滋水清肝飲對慢性束縛應激抑郁小鼠皮層ERK/CREB/BDNF 通路及腸道菌群的影響

曹珊珊，史磊磊，張雨涵，史永恒，韓朝軍，王 斌，劉繼平

陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）又稱抑郁障礙，是一種常見的精神疾病，其特征是情緒低落、興趣減退和快樂感減退，發(fā)病率為6.4%～10.4%[1-2]，嚴重降低患者生活質量，使預期壽命縮短近10 年[3]。據(jù)《醫(yī)學正傳》記載，中醫(yī)最早以“郁證”為該疾病名稱，認為情志內傷為郁證主要因素，臟器虛弱為發(fā)病的內在原因，中醫(yī)臨床多配以疏肝、解郁和理氣藥來治療郁證[4]。近幾十年來，抑郁癥引起的全球疾病負擔一直在增加，已成為全球殘疾的主要原因之一[5]，且對MDD 的臨床治愈率僅有27%[6]，已經成為嚴重的醫(yī)學與社會難題。因此，尋找有效防治抑郁癥的措施，對降低其發(fā)病率，提高治療率、提升生活質量、減輕醫(yī)療費用負擔具有重要意義。

滋水清肝飲源自清代名醫(yī)高鼓峰所著《醫(yī)宗己任編·四明心法》[7]，為六味地黃湯和丹梔逍遙散的化裁方，書中記載：“疏肝益腎湯，凡胃脘痛，大便秘結者，肝血虛也，此方主之，逍遙散所不能愈者，此方妙”。全方共11 味藥，具有滋腎養(yǎng)陰、清瀉肝火之效，可用于臨床治療抑郁、失眠等精神類疾病。在臨床治療時發(fā)現(xiàn)，滋水清肝飲能有效改善患者抑郁狀況[8]，減輕氧化應激及炎癥[9-10]。根據(jù)臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者的腸道菌群發(fā)生改變[11]，40%～60%的抑郁癥患者下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）軸出現(xiàn)紊亂[12]，患者外周血腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）含量降低[13]，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）合成減少。基于以上臨床研究基礎，本研究利用慢性束縛應激（chronic restraint stress，CRS）建立小鼠MDD 模型，觀察超氧化物歧化 酶 （ superoxide dismutase ）、丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、5-HT、促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）、皮質酮（corticosterone，CORT）水平以及腸道微生物群的組成和結構，進一步研究其作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性C57BL 小鼠54 只，6～8 周，體質量（20±2）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（川）2020-030。墊料和飼料均由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學中藥藥理實驗動物房。動物實驗獲得陜西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（審查備案編號SUCMDL20210310006）。

1.2 藥材

滋水清肝飲（熟地黃10 g、柴胡6 g、澤瀉10 g、山茱萸10 g、山藥10 g、茯苓10 g、當歸10 g、牡丹皮10 g、酸棗仁10 g、白芍10 克、梔子10 g）飲片均購自陜西中醫(yī)藥大學校醫(yī)院，經陜西中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室顏永剛教授分別鑒定為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根的炮制加工品、傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC 的干燥根、澤瀉科植物澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖、山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉、薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖、多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核、傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels 的干燥根、毛莨科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮、鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子、毛莨科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根、茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果實，均符合《中國藥典》2020 年版一部相關規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

鹽酸氟西汀（批號33323）購自美國MCE 公司；5-HT 試劑盒（批號20221214）、CRH 試劑盒（批號20221020）、ACTH 試劑盒（批號20221020）、CORT試劑盒（批號20221020）、BDNF 試劑盒（批號20221104）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；MDA 試劑盒（批號20230507）、SOD 試劑盒（批號20230508）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號20230307）均購自南京建成生物工程研究所；細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）抗體（批號00115457）、p-ERK1/2 抗體（批號00106696）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號10017731）購自美國Proteintech 公司；環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response binding protein，CREB）抗體（批號4000000113）、p-CREB 抗體（批號5500015117）購自美國Abclonal 公司；羊抗小鼠二抗（BA1050）、羊抗兔二抗（批號BA1051）、BDNF 抗體（批號GB11559）、Iba-1 抗體（批號GB113502-100）、超敏ECL化學發(fā)光液（批號AR1197）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器

EPOCH2NS 型酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；BSA224S 型分析電子天平（德國Sartorius 公司）；UPHW-II-90T 型純水儀（成都超純科技有限公司）；1-15K 型低溫高速離心機（美國Sigma 公司）；Nikon Eclipse C1 型正置熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 滋水清肝飲的制備

滋水清肝飲總方106 g，按照處方配比稱取藥材，先用10 倍量的水浸泡40 min，用煎藥砂鍋武火煮沸后轉文火慢煎1 h，趁熱濾過，再加8 倍量水，武火煮沸后轉文火慢煎40 min，合并濾液后濃縮為生藥量為2 g/mL 的液體。滋水清肝飲方中，山茱萸、山藥為君藥，白芍、柴胡為臣藥，其主要成分有馬錢苷、阿魏酸、芍藥苷及柴胡皂苷。參照《中國藥典》2020 年版一部相關規(guī)定，經高效液相色譜儀測定馬錢苷、阿魏酸、芍藥苷、柴胡皂苷A 的質量分數(shù)分別為（0.221 7±0.008 3）%、（0.018 5±0.000 5）%、（0.963 5±0.002 5）%、（0.332 7±0.002 5）%。

2.2 動物分組、造模及給藥

小鼠適應性喂養(yǎng)7 d，對照組9 只不做處理，造模組45 只采用自制打孔離心管對小鼠進行21 d 慢性束縛應激處理，每天定時將小鼠禁錮于安靜昏暗的環(huán)境6 h[14-15]。造模結束后，對全部小鼠進行糖水偏好實驗。根據(jù)小鼠糖水偏好結果對造模組小鼠進行隨機分組，分別為模型組、鹽酸氟西汀（0.01 g/kg）組和滋水清肝飲低、中、高劑量（8.835、17.670、35.340 g/kg，分別相當于臨床劑量的0.5、1、2 倍）組，每組9 只。各給藥組ig 相應藥物（20 mL/kg），對照組和模型組ig 等體積的生理鹽水，1 次/d，連續(xù)給藥14 d。給藥30 min 后，除對照組外，其余小鼠繼續(xù)進行慢性束縛應激處理。

2.3 行為學檢測

2.3.1 糖水偏好實驗 分別在給藥前及給藥第7、14 天后進行糖水偏好實驗。每只小鼠置于配有2 個相同水瓶的籠中單獨飼養(yǎng)，2 個瓶子分別裝有1%蔗糖水和飲用水。第1 天在適應24 h 后，互換1%糖水和飲用水的水瓶位置，第2 天繼續(xù)適應24 h。第3 天對所有小鼠進行斷水禁食處理24 h，結束后進行2 h 的糖水偏好實驗。糖水偏好實驗前分別稱定1%糖水和自來水瓶質量，2 h 后取下2 個瓶子，再次稱定質量，計算糖水偏好率。

糖水偏好率＝糖水飲用量/(自來水飲用量＋糖水飲用量)

2.3.2 懸尾實驗 分別在給藥第7、14 天后進行懸尾實驗。將小鼠倒掛在頭部距離地面20 cm 高度的裝置上，視頻記錄小鼠6 min 內的懸尾狀態(tài)，當小鼠表現(xiàn)為被動的懸掛且沒有任何的肢體活動時被判定為不動，用秒表計算后4 min 內的累計不動時間。

2.3.3 強迫游泳實驗 分別在給藥第7、14 天后進行強迫游泳實驗。將小鼠放入高24.5 cm、直徑為16 cm 的高硼硅玻璃容器中，容器中盛有20 cm 高度的水，且水溫保持在（23±2）℃，視頻記錄小鼠在6 min 的游泳狀態(tài)，當小鼠在容器中沒有明顯的游泳動作時被認為漂浮不動，用秒表計算后4 min 時間段內的累計不動時間。

2.4 全腦及結腸病理觀察和海馬Iba-1 表達檢測

2.4.1 海馬、皮層及結腸蘇木素-伊紅（HE）染色小鼠斷頸處死，冰上剝離，取固定24 h 以上的全腦組織及結腸組織樣本，制作石蠟切片，片厚4 μm。石蠟切片脫水，脫蠟，蘇木素染色3～5 min，自來水洗，返藍，脫水，伊紅染色5 min，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠海馬CA1區(qū)、皮層及結腸組織病理變化。

2.4.2 免疫熒光染色檢測海馬Iba-1 表達 在脫蠟、水合和抗原修復后，將海馬切片固定在4 ℃的4%多聚甲醛溶液中過夜，然后在室溫下用正常綿羊血清封閉1 h，滴加Iba-1 抗體（1∶4 000），4 ℃孵育過夜，滴加二抗。DAPI 復染細胞核，淬滅組織自發(fā)熒光，封片后鏡檢掃描，觀察海馬CA1 區(qū)小膠質細胞標志物Iba-1 的表達。DAPI 為藍色熒光，Iba-1 為綠色熒光。

2.5 血清及前額葉皮質生化指標的檢測

小鼠眼眶取血，室溫靜置30 min 后，3 500 r/min離心15 min，取上清。按照試劑盒說明書檢測小鼠血清中SOD 活性和MDA、ACTH、CORT、CRH、5-HT 水平，檢測小鼠前額葉皮質SOD 活性和5-HT、BDNF、MDA 水平。

2.6 高通量測序技術測定腸道菌群結構

收集各組小鼠結腸內容物，置于滅菌的EP 管中，?80 ℃凍存。先對微生物組進行總DNA 提取，再對目標片段進行PCR 擴增，擴增產物磁珠純化收回，將PCR 擴增回收產物進行熒光定量，根據(jù)熒光定量結果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合，采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫。上機進行高通量測序，結束后進行篩查分析。

2.7 Western blotting 檢測前額葉皮層組織ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB、BDNF 蛋白表達

取小鼠前額葉皮層，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，充分研磨，4 ℃離心取上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶中封閉，分別加入ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶3 000）、CREB（1∶1 000）、p-CREB（1∶1 000）、BDNF（1∶800）、GAPDH（1∶25 000）抗體，4 ℃過夜；TBST 洗膜3 次，加入二抗室溫孵育；TBST 洗膜3 次，滴加ECL 化學發(fā)光液顯影，利用Image J 軟件計算目的蛋白的相對表達量。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 滋水清肝飲對抑郁小鼠行為學的影響

3.1.1 滋水清肝飲對抑郁小鼠糖水偏好率的影響如表1 所示，與對照組比較，給藥前模型組及各給藥組糖水偏好率顯著下降（P＜0.01）。給藥7 d 后，與模型組比較，鹽酸氟西汀組及滋水清肝飲中劑量組糖水偏好率顯著上升（P＜0.05、0.01）。給藥14 d后，各給藥組糖水偏好率均顯著升高（P＜0.01）。

表1 滋水清肝飲對抑郁小鼠糖水偏好率的影響 (±s , n = 9)Table 1 Effect of Zishui Qinggan Yin on sucrose preference rate of depressed mice (±s , n = 9)

表1 滋水清肝飲對抑郁小鼠糖水偏好率的影響 (±s , n = 9)Table 1 Effect of Zishui Qinggan Yin on sucrose preference rate of depressed mice (±s , n = 9)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下表同。#P < 0.05 ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group, same as below tables.

組別 劑量/(g·kg?1) 糖水偏好率/%給藥前 給藥7 d 給藥14 d對照 — 90.01±2.16 91.97±3.25 89.55±4.74模型 — 52.76±10.83## 51.88±3.45## 46.36±7.80##鹽酸氟西汀 0.01 55.06±13.86## 72.74±5.30* 84.36±9.01**滋水清肝飲 8.835 54.76±9.56## 67.53±12.94 79.90±7.67**17.670 56.02±8.73## 77.30±11.17** 84.53±5.25**35.340 55.40±12.41## 69.59±15.04 80.96±8.27**

3.1.2 滋水清肝飲對抑郁小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間的影響 如表2 所示，與對照組比較，模型組小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間明顯增加（P＜0.01）。給藥7、14 d 后，與模型組比較，各給藥組小鼠懸尾實驗不動時間明顯縮短（P＜0.05、0.01）。給藥7 d 后，鹽酸氟西汀組及滋水清肝飲中劑量組小鼠強迫游泳不動時間均縮短（P＜0.01）；給藥14 d 后，各給藥組小鼠強迫游泳不動時間均明顯縮短（P＜0.01）。

表2 滋水清肝飲對抑郁小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間的影響 (±s, n = 9)Table 2 Effect of Zishui Qinggan Yin on immobility time in tail suspension test and forced swimming test of depressed mice(±s, n = 9)

表2 滋水清肝飲對抑郁小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間的影響 (±s, n = 9)Table 2 Effect of Zishui Qinggan Yin on immobility time in tail suspension test and forced swimming test of depressed mice(±s, n = 9)

組別 劑量/(g·kg?1) 懸尾不動時間/s 強迫游泳不動時間/s給藥7 d 給藥14 d 給藥7 d 給藥14 d對照 — 88.32±13.22 90.19±23.18 86.11±12.59 80.37±11.62模型 — 150.15±15.17## 154.35±8.50## 146.39±14.36## 150.42±16.57##鹽酸氟西汀 0.01 101.01±8.33* 97.07±14.23** 101.92±8.65** 87.59±15.98**滋水清肝飲 8.835 125.46±9.48* 116.94±15.13* 126.77±15.00 120.01±14.57**17.670 108.46±9.48* 100.94±16.13** 102.06±20.13** 90.65±16.36**35.340 120.3±20.95* 115.54±25.95* 133.23±18.28 118.95±10.78**

3.2 滋水清肝飲對抑郁小鼠全腦及結腸病理變化的影響

3.2.1 滋水清肝飲對抑郁小鼠海馬CA1 區(qū)、皮層組織及結腸組織病理變化的影響 如圖1 所示，對照組小鼠海馬CA1 區(qū)及皮層組織中神經細胞輪廓清晰，形態(tài)飽滿。與對照組比較，模型組細胞變形，輪廓模糊且顏色被深染，結構形態(tài)較差，細胞核出現(xiàn)固縮。與模型組比較，滋水清肝飲低劑量組部分神經細胞形態(tài)結構發(fā)生改變，存在核固縮現(xiàn)象，其余各給藥組細胞神經細胞的形態(tài)基本正常，核固縮現(xiàn)象減少。對照組小鼠結腸黏膜上皮完整，排列規(guī)則，腸隱窩結構正常，呈單管狀。與正常組相比，模型組小鼠結腸排列松散嚴重，懷狀細胞缺失腸隱窩萎縮且表面不規(guī)則，腺體受損嚴重。與模型組比較，各給藥組小鼠結腸組織損傷均減輕。

圖1 滋水清肝飲對抑郁小鼠海馬CA1 區(qū)、皮層組織及結腸組織病理變化的影響 (HE, ×200)Fig.1 Effect of Zishui Qinggan Yin on pathological changes in hippocampal CA1 region, cortical tissue and colon tissue of depressed mice (HE, × 200)

3.2.2 滋水清肝飲對抑郁小鼠海馬CA1 區(qū)Iba-1 表達的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中出現(xiàn)大量小膠質細胞增生，突起回縮，胞體增大；與模型組比較，各給藥組小膠質細胞標志物Iba-1 表達明顯減少。

圖2 滋水清肝飲對抑郁小鼠海馬CA1 區(qū)Iba-1 表達的影響 (×400)Fig.2 Effect of Zishui Qinggan Yin on Iba-1 expression in hippocampal CA1 region of depressed mice (× 400)

3.3 滋水清肝飲對抑郁小鼠血清中SOD 活性和5-HT、CORT、ACTH、CRH、MDA 水平的影響

如表3 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中5-HT 水平和SOD 活性顯著降低（P＜0.01），CORT、ACTH、CRH、MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組ACTH 和MDA 水平顯著降低（P＜0.01），SOD 活性顯著升高（P＜0.05、0.01）；鹽酸氟西汀組和滋水清肝飲中劑量組5-HT 水平顯著升高（P＜0.05、0.01），CORT 和CRH水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

表3 滋水清肝飲對抑郁小鼠血清中SOD 活性和5-HT、CORT、ACTH、CRH、MDA 水平的影響 (±s, n = 9)Table 3 Effect of Zishui Qinggan Yin on SOD activity and 5-HT, CORT, ACTH, CRT, SOD, MDA levels in serum of depressed mice (±s , n = 9)

表3 滋水清肝飲對抑郁小鼠血清中SOD 活性和5-HT、CORT、ACTH、CRH、MDA 水平的影響 (±s, n = 9)Table 3 Effect of Zishui Qinggan Yin on SOD activity and 5-HT, CORT, ACTH, CRT, SOD, MDA levels in serum of depressed mice (±s , n = 9)

組別 劑量/(g·kg?1)5-HT/(ng·mL?1)CORT/(ng·mL?1)ACTH/(pg·mL?1)CRH/(pg·mL?1)SOD/(U·mL?1)MDA/(nmol·mL?1)對照 — 193.49±6.42 192.96±2.58 61.50±3.89 78.25±0.77 120.09±3.39 5.27±0.44模型 — 176.26±2.52## 221.16±13.87## 76.86±2.54## 97.24±3.42## 79.14±10.64## 8.26±1.51##鹽酸氟西汀 0.01 191.73±6.84** 192.23±5.15* 63.86±2.62** 80.73±3.66** 122.15±9.88** 5.48±0.48**滋水清肝飲 8.835 177.15±5.58 196.28±3.56 68.30±2.39** 88.57±10.15 100.22±9.50** 6.83±0.60**17.670 186.12±3.13* 192.18±2.14* 63.93±2.17** 80.84±5.36** 111.33±5.64** 5.86±0.47**35.340 180.42±10.76 204.62±4.07 66.17±0.71** 87.90±6.68 90.34±15.19* 6.96±0.55**

3.4 滋水清肝飲對抑郁小鼠前額葉皮層SOD 活性和5-HT、BDNF、MDA 水平的影響

如表4 所示，與對照組比較，模型組小鼠前額葉皮層中5-HT、BDNF 水平和SOD 活性均顯著降低（P＜0.01），MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠前額葉皮層中5-HT、BDNF 水平和SOD 活性均顯著升高（P＜0.05、0.01），鹽酸氟西汀組和滋水清肝飲中、高劑量組MDA 水平顯著升高（P＜0.01）。

表4 滋水清肝飲對抑郁小鼠前額葉皮層SOD 活性和5-HT、BDNF、MDA 水平的影響 (±s , n = 6)Table 4 Effect of Zishui Qinggan Yin on SOD activity and 5-HT, BDNF, MDA levels in prefrontal cortex of depressed mice(±s , n = 6)

表4 滋水清肝飲對抑郁小鼠前額葉皮層SOD 活性和5-HT、BDNF、MDA 水平的影響 (±s , n = 6)Table 4 Effect of Zishui Qinggan Yin on SOD activity and 5-HT, BDNF, MDA levels in prefrontal cortex of depressed mice(±s , n = 6)

組別 劑量/(g·kg?1) 5-HT/(ng·mL?1) BDNF/(pg·mL?1) SOD/(U·mgprot?1) MDA/(nmol·mgprot?1)對照 — 304.84±12.91 824.38±32.34 222.24±19.19 8.42±1.93模型 — 245.99±11.10## 741.61±7.56## 183.40±11.82## 15.43±3.85##鹽酸氟西汀 0.01 289.42±7.72** 815.46±25.91** 260.84±27.01** 7.72±3.28**滋水清肝飲 8.835 262.66±9.93* 796.21±21.32* 213.22±26.83** 11.71±1.90 17.670 286.13±9.14** 814.60±19.12** 235.83±13.97** 7.30±1.51**35.340 277.87±6.52** 804.83±22.72** 233.69±14.85* 9.91±2.66**

3.5 滋水清肝飲對抑郁小鼠腸道菌群的影響

3.5.1 菌群測序結果質量分析 各組小鼠結腸內容物樣品的稀釋曲線見圖3-A，送測數(shù)量合理，測序深度足以滿足后續(xù)研究。物種累積曲線見圖3-B，在樣本量漸增的同時，所對應的物種數(shù)目也在增加，且曲線漸趨平坦，說明小鼠測序樣品的數(shù)量合理。

圖3 小鼠腸道菌群測序結果質量分析Fig.3 Quality analysis of sequencing results of intestinal flora in mice

3.5.2 各組分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）組成相似性 如圖4 所示，與對照組比較，模型組獨有的物種數(shù)量降低；與模型組比較，滋水清肝飲中劑量組及鹽酸氟西汀組獨有的物種數(shù)量均升高，滋水清肝飲高、低劑量組均降低。

圖4 各組樣本ASV/OTU 的花瓣圖Fig.4 Petals of ASV/OTU in each group

3.5.3 α 多樣性分析 如表5 所示，與對照組比較，模型組Chao1 指數(shù)及Observed species 指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），Simpson 指數(shù)及Shannon 指數(shù)無顯著差異；與模型組比較，滋水清肝飲中劑量組和鹽酸氟西汀組Chao1 指數(shù)及Observed species 指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），Shannon 指數(shù)有升高趨勢但無顯著差異。

表5 滋水清肝飲對抑郁小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)的影響 (±s, n = 3)Table 5 Effect of Zishui Qinggan Yin on intestinal flora diversity index of depressed mice (±s , n = 3)

表5 滋水清肝飲對抑郁小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)的影響 (±s, n = 3)Table 5 Effect of Zishui Qinggan Yin on intestinal flora diversity index of depressed mice (±s , n = 3)

組別 劑量/(g·kg?1) Chao1 指數(shù) Simpson 指數(shù) Shannon 指數(shù) Observed species 指數(shù)對照 — 2 054.24±123.07 0.95±0.01 6.38±0.31 1 868.20±157.49模型 — 1 830.36±28.77# 0.96±0.01 6.04±0.96 1 661.90±7.18#鹽酸氟西汀 0.01 1 966.69±96.32* 0.95±0.01 6.31±0.51 1 802.80±37.91*滋水清肝飲 8.835 1 853.90±124.23 0.95±0.03 6.16±0.06 1 614.13±157.85 17.670 2 149.69±51.95* 0.95±0.02 6.71±0.14 1 968.70±193.96*35.340 1 944.33±179.49* 0.95±0.01 6.42±0.52 1 752.07±118.27

3.5.4 β 多樣性分析 如圖5 所示，主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）表明對照組及各給藥組大部分樣本有交叉，模型組則單獨于在1 個位置，說明抑郁小鼠的腸道群落結構發(fā)生了改變，經滋水清肝飲治療后腸道群落結構得到改善。

圖5 β 多樣性分析Fig.5 β Diversity analysis

3.5.5 小鼠腸道菌群門及屬水平中前20 的生物物種組成 對對照組、模型組及各給藥組小鼠腸道菌群在門水平上物種組成進行分析（圖6-A），結果表明各組小鼠腸道菌群中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteria）、變形桿菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌群，總比例大于85%。與對照組比較，模型組小鼠腸道內的有益菌擬桿菌門及放線菌門等相對豐度下降，有害菌變形桿菌門相對豐度增加；與模型組比較，各給藥組有害菌厚壁菌門及變形桿菌門相對豐度均降低，除滋水清肝飲低劑量組外，其余各給藥組擬桿菌門及放線菌門等相對豐度均有所增加。

圖6 小鼠腸道菌群門及屬水平中前20 的生物物種組成Fig.6 Composition of top 20 biological species at level of phyla and genus in intestinal flora of depressed mice

對對照組、模型組及各給藥組小鼠腸道菌群在屬水平上物種組成進行分析（圖6-B），屬水平上優(yōu)勢菌屬為杜氏桿菌屬Dubosiella、乳桿菌屬Lactobacillus、Muribaculaceae、幽門螺桿菌屬Helicobacter、毛螺菌屬Lachnospiraceae等。與對照組比較，模型組幽門螺桿菌屬豐度升高，除杜氏桿菌屬降低且有顯著差異外，Muribaculaceae、乳酸桿菌屬豐度降低有差異但不顯著；與模型組比較，各給藥組幽門螺桿菌屬豐度均降低，杜氏桿菌屬、毛螺菌屬、乳桿菌屬及Muribaculaceae豐度升高，以滋水清肝飲中劑量組及鹽酸氟西汀組最為顯著。

3.6 Western blotting 檢測小鼠皮層組織ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB、BDNF 蛋白表達

如圖7 和表6 所示，與對照組比較，模型組小鼠前額葉皮層中p-ERK1/2、p-CREB、BDNF 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組前額葉皮層組織中p-ERK1/2、p-CREB、BDNF 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.01）。

圖7 各組小鼠前額葉皮層中ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB、BDNF 蛋白表達Fig.7 ERK1/2, p-ERK1/2, CREB, p-CREB and BDNF protein expressions in prefrontal cortex of mice in each group

表6 滋水清肝飲對抑郁小鼠前額葉皮層組織ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB、BDNF 蛋白表達的影響(±s , n = 3)Table 6 Effect of Zishui Qinggan Yin on ERK1/2, p-ERK1/2, CREB, p-CREB and BDNF protein expressions in prefrontal cortex tissue of depressed mice (±s , n = 3)

表6 滋水清肝飲對抑郁小鼠前額葉皮層組織ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB、BDNF 蛋白表達的影響(±s , n = 3)Table 6 Effect of Zishui Qinggan Yin on ERK1/2, p-ERK1/2, CREB, p-CREB and BDNF protein expressions in prefrontal cortex tissue of depressed mice (±s , n = 3)

組別 劑量/(g·kg?1) p-ERK1/2/ERK1/2 p-CREB/CREB BDNF/GAPDH對照 — 0.93±0.04 0.77±0.05 0.90±0.03模型 — 0.11±0.01## 0.36±0.08## 0.31±0.04##鹽酸氟西汀 0.01 0.93±0.02** 0.85±0.02** 0.54±0.06*滋水清肝飲 8.835 0.62±0.06** 0.61±0.03** 0.61±0.03**17.670 0.94±0.01** 0.70±0.07** 0.83±0.05**35.340 0.71±0.07** 0.56±0.04* 0.44±0.05**

4 討論

壓力是抑郁癥發(fā)展的致病因素之一[16]，長期或慢性應激可導致HPA 軸功能失調，導致體內CRH、ACTH、CORT 水平升高[17]；大腦氧化應激加重，導致海馬CA1 區(qū)小膠質細胞過度激活釋放大量促炎細胞因子[18]；激活色氨酸-犬尿氨酸途徑減少5-HT的生成；腸道屏障通透性增加，最終導致腸道生態(tài)失調[19]。本研究通過CRS 模型，根據(jù)蔗糖攝入量減少、運動活動缺陷、絕望性行為來模擬臨床抑郁癥的發(fā)展和進展，探究抑郁癥的病理學生理學特征，圍繞腸道菌群進行一系列探究分析，探索闡述滋水清肝飲的抗抑郁作用與機制。

實驗結果表明，在α 多樣性分析結果中各組之間的物種豐富度和糞便菌群多樣性有顯著差異，其中模型組的Chao1、Observed species、Shannon 指數(shù)均有降低趨勢。在β 多樣性分析中，模型與其他群體之間存在明顯差異，表現(xiàn)出CRS 后微生物群落結構的明顯變化；給予滋水清肝飲治療后，腸道菌落結構得到一定改善，并與對照組有一定交集。在小鼠腸道菌群門和屬水平中，模型組有害菌厚壁菌門、變形桿菌門、幽門螺桿菌屬等增加，益生菌擬桿菌門、放線菌門、杜氏桿菌屬、毛螺菌屬、乳桿菌屬、Muribaculaceae等降低，在MDD 患者腸道菌群[11]中也觀察到了與之相似的結果。經滋水清肝飲及鹽酸氟西汀治療后，各給藥組益生菌豐度增加，有害菌豐度降低，其中以滋水清肝飲中劑量及鹽酸氟西汀最為顯著。在以上提及的有益菌門中，杜氏桿菌屬具有調節(jié)體內代謝、減輕炎癥和提高腸道免疫力等功效的一類腸道菌屬。Muribaculaceae及毛螺菌屬可產生短鏈脂肪酸，促進腸道上皮的完整性[20-22]。乳酸桿菌可通過迷走神經調節(jié)神經遞質5-HT 及多巴胺受體的表達來改善抑郁行為[23]，進而改善小鼠抑郁樣作用。由此表明，滋水清肝飲可以通過調控抑郁小鼠腸道內菌群的組成進而改善小鼠抑郁癥狀。

與對照組比較，模型組小鼠海馬、皮層及結腸的病理損傷嚴重，氧化應激加重，5-HT 含量降低，小鼠抑郁樣行為加劇，前額葉皮層中5-HT 及BDNF含量降低。經過滋水清肝飲干預后，小鼠全腦組織HE 染色、全腦免疫熒光染色及結腸HE 染色結果均表明其損傷程度遠低于模型組。與模型組比較，各給藥組小鼠快感缺失情況減輕，懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間縮短；血清中5-HT 含量增加，SOD活力提高，CORT、ACTH、CRH 及MDA 含量降低；前額葉皮層中5-HT 及BDNF 含量增加，SOD活力提高，MDA 含量降低；海馬、皮層及結腸的病理狀態(tài)得到改善，海馬小膠質細胞標志物Iba-1 表達降低。表明滋水清肝飲可以提高小鼠體內神經遞質5-HT 及營養(yǎng)因子BDNF 水平，減輕氧化應激，減輕炎癥，調節(jié)HPA 軸，從而發(fā)揮抗抑郁作用，也表明滋水清肝飲給藥不具有劑量相關性，中劑量組即臨床等效劑量組效果最好。

前額葉皮層是邊緣皮層的一部分，由于其豐富的神經相互連接，涉及許多應激敏感的心理障礙。BDNF 是一種可塑性相關蛋白質，源于大腦皮層的軸突末梢，在嚙齒動物和人類的大腦皮層中都高度表達，并在神經元去極化時在軸突中釋放[24]。前額葉皮層中釋放出的BDNF 會結合受體酪氨酸激酶刺激ERK，而ERK 作為細胞信號的遞質，參與細胞的遷移、分化、生長和存活。當ERK 激活下游CREB后，導致絲氨酸133（Ser133）的磷酸化，磷酸化的CREB 具有神經保護作用，可調節(jié)包括多巴胺能神經元在內的多個細胞基因轉錄的功能[25]。p-CREB又作為BDNF 的上游調控BDNF 的轉錄，從而達到抗抑郁的效果。也有研究表明，BDNF 可以加速腸道排空并增加排便頻率[26]，增強腸平滑肌的肌電活性及增大收縮幅度的峰值，增強孤立大鼠結腸的蠕動反射[27]。實驗結果表明，與對照組比較，模型組小鼠海馬BDNF、p-CREB、p-ERK1/2 蛋白表達均降低；與模型組比較，當給予不同劑量的滋水清肝飲后小鼠海馬BDNF、p-CREB、p-ERK1/2 蛋白表達均有不同程度的增加，其中中劑量組即臨床等效劑量組蛋白增加最為顯著，效果最好。

由于滋水清肝飲具有多成分、多靶點的作用，實驗中對于抗炎、抗氧化等作用僅體現(xiàn)在血液及皮層中的改變，對其調控作用機制及其他損傷部位仍需深入研究。同時滋水清肝飲在重塑腸道菌群和調控小鼠皮層ERK/CREB/BDNF 信號通路中發(fā)揮抗抑郁作用，可作為抑郁癥治療的潛在新策略值得進一步的研究探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突