，蛋白尿陰性，隨機分為空白組15 只和造模組65 只。按照改良Border 法[11]采用尾iv CBSA 制備MN 大鼠模型。預免疫1 周后正式免疫，將質量濃度為2 mg/L 的C-BSA 與等量PBS 充分混勻后進行尾iv，每次0.5 mL，空白組注射等體積生理鹽水，隔日1 次，連續4 周。注射結束后，隨機抽取造模組大鼠2 只，于光鏡下觀察腎臟病理學改變，同時以24 h-UTP≥20 mg 確認造模成功。造模成功的大鼠隨機分為模型組、CsA（9 mg/kg）組和膜腎顆粒低、高劑量（1.85、7.38 g/kg，分別相當于臨床劑量的0.5、2 倍）組，每組15 只，給藥前將研磨成細粉的藥物溶于蒸餾水，按10 mL/kg ig 給藥，空白組及模型組ig 等體積蒸餾水，1 次/d，連續給藥4 周。

2.2 標本采集

造模前、造模后、給藥結束后分別收取大鼠24 h尿液。末次留取尿液后，以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取腹主動脈采血約5 mL，離心后取血清置于?80 ℃冰箱保存；摘取右腎置于凍存管中，?80 ℃保存；將左腎置于10%中性緩沖福爾馬林中固定。

2.3 24 h-UTP 及血清生化指標檢測

嚴格按照試劑盒要求使用全自動生化分析儀檢測血清各指標，包括BUN、Scr、TC、TG；采用雙縮脲比色法檢測24 h-UTP。

2.4 腎組織病理形態學觀察

將固定在10%中性緩沖福爾馬林的大鼠腎臟組織取出，乙醇梯度脫水，經石蠟包埋后制成4 μm 的切片，進行HE 染色及PASM 染色，光學顯微鏡觀察腎小球變化。

2.5 Western blotting 檢測大鼠腎臟相關蛋白表達

在無菌離心管中將腎組織研磨均勻后加入RIPA 裂解液，提取腎組織總蛋白，BCA 法進行蛋白定量。蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，室溫封閉2 h，分別加入Nephrin（1∶1 000）、AMPKα（1∶1 000）、p-AMPKα（1∶500）、SIRT1（1∶1 000）、SREBP1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜；加入二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，掃描條帶，用Image Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 大鼠一般情況

造模開始前，大鼠各方面情況良好；造模結束后，空白組大鼠精神狀態及活動性良好，皮毛有光澤，進食如常；造模組大鼠死亡3 只，其余大鼠出現不同程度精神不佳、倦怠懶動、皮毛顏色發黃且光澤度下降、進食減少等情況。經藥物干預后，各治療組大鼠精神狀態、毛色、活動性、飲食情況均有所改善。

3.2 膜腎顆粒對MN 大鼠24 h-UTP 的影響

如表1 所示，造模前各組大鼠24 h-UTP 無明顯差異，造模后大鼠24 h-UTP 均明顯升高（P＜0.01），提示造模成功。給藥結束后，與模型組比較，各給藥組大鼠24 h-UTP 均明顯降低（P＜0.01）；與膜腎顆粒低劑量組比較，膜腎顆粒高劑量組和CsA 組24 h-UTP 均明顯降低（P＜0.01）；與CsA 組比較，膜腎顆粒高劑量組24h-UTP 有明顯差異（P＜0.01）。

表1 膜腎顆粒對MN 大鼠24 h-UTP 的影響 (±s, n = 15)Table 1 Effect of Moshen Granules on 24 h-UTP of MN rats (±s , n = 15)

表1 膜腎顆粒對MN 大鼠24 h-UTP 的影響 (±s, n = 15)Table 1 Effect of Moshen Granules on 24 h-UTP of MN rats (±s , n = 15)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：△△P＜0.01；與膜腎顆粒低劑量組比較：▲▲P＜0.01；與CsA 組比較：##P＜0.01，下表同。**P < 0.01 vs blank group; △△P < 0.01 vs model group; ▲▲P < 0.01 vs Moshen Granules low-dose group; ##P < 0.01 vs CsA group, same as below tables.

組別 劑量/(g·kg?1) 24 h-UTP/(mg·24 h?1)造模前 造模后 給藥結束后空白 — 6.27±0.57 6.60±0.64 8.08±0.81模型 — 6.66±0.50 84.30±0.53** 92.02±1.59**CsA 0.00 9 6.42±0.68 84.08±0.91** 53.02±1.17△△▲▲膜腎顆粒 1.85 6.28±0.66 84.24±0.51** 65.18±1.17△△7.38 6.37±0.63 84.38±0.46** 55.16±1.22△△▲▲##

3.3 膜腎顆粒對MN 大鼠腎功能的影響

如表2 所示，各組大鼠BUN、Scr 水平無明顯差異。

表2 膜腎顆粒對MN 大鼠腎功能的影響 (±s, n = 15)Table 2 Effect of Moshen Granules on kidney function of MN rats (±s , n = 15)

表2 膜腎顆粒對MN 大鼠腎功能的影響 (±s, n = 15)Table 2 Effect of Moshen Granules on kidney function of MN rats (±s , n = 15)

組別 劑量/(g·kg?1) BUN/(mmol·L?1) Scr/(μmol·L?1)空白 — 6.44±0.11 38.84±1.93模型 — 6.54±0.09 39.44±1.30 CsA 0.009 6.49±0.11 38.77±1.40膜腎顆粒 1.85 6.49±0.08 39.55±1.56 7.38 6.47±0.11 38.75±1.56

3.4 膜腎顆粒對MN 大鼠腎臟病理變化的影響

如圖1 所示，空白組大鼠腎小球的形態未見明顯改變；模型組大鼠腎小球體積明顯增大，腎小球毛細血管基底膜彌漫性增厚，可見空泡樣變性形成；與模型組比較，各給藥組大鼠腎小球體積增大不明顯，腎小球毛細血管基底膜增厚不顯著，僅有少量空泡樣變性形成，病理改變均較模型組明顯減輕。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化 (×400)Fig.1 Pathological changes of kidney tissue of rats in each group (× 400)

3.5 膜腎顆粒對MN 大鼠血脂的影響

如表3 所示，與空白組比較，模型組TC、TG水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TC、TG 水平均明顯降低（P＜0.01）；與CsA 組比較，膜腎顆粒低劑量組TC、TG 水平有明顯差異（P＜0.01）。

表3 膜腎顆粒對MN 大鼠血脂的影響 (±s , n = 15)Table 3 Effect of Moshen Granules on blood fat of MN rats (±s , n = 15)

表3 膜腎顆粒對MN 大鼠血脂的影響 (±s , n = 15)Table 3 Effect of Moshen Granules on blood fat of MN rats (±s , n = 15)

組別 劑量/(g·kg?1) TC/(mmol·L?1) TG/(mmol·L?1)空白 — 1.19±0.03 0.50±0.03模型 — 2.00±0.03** 1.02±0.05**CsA 0.009 1.60±0.02△△ 0.70±0.03△△膜腎顆粒 1.85 1.81±0.05△△## 0.76±0.04△△##7.38 1.59±0.03△△ 0.69±0.05△△

3.6 膜腎顆粒對MN 大鼠腎組織Nephrin 蛋白表達的影響

如圖2 所示，與空白組比較，模型組腎組織Nephrin 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，膜腎顆粒高劑量組和CsA 組Nephrin 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。

圖2 膜腎顆粒對MN 大鼠腎組織Nephrin 蛋白表達的影響 (±s , n = 3)Fig.2 Effect of Moshen Granules on Nephrin protein expression in renal tissue of MN rats (±s , n = 3)

3.7 膜腎顆粒對MN 大鼠腎組織AMPK/SIRT1/SREBP1 通路相關蛋白表達的影響

如圖3 所示，各組腎組織AMPKα 蛋白表達水平無顯著差異。與空白組比較，模型組腎組織p-AMPKα、p-AMPKα/AMPKα 和SIRT1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），SREBP1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，CsA 組和膜腎顆粒高劑量組p-AMPKα、p-AMPKα/AMPKα 和SIRT1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），各給藥組SREBP1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與CsA 組比較，膜腎顆粒低劑量組p-AMPKα/AMPKα 有明顯差異（P＜0.05）；與膜腎顆粒低劑量組比較，CsA 組和膜腎顆粒高劑量組SREBP1 蛋白表達水平有明顯差異（P＜0.05）。

圖3 膜腎顆粒對MN 大鼠腎組織AMPK/SIRT1/SREBP1 通路相關蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig.3 Effect of Moshen Granules on AMPK/SIRT1/SREBP1 pathway-related protein expressions in renal tissue of MN rats(±s, n = 3)

4 討論

MN 屬中醫學“水腫”“尿濁”范疇，楊洪濤教授將MN 的病機歸為脾腎虧虛、風濕瘀毒。脾虛則運化升清失調，痰濁內生，加之風邪擾動，水濕瘀阻腎絡，導致腎臟功能損傷，故創立膜腎方治以健脾益腎、祛風通絡。膜腎顆粒原方中生黃芪、炒白術健脾益氣，枸杞、杜仲滋補肝腎，4 藥共為君藥，以補為固，填精固精，兼利水飲，故能降尿蛋白水平、利尿消腫；蟬蛻、青風藤祛風通絡除濕，當歸、鬼箭羽、土鱉蟲、穿山龍活血養血、祛瘀通絡，六味共為臣藥；金櫻子與五味子收斂固澀，車前子利水消腫，此“三子”可助芪術增強固精利水之功，共為佐藥；敗醬草以其清熱祛瘀兼解藥毒為使藥；諸藥合用共奏健脾益腎、祛風通絡之效。現代醫學研究結果顯示黃芪甲苷可以調節細胞骨架和絲裂原活化蛋白激酶減輕補體膜攻擊復合物誘導的足細胞損傷[12]；枸杞多糖可升高2 型糖尿病患者高密度脂蛋白膽固醇水平[13]；當歸主要有效成分之一阿魏酸可以通過調節MN 大鼠氧化應激、血管生成、免疫反應減輕足細胞損傷[14]；五味子苷B 可減輕氯化汞誘導的腎小管損傷和線粒體氧化應激[15]；車前子提取液可調節大鼠脂代謝紊亂[16]。本研究結果顯示膜腎顆粒可以減輕MN 大鼠腎臟病理學變化，減少蛋白尿，降低MN 大鼠血清TC、TG 水平。

慢性腎臟病中普遍存在的脂質積累是造成腎小球損傷重要原因[5]。足細胞損傷是MN 主要病理表現，而脂質代謝異常導致腎組織內膽固醇積累或細胞內游離脂肪酸水平升高，促使足細胞線粒體功能障礙誘導損傷[17]。本研究發現膜腎顆粒能促進足細胞特異性蛋白Nephrin 表達，減輕足細胞損傷，維持濾過屏障穩定，減少蛋白尿。AMPK 和SIRT1 是在真核細胞中共同存在的燃料感應分子[18]。當細胞能量狀態降低，AMPK 通過促進脂肪酸氧化，抑制TG 和蛋白質合成及細胞增殖來恢復能量平衡[19]。當能量過剩，下調的AMPK 導致脂肪酸氧化減少以及脂質和蛋白質合成增加[20]。SIRT1 亦可對能量增加或減少做出反應[21-22]，同時SIRT1 和AMPK 可以相互正向調節[7,23]。研究發現鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2（sodium-dependent glucose transporters 2，SGLT2）抑制劑在脂肪細胞中誘導AMPK 和SIRT1表達升高，可改善脂質代謝和脂肪酸氧化[24]。本研究模型組大鼠較空白組腎臟組織 p-AMPKα/AMPKα 降低，SIRT1 表達顯著減少，提示MN 大鼠腎臟中存在脂質代謝紊亂；經膜腎顆粒高劑量治療后大鼠腎臟p-AMPKα/AMPKα、SIRT1 表達升高，提示膜腎顆粒可能誘導AMPK 和SIRT1 表達升高改善MN 大鼠腎臟脂質代謝及脂肪酸氧化。SREBP1是重要的脂代謝轉錄因子，上調其水平可優先激活下游脂肪酸合成相關基因[25]，使脂質合成增加，其中乙酰輔酶A 羧化酶1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）為脂肪酸合成的關鍵限速酶，硬脂酰輔酶A 去飽和酶（steaoryl-CoA desaturase promoter，SCD）為單不飽和脂肪酸合成的限速酶。研究發現，SIRT1 能夠去乙酰化SREBP1[26]，降低其脂化活性，p-AMPK 亦可抑制 SREBP1 蛋白水解成熟[27]，從而抑制SREBP1 依賴性脂肪生成。本研究結果顯示模型組大鼠較空白組腎臟組織SREBP1 表達顯著升高，提示在MN 大鼠腎臟中SREBP1 介導的脂質合成增多；經高劑量膜腎顆粒治療后大鼠腎臟SREBP1 表達降低，提示其介導的脂質合成也減少。研究結果提示膜腎顆粒可能通過上調AMPK/ SIRT1 抑制SREBP1 對脂肪酸合成的促進作用，影響足細胞脂代謝重編程，減輕足細胞損傷，從而達到降低蛋白尿水平、治療MN 的目的。

綜上，膜腎顆粒對MN 具有顯著治療效果，可減少MN 大鼠蛋白尿，減少足細胞脂質合成，減輕足細胞損傷，維持腎小球濾過功能，這可能與AMPK/SIRT1/SREBP1 信號通路有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突