脈絡(luò)舒通丸對精索靜脈曲張模型大鼠線粒體介導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的影響

賈志超，李嘯林，呂東方，楊恩華，鞏文嬌，高兆旺，仲崇副*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 男科，山東 濟(jì)南 250014

精索靜脈曲張（varicocele，VC）作為一種男性常見的生殖系統(tǒng)疾病，是導(dǎo)致男性不育癥的重要原因[1]，可引起睪丸生精功能的進(jìn)行性減退、睪酮分泌逐漸減少、精液質(zhì)量下降等病理性改變[2]。臨床上VC 多見于青壯年男性，其發(fā)病率在正常男性中約為20%，而在不育癥男性中發(fā)病率可達(dá)40%。目前，國內(nèi)外針對VC 性不育癥的治療包括手術(shù)和抗氧化治療，且以手術(shù)治療為主，但仍存在近50%的患者術(shù)后未能實現(xiàn)自然生育[3-4]。VC 在中醫(yī)學(xué)中多歸屬于“筋疝”的范疇，中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為本病與血瘀、氣虛以及腎虛等因素有關(guān)，病機(jī)主要為虛實夾雜，兼有濕、熱、瘀等邪氣為患，治療上多在“活血化瘀”的同時，兼以“清熱”“補(bǔ)虛”“解郁”“通絡(luò)”等[5-6]。脈絡(luò)舒通丸具有化瘀通絡(luò)、清熱解毒等功效，在VC 的治療中能明顯提高患者的精液質(zhì)量[7]。中醫(yī)藥在VC 所致男性不育癥的治療中具有顯著的優(yōu)勢，但目前缺乏相關(guān)機(jī)制的研究[8-9]。

細(xì)胞凋亡在維持生物體內(nèi)的自穩(wěn)態(tài)中具有重要的生理意義[10]。生理條件下，睪丸的生精功能以生精細(xì)胞增殖與凋亡的平衡為基礎(chǔ)。生精細(xì)胞過度凋亡能夠減少正常精子的生成，進(jìn)而影響男性的生育能力[11]。線粒體作為細(xì)胞凋亡的重要途徑，能夠參與并調(diào)控睪丸中正常精子的生成及發(fā)育[12]，既往研究顯示，VC 模型大鼠睪丸組織中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷明顯，可能是VC 導(dǎo)致男性不育癥的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[13]。為進(jìn)一步探討脈絡(luò)舒通丸治療VC 性不育癥的作用機(jī)制，本研究以線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，探討脈絡(luò)舒通丸對VC 所致生精細(xì)胞凋亡的影響，為VC 所致男性不育癥的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠36 只，8 周齡，體質(zhì)量（240±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2021-0011，飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物實驗中心。大鼠每籠6只，分籠喂養(yǎng)，室溫（22±1）℃、相對濕度（60±2）%，12 h/12 h 光暗周期。大鼠全天自由攝食飲水，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。所有涉及動物的實驗程序均獲得山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2021-40）。

1.2 藥品與試劑

脈絡(luò)疏通丸（國藥準(zhǔn)字 Z20090636，批號131421120）由山東魯南藥業(yè)集團(tuán)提供，每丸質(zhì)量約0.056 g，由金銀花、玄參、水蛭、黃芪、蒼術(shù)、蜈蚣等藥物組成，使用時取適量脈絡(luò)舒通丸粉末溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）溶液中，制備懸濁液備用；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號66470-2-Ig）、Caspase-9 抗體（批號66169-1-Ig）購自美國Proteintech 公司；線粒體動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）抗體（批號ab184247）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）抗體（批號 ab32503）、免疫組化二抗（批號ab150115）、細(xì)胞色素C 氧化酶IV（cytochrome C oxidase Ⅳ，COX Ⅳ）抗體（批號ab131177）購自英國Abcam 公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液（批號C1002）購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器

EMUC7 型超薄切片機(jī)（德國Leica 公司）；HT7800 型透射電鏡（TEM，日本日立公司）；Eclipse Ti-SR 型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

將36 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、脈絡(luò)舒通丸低、中、高劑量（0.162、0.324、0.648 g/kg）[14]組，每組6 只。采用Turner 創(chuàng)建的狹窄左腎靜脈法[15]建立VC 大鼠模型，采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，脫毛后以仰臥位固定大鼠。打開腹腔，將左側(cè)腹部內(nèi)容物輕推并固定至右上腹，使左腎靜脈充分顯露于視野。在左腎靜脈下橫置一直徑0.85 mm 的金屬探針，用4-0 絲線結(jié)扎后抽出探針，造成大鼠左腎靜脈局部狹窄。觀察左腎約2 min 以確定該器官無明顯缺血。最后腹腔內(nèi)應(yīng)用青霉素防止感染，逐層縫合傷口。假手術(shù)組僅游離左腎靜脈，不予結(jié)扎。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為左精索靜脈與右精索靜脈相比明顯迂回擴(kuò)張，且左腎無萎縮。既往研究顯示，該方法誘導(dǎo)的VC 模型大鼠在造模成功后7～28 d 出現(xiàn)睪丸組織損害，并引起生精細(xì)胞過度凋亡，嚴(yán)重影響了睪丸的生精功能[16-17]。造模成功7 d 后，各給藥組ig 相應(yīng)藥物，空白組、假手術(shù)組和模型組ig 等體積的CMC-Na 溶液，1 次/d，連續(xù)4 周。

2.2 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察睪丸及附睪組織病理學(xué)改變

給藥結(jié)束后，處死大鼠，取睪丸及附睪組織，于4%多聚甲醛緩沖液中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水后，依次置于二甲苯中透明處理，石蠟包埋，制備4 μm切片，隨后進(jìn)行HE 常規(guī)染色，于顯微鏡下觀察睪丸及附睪組織的病理學(xué)改變。對睪丸組織顯微鏡下視野內(nèi)隨機(jī)10 處生精小管區(qū)域應(yīng)用Johnsen 評分評估模型大鼠睪丸的生精功能。

2.3 TEM 觀察睪丸組織線粒體結(jié)構(gòu)

切取米粒大小睪丸組織迅速置于提前預(yù)冷的戊二醛中固定，經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗后，再次置于鋨酸固定液中固定并沖洗，依次經(jīng)脫水，包埋，聚合處理后，做成60～80 nm 超薄切片，鈾鉛雙染色后于TEM 下觀察生精細(xì)胞中線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。

2.4 免疫熒光檢測睪丸組織Drp1、Bax 和COX Ⅳ表達(dá)

取米粒樣大小睪丸組織于4%多聚甲醛中固定，脫水處理后，制備4 μm 切片。預(yù)冷PBS 清洗3 遍，0.1% TritonX-100 室溫下通透20 min；預(yù)冷PBS 清洗3 遍，10%山羊血清室溫封閉30 min，棄去封閉血清后，一抗4 ℃孵育過夜，預(yù)冷PBS 清洗3 遍，二抗37 ℃避光孵育2 h；預(yù)冷PBS 清洗3 遍，滴加DAPI，于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 免疫組化檢測睪丸組織Caspase-9 和Caspase-3表達(dá)

使用4%多聚甲醛緩沖液中固定切取的睪丸組織，經(jīng)脫水、包埋處理后，進(jìn)行石蠟切片，厚度4 μm。切片經(jīng)脫蠟、沖洗后，依次加入一抗、二抗，隨后滴加DAPI 染液，染色后再次沖洗并用抗熒光淬滅封片劑封片，于顯微鏡下觀察并拍照，檢測睪丸組織Caspase-9、Caspase-3 表達(dá)，評估睪丸中生精細(xì)胞凋亡水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織病理變化的影響

如圖1 所示，空白組與假手術(shù)組大鼠睪丸病理染色結(jié)果相似，可見生精上皮細(xì)胞形態(tài)飽滿，排列齊整，管腔結(jié)構(gòu)完備，其中精原細(xì)胞、精母細(xì)胞等各級生精細(xì)胞排列緊密，層次清晰，并有大量精子細(xì)胞存在于管腔；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠生精細(xì)胞形態(tài)萎縮，層次混亂，生精小管管壁變薄，甚則發(fā)生萎縮、塌陷，各級生精細(xì)胞數(shù)量明顯下降，管腔內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)量稀少；藥物治療4 周后，各給藥組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)較模型組大鼠均得到明顯改善，生精小管管腔結(jié)構(gòu)接近正常水平，仍存在少量上皮細(xì)胞脫落，但各級生精細(xì)胞數(shù)量明顯增加且排列逐漸規(guī)整，管腔內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)量顯著增加。其中，脈絡(luò)舒通丸中、高劑量組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)和生精細(xì)胞數(shù)量的改善效果最為顯著。

圖1 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織病理變化的影響 (HE)Fig.1 Effect of Mailuo Shutong Pills on pathological changes of testicular tissue in VC model rats (HE)

如圖2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠睪丸組織Johnsen 評分明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，脈絡(luò)舒通丸各劑量組睪丸組織Johnsen 評分顯著升高（P＜0.01）。

圖2 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織Johnsen 評分的影響 (±s , n = 6)Fig.2 Effect of Mailuo Shutong Pills on Johnson score of testicular tissue in VC model rats (±s , n = 6)

3.2 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠附睪組織病理變化的影響

如圖3 所示，空白組與假手術(shù)組大鼠均可見附睪上皮細(xì)胞邊界清晰，排列緊密有序，管腔結(jié)構(gòu)規(guī)則，可見其中存在大量正常精子；模型組可見附睪上皮細(xì)胞排列混亂，并伴有部分上皮細(xì)胞脫落，管腔排列松散無序且存在不同程度的萎縮，管腔內(nèi)精子數(shù)量顯著下降；藥物治療4 周后，各給藥組大鼠附睪上皮細(xì)胞排列逐漸整齊，管腔結(jié)構(gòu)飽滿，排列有序，管腔內(nèi)精子濃度明顯增加；其中，脈絡(luò)舒通丸中、高劑量組附睪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及精子數(shù)量接近，明顯優(yōu)于脈絡(luò)舒通丸低劑量組。

圖3 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠附睪組織病理變化的影響 (HE)Fig.3 Effect of Mailuo Shutong Pills on pathological changes of epididymal tissue in VC model rats (HE)

3.3 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖4 所示，空白組生精細(xì)胞形態(tài)基本規(guī)則，細(xì)胞核呈橢圓形，其胞質(zhì)內(nèi)線粒體含量豐富，分布廣泛，多數(shù)呈橢圓形或短桿狀，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)飽滿，層次基本清晰，存在少數(shù)線粒體內(nèi)嵴減少，膜電子密度稍高；假手術(shù)組生精細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與空白組相近，線粒體數(shù)量豐富，但線粒體內(nèi)嵴數(shù)量減少，線粒體體積縮小，膜電子密度偏高；與假手術(shù)組比較，模型組線粒體內(nèi)嵴數(shù)量下降，多數(shù)線粒體體積縮小，部分線粒體出現(xiàn)腫脹變形，內(nèi)嵴斷裂甚至消失，呈現(xiàn)空泡樣改變；藥物治療后，線粒體結(jié)構(gòu)損傷較模型組有所減輕，線粒體內(nèi)嵴數(shù)量得到不同程度的增加。其中，脈絡(luò)舒通丸中、高劑量組較低劑量組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善，體積大小接近空白組，線粒體內(nèi)嵴數(shù)量顯著增加且形態(tài)更為飽滿。

圖4 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of Mailuo Shutong Pills on mitochondrial ultra microstructure of testicular tissue in VC model rats

3.4 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織Drp1、Bax 和COX Ⅳ表達(dá)的影響

COX Ⅳ定位于線粒體內(nèi)膜，蛋白表達(dá)穩(wěn)定，且熒光標(biāo)記明亮，便于定位，故選取COX Ⅳ作為線粒體內(nèi)參。如圖5 所示，空白組、假手術(shù)組以及脈絡(luò)舒通丸各給藥組COX Ⅳ熒光表達(dá)強(qiáng)度未見顯著差異，但模型組的熒光表達(dá)數(shù)量有所下降且分布混亂，提示線粒體結(jié)構(gòu)遭到破壞。Drp1 在空白組和假手術(shù)組中綠色熒光強(qiáng)度暗淡，在模型組可見高強(qiáng)度的熒光表達(dá)；與模型組比較，各給藥組Drp1 熒光表達(dá)均有不同程度的下降，中、高劑量給藥組熒光強(qiáng)度接近。Bax 在空白組和假手術(shù)組中粉色熒光表達(dá)微弱，在模型組熒光強(qiáng)度明亮，藥物治療后，各治療組的粉色熒光表達(dá)較模型組減弱，且中、高劑量組熒光強(qiáng)度相似。為檢測Drp1 和Bax 表達(dá)水平的變化及其與線粒體的位置關(guān)系，本研究檢測了Drp1、Bax 及COX Ⅳ三者的共定位關(guān)系，結(jié)果顯示，Drp1 與Bax 在各組的熒光表達(dá)趨勢相似，且隨著二者表達(dá)水平的升高，Merge 圖上亮白色熒光團(tuán)塊表達(dá)數(shù)量增多，以模型組表達(dá)水平最高，中、高劑量給藥組較模型組熒光表達(dá)水平明顯降低，且二者亮白色熒光表達(dá)水平相近。

圖5 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織Drp1、Bax 及COX Ⅳ表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Mailuo Shutong Pills on Drp1, Bax and COX IV expressions of testicular tissue in VC model rats

3.5 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織Caspase-9表達(dá)的影響

如圖6 所示，Caspase-9 蛋白在熒光顯微鏡下被標(biāo)記為褐色，空白組及假手術(shù)組大鼠睪丸組織中可見Caspase-9 零星表達(dá)；與假手術(shù)組比較，Caspase-9 在模型組睪丸組織中大量分布（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組Caspase-9 表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度降低（P＜0.05、0.01），且脈絡(luò)舒通丸中、高劑量組Casepase-9 表達(dá)水平相近。

圖6 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織Caspase-9 表達(dá)的影響 (±s, n = 6)Fig.6 Effect of Mailuo Shutong Pills on Caspase-9 expression of testicular tissue in VC model rats (±s, n = 6)

3.6 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織Caspase-3表達(dá)的影響

如圖7 所示，Caspase-3 蛋白在熒光顯微鏡下被標(biāo)記為棕色，主要分布于細(xì)胞質(zhì)及生精小管管壁周圍。空白組及假手術(shù)組大鼠睪丸組織中Caspase-3 僅在生精小管基底部零星表達(dá)；與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-3 的表達(dá)水平在睪丸組織中顯著增加（P＜0.01），可見棕色標(biāo)記廣泛分布于各級生精細(xì)胞；與模型組比較，各給藥組Caspase-3 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05、0.01），且脈絡(luò)舒通丸中、高劑量組Casepase-3 表達(dá)水平相近，明顯低于低劑量組。

圖7 脈絡(luò)舒通丸對VC 模型大鼠睪丸組織Caspase-3 表達(dá)的影響 (±s, n = 6)Fig.7 Effect of Mailuo Shutong Pills on Caspase-3 expression of testicular tissue in VC model rats (±s, n = 6)

4 討論

VC 是由于精索靜脈發(fā)生血液回流障礙所引起的一種男性生殖系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為睪丸局部靜脈叢出現(xiàn)病理性的迂曲擴(kuò)張[18]。作為導(dǎo)致男性不育最主要的病理性因素，VC 所引起的睪丸生精能力減退是一個復(fù)雜的病理學(xué)過程，其具體機(jī)制當(dāng)前并不明確。現(xiàn)代研究多認(rèn)為其可能與生殖細(xì)胞損傷/凋亡、線粒體損傷、氧化應(yīng)激、缺氧、睪丸內(nèi)溫度升高等病理因素有關(guān)[19-21]。細(xì)胞凋亡是一種受調(diào)節(jié)且主動的程序性死亡過程，是機(jī)體控制細(xì)胞增殖和維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制[22]。生理性的細(xì)胞凋亡能調(diào)控睪丸中生精細(xì)胞與支持細(xì)胞的比例，以保證正常精子的生成[13,23]，若生精細(xì)胞過度凋亡，可能導(dǎo)致睪丸生精功能的下降，進(jìn)而影響男性的生育能力。

VC 在中醫(yī)學(xué)中多歸屬于“筋疝”的范疇，中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為本病多與血瘀、氣虛以及腎虛等多種因素有關(guān)，病機(jī)主要為虛實夾雜，兼有濕、熱、瘀等邪氣為患[24]。脈絡(luò)舒通丸由金銀花、玄參、水蛭、黃芪、蒼術(shù)、蜈蚣、薏苡仁、黃柏、白芍、全蝎、當(dāng)歸、甘草組成，具有祛濕消腫、補(bǔ)氣養(yǎng)血、化瘀通絡(luò)、清熱解毒的功效，在血栓性淺靜脈炎或非急性期深靜脈血栓形成等辨證為濕熱瘀阻的血流障礙性疾病中得到廣泛應(yīng)用[25-26]。方中以黃芪、金銀花為君，黃芪與當(dāng)歸相伍，重以甘溫補(bǔ)氣生血，兼有“甘溫除熱”之意，解除瘀熱互結(jié)之弊；金銀花配以玄參、當(dāng)歸、甘草，取四妙勇安湯中清熱解毒之意，兼以顧護(hù)陰液；當(dāng)歸、白芍共用為臣藥，活血止痛，養(yǎng)血柔筋；黃柏、蒼術(shù)相伍，清熱燥濕，以解下焦?jié)駸幔蛔羲帪樗巍⑷Ⅱ隍迹ザ旧⒔Y(jié)，活血止痛。綜上可知，脈絡(luò)舒通丸“活血化瘀、通絡(luò)止痛、清熱利濕”等功效與VC 的基本病機(jī)相契合。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，脈絡(luò)舒通丸中的多種生物活性成分對氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡具有重要的干預(yù)作用[27-28]。水蛭素能夠增強(qiáng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，并下調(diào)細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[29]；蜈蚣酸性蛋白（centipede acidic protein，CAP）能夠明顯降低Caspase-3 的活性進(jìn)而改善細(xì)胞凋亡[28]；黃芪甲能夠降低Caspase-3 和Bax 的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[30-31]。因此，脈絡(luò)舒通丸能夠通過多種途徑對機(jī)體產(chǎn)生整體的調(diào)節(jié)作用，是臨床VC 治療的不錯選擇，但其治療VC 的具體機(jī)制并不明確。

本研究通過狹窄左腎靜脈的方法模擬VC 對模型大鼠睪丸及附睪組織的持續(xù)性損害，并通過連續(xù)性給藥的方式，探究脈絡(luò)舒通丸通過干預(yù)線粒體途徑的內(nèi)源性凋亡，對VC 模型大鼠睪丸生精功能的保護(hù)機(jī)制。大鼠睪丸及附睪組織的病理染色結(jié)果顯示，模型組大鼠較假手術(shù)組，睪丸內(nèi)的生精小管及附睪管腔出現(xiàn)不同程度的萎縮，并伴有上皮細(xì)胞的脫落，各管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少，且Johnsen 評分降低，證明通過縮窄左側(cè)腎靜脈制備VC 模型大鼠，其睪丸生精功能明顯受損；與模型組比較，脈絡(luò)舒通丸治療后大鼠睪丸及附睪組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)得到明顯改善，Johnsen 評分升高，精子數(shù)量顯著增加，且中、高劑量組睪丸及附睪組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)與假手術(shù)組基本一致，提示脈絡(luò)舒通丸能明顯改善VC 導(dǎo)致大鼠睪丸及附睪組織的損害。

線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑以及死亡受體途徑是細(xì)胞凋亡的3 條主要途徑[10]。線粒體作為一種多功能的細(xì)胞器，不僅精子生成的主要能量來源，還能夠參與調(diào)控活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生、Cyc-C 釋放、Caspase 激活等多種生物學(xué)過程，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的樞紐作用[23]。同時，線粒體自身也是ROS 重要的靶向細(xì)胞器[32-33]。既往研究證明，由于熱應(yīng)激、缺氧等因素的影響，VC 時睪丸內(nèi)氧化還原平衡遭到破壞，氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致睪丸生精功能障礙[20,34]。過量的ROS能夠引起mtDNA 及線粒體結(jié)構(gòu)的改變，造成線粒體相關(guān)功能障礙，最終誘導(dǎo)線粒體途徑內(nèi)源性凋亡的發(fā)生[13]。通過TEM 觀察各組大鼠睪丸組織線粒體結(jié)構(gòu)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠生精細(xì)胞線粒體數(shù)量減少，且線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯損傷，多數(shù)線粒體表現(xiàn)為體積縮小，部分線粒體出現(xiàn)腫脹，甚至發(fā)生破裂，呈現(xiàn)空泡樣改變，提示VC 可導(dǎo)致大鼠睪丸組織線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，線粒體內(nèi)嵴數(shù)量減少，造成線粒體不同程度的損傷。脈絡(luò)舒通丸各治療組睪丸組織線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)相對正常，可見數(shù)量較多的正常形態(tài)線粒體，證明脈絡(luò)舒通丸能夠有效緩解VC 所致大鼠睪丸組織中線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷。

磷酸甘油酸變位酶5（phosphoglycerate mutase 5，Pgam5）作為一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，主要定位于線粒體內(nèi)膜，在線粒體氧化應(yīng)激的條件下，可大量釋放到細(xì)胞質(zhì)中[35]。既往研究證明，Pgam5 能夠與Drp1 以及Bax 相互作用，促進(jìn)Drp1去磷酸化、Bax 向線粒體易位，并形成執(zhí)行內(nèi)源性線粒體凋亡的必需復(fù)合物Bax-Pgam5-Drp1[36-37]。Drp1 是一種調(diào)控線粒體分裂的核心蛋白，以二聚體和四聚體的存在于細(xì)胞質(zhì)中，可被招募至線粒體，催化細(xì)胞內(nèi)線粒體的分裂[38]。Drp1 可與Bax 相互作用，二者結(jié)合并共定位于線粒體，是Bax 向線粒體易位的關(guān)鍵[36]。本研究中模型組大鼠睪丸組織中Drp1 及Bax 的熒光表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著升高，且Merge 圖像顯示亮白色標(biāo)記增加，證明二者均向線粒體易位，且可能在線粒體上形成二聚體結(jié)構(gòu)，這可能是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。脈絡(luò)舒通丸治療后大鼠睪丸組織中Drp1 及Bax 的表達(dá)水平明顯降低，說明脈絡(luò)舒通丸在一定程度上能夠抑制Drp1 的激活，并抑制Drp1 及Bax 向線粒體的募集作用，干預(yù)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。Bax 向線粒體易位可引起線粒體膜電位降低以及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，使得大量的Cyt-C 通過膜間隙排出，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并與凋亡酶激活因子相結(jié)合[39]。

線粒體內(nèi)促凋亡因子Cyt-C 釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）結(jié)合使之寡聚化，激活Caspase-9 并介導(dǎo)Caspase 級聯(lián)反應(yīng)[12]。Caspase-9 作為Caspase 級聯(lián)反應(yīng)的起始酶，能夠切割并活化下游效應(yīng)酶Caspase-3 的前體，釋放大量凋亡誘導(dǎo)因子，降解細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[40]。Caspase-9、Caspase-3 是線粒體途徑內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，可以直觀反映組織細(xì)胞中的凋亡水平[41]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠睪丸組織中Caspase-9、Caspase-3 在生精小管基底部各級生精細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高，而脈絡(luò)舒通丸各治療組較模型組睪丸中Caspase-9、Caspase-3 表達(dá)均存在不同程度的減少，提示脈絡(luò)舒通丸能夠明顯降低睪丸生精細(xì)胞中Caspase 蛋白酶的表達(dá)水平，抑制睪丸組織中Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，減輕生精細(xì)胞的凋亡水平。

綜上，脈絡(luò)舒通丸能有效改善睪丸、附睪及生精細(xì)胞中線粒體的損傷情況，通過抑制線粒體途徑細(xì)胞凋亡必須復(fù)合物Bax-Pgam5-Drp1 的表達(dá)，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，降低睪丸中Caspase-3 表達(dá)水平，干預(yù)Caspase 相關(guān)級聯(lián)反應(yīng)，阻斷凋亡信號的生成及進(jìn)一步傳導(dǎo)，抑制生精細(xì)胞過度凋亡，以保護(hù)睪丸正常的生精功能。本研究中脈絡(luò)舒通丸對VC 所致男性不育癥更深層次的作用機(jī)制研究尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步的實驗驗證。脈絡(luò)舒通丸具有活血化瘀、通絡(luò)止痛等功效，其可能通過對睪丸中線粒體結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，干預(yù)Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，改善VC 患者睪丸的生精功能，提高其自然生育機(jī)率。既往研究證明，VC 患者睪丸中存在氧化還原失衡狀態(tài)，而過量的ROS 可損害線粒體結(jié)構(gòu)，影響睪丸生精功能[42]。本研究基于線粒體對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，通過對睪丸組織中線粒體途徑細(xì)胞凋亡必須復(fù)合物Bax-Pgam5-Drp1 的檢測，證實VC 模型大鼠睪丸組織中Drp1 及Bax 的熒光表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著升高，且二者共表達(dá)位點(diǎn)呈現(xiàn)向線粒體易位趨勢，進(jìn)一步明確了VC 中線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能發(fā)生機(jī)制。同時，脈絡(luò)舒通丸對睪丸中線粒體結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，可能是其治療VC 所致男性不育癥的關(guān)鍵機(jī)制，為治療VC 性不育癥的臨床研究提供了可靠的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突