載冬凌草甲素和黃芪多糖-絲素蛋白-甲基纖維素復(fù)合傷口敷料的制備及其促進(jìn)皮膚傷口愈合的研究

董儒銀，左琬鈺，張吉仲，王偉鈺，魯雪梅，程冰宇，董儒團(tuán)，呂露陽

西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

傷口敷料是一類用于傷口修復(fù)的醫(yī)用材料，其主要作用是防止細(xì)菌侵入和感染，吸收傷口滲出液和有毒物質(zhì)，從而為傷口的愈合創(chuàng)造一個理想的環(huán)境[1]。傷口愈合過程是一個明確的生物過程，主要分為3 個階段，包括炎癥、增殖和成熟。傷口愈合機(jī)制包括各種細(xì)胞類型、細(xì)胞外基質(zhì)成分和細(xì)胞因子介質(zhì)之間的復(fù)雜相互作用[2]。雖然傷口的自然愈合機(jī)制是在傷口出現(xiàn)時啟動的，但一個理想的傷口敷料能更好地促進(jìn)傷口愈合[3]。

冬凌草是唇形科香茶菜屬植物碎米椏Rabdosia rubescens(Hemsl.) Hara 的干燥地上部分，被《中國藥典》2020 年版收錄[4]。冬凌草不僅能藥用，還有悠久的食用歷史，安全有效。冬凌草甲素（oridonin）是冬凌草的主要活性成分，難溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冬凌草甲素的藥理作用十分廣泛，如抗腫瘤、消炎抗菌、抗氧化等[5-8]。

黃芪為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，能托毒排膿，斂瘡生肌。黃芪中的黃芪多糖（Astragaluspolysaccharides），為可溶于水的雜多糖[4,9]，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖、抗衰老和抗炎等藥理作用[10-11]，是黃芪促進(jìn)傷口的愈合的主要有效成分。

絲素蛋白（silk fibrion）是從蠶繭中提取的一種天然高分子敷料，能吸收滲出物，保持潮濕的環(huán)境有利于細(xì)胞遷移，提供氧氣滲透和舒緩皮膚，是傷口敷料及藥物載體的理想材料[12-13]，可制備成水凝膠[12,14-15]、海綿[16]、薄膜[17-18]、傷口敷料[19]等各種外用制劑，用于口腔頜面部及全身皮膚創(chuàng)面的修復(fù)中，在化妝品、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中具有潛在的用途[20]。但絲素蛋白本身無抗菌性，可通過不同的抗菌性修飾賦予絲素蛋白材料抗菌性能，是近年研究的熱點[21]。甲基纖維素（methyl cellulose，MC）是纖維素的衍生物之一，是常用黏合劑[22]。

藥典記載冬凌草可內(nèi)服，也可外用，用于咽喉腫痛、癥瘕痞塊、蛇蟲咬傷的治療，但目前幾乎未見冬凌草及其活性成分冬凌草甲素外用制劑的研究報道，以冬凌草甲素為藥效成分的臨床制劑多經(jīng)口服或注射給藥。本實驗以絲素蛋白負(fù)載冬凌草甲素和黃芪多糖，以MC 為黏合劑，采用冷凍干燥法制備冬凌草甲素和黃芪多糖-絲素蛋白-甲基纖維素（oridonin &Astragaluspolysaccharides-silk fibroinmethyl cellulose，Ori&APS-SF-MC）復(fù)合傷口敷料，以增加冬凌草甲素和黃芪多糖的皮膚黏附性，協(xié)同增加冬凌草甲素和黃芪多糖藥效，對其體外抗菌和皮膚傷口愈合的效果進(jìn)行考察，為研究安全無毒、使用便捷和加速傷口愈合的相關(guān)外用制劑提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TU-1950 型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任有限公司；SPD-16 型高效液相色譜儀，島津儀器（蘇州）有限公司；Scientz-12N 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DT35C 型低速臺式離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；Alpha II 型傅里葉變換紅外吸收光譜儀，德國布魯克光譜儀器公司；Quattro S 型掃描電子顯微鏡（SEM），賽默飛世爾科技公司；Eclipse Ci-L 型正置白光拍照顯微鏡，日本Nikon 公司；Milli-Q 純水儀，美國Millipore 公司。

1.2 材料

冬凌草甲素，批號18091701，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，西安昊軒生物科技有限公司；黃芪多糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，自制；蠶繭，西北養(yǎng)蠶工業(yè)基地；MC，成都市科隆化學(xué)有限公司；透析袋，截留相對分子質(zhì)量3 500，Biovake 北京怡康盛世生物科技有限公司；模具，直徑為10 mm，南通范思貝生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌，編號ATCC25923，批號20220516，青島高科技工業(yè)海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌，編號ATCC25922，批號22032010，北京保藏生物技術(shù)有限公司；所用試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 實驗動物

昆明小鼠，30 只，雄性，體質(zhì)量（30±2）g，6～7 周齡，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供。動物許可證編號SYXK（川）2019-0216。動物飼養(yǎng)條件：西南民族大學(xué)藥學(xué)院清潔動物房，恒溫恒濕，正常飲食飲水。動物實驗方案均經(jīng)過西南民族大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號No.2022-1207）。

2 方法與結(jié)果

2.1 絲素蛋白的提取純化

將蠶繭剪成塊狀，按料液比1∶100 放入0.5%碳酸鈉水溶液中，置于90 ℃水浴加熱1.5 h 進(jìn)行第1 次脫膠，清洗3 次，再放入碳酸鈉水溶液中水浴加熱30 min 進(jìn)行第2 次脫膠，清洗3 次。干燥后得到絲素蛋白，丟失比25%～30%[23]。再將其采用CaCl2-C2H5OH-H2O（物質(zhì)的量比1∶2∶8）三元體系溶解，料液比為1∶30，置于70 ℃的水浴加熱4 h，攪拌溶解直至完全反應(yīng)，透析濃縮即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的絲素蛋白溶液，4 ℃儲存。

2.2 MC 溶液的制備

稱取1 g MC 粉末，溶于50 mL 水中，水浴加熱溶解，即得0.02 g/mL 的MC 溶液。

2.3 復(fù)合傷口敷料的制備

由于冬凌草甲素在水中難溶（溶解度為0.75 mg/mL），因此加入1%聚山梨酯80 作增溶劑，采用冷凍干燥法制備復(fù)合傷口敷料[24-26]，具體操作如下。

2.3.1 APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料溶液的制備 分別精密稱定5、10、20 mg 黃芪多糖溶解于0.15 mL 4%絲素蛋白溶液中，即得低、中、高質(zhì)量濃度（33.3、66.7、133.3 mg/mL）的黃芪多糖溶液，分別加入到0.15 mL 0.02 g/mL MC 溶液中，漩渦混合均勻，靜置消除氣泡，冷凍干燥，即可分別得到低、中、高質(zhì)量濃度組APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料溶液。

2.3.2 Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料的制備 分別精密稱定0.2、0.4、0.8 mg 冬凌草甲素溶于0.25 mL 1%聚山梨酯80 中，即得低、中、高質(zhì)量濃度（0.8、1.6、3.2 mg/mL）的冬凌草甲素溶液；隨后再精密稱定20 mg 黃芪多糖溶于0.15 mL 4%絲素蛋白溶液中，即得高質(zhì)量濃度（133.3 mg/mL）的黃芪多糖溶液；最后將上述2 種溶液一起加入到0.15 mL 0.02 g/mL MC 溶液中，漩渦混合均勻，倒入模具，靜置消除氣泡，冷凍干燥，即可分別得到低、中、高質(zhì)量濃度組Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料。

2.3.3 Ori-SF-MC 復(fù)合傷口敷料的制備 精密稱定0.8 mg 冬凌草甲素溶于0.25 mL 1%聚山梨酯80 中，即得冬凌草甲素溶液；隨后加入0.15 mL 4%絲素蛋白溶液和0.15 mL 0.02 g/mL MC 溶液，漩渦混合均勻，倒入模具，靜置消除氣泡，冷凍干燥，即可得到Ori-SF-MC 復(fù)合傷口敷料。

2.3.4 SF-MC 復(fù)合傷口敷料的制備 精密量取0.15 mL 4%絲素蛋白溶液加入到0.15 mL 0.02 g/mL MC 溶液中，漩渦混合均勻，倒入模具，靜置消除氣泡，冷凍干燥，即可得到SF-MC 復(fù)合傷口敷料。

2.4 表面形貌

對復(fù)合傷口敷料的外觀形態(tài)進(jìn)行拍照記錄。復(fù)合傷口敷料外觀形貌見圖1，制備得到的Ori&APSSF-MC 復(fù)合傷口敷料與模具尺寸一致，直徑為10 mm，高度為2.5 mm，呈淡黃色，十分柔軟，按壓后可回彈。

圖1 Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料實物圖 (直徑10 mm, 高度2.5 mm)Fig.1 Physical picture of Ori&APS-SF-MC composite wound dressing (diameter 10 mm, height 2.5 mm)

圖2 冬凌草甲素、黃芪多糖、SF-MC 及Ori&APS-SFMC 的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of oridonin, Astragalus polysaccharides, SF-MC and Ori&APS-SF-MC

2.5 復(fù)合傷口敷料紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外吸收光譜儀對復(fù)合傷口敷料進(jìn)行紅外光譜表征，研究其紅外吸收特性，掃描范圍為500～4 000 cm?1。記錄數(shù)據(jù)，分析復(fù)合傷口敷料的光譜圖，通過解析黃芪多糖、冬凌草甲素、SF-MC 以及Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料紅外光譜的差異，判斷黃芪多糖與冬凌草甲素是否成功負(fù)載在Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料上。結(jié)果如圖2 所示，可見冬凌草甲素在2 930、1 720、1 420、1 060、760 cm?1處有特征峰[27]。黃芪多糖在3 430、2 930、1 640、1 420、1 160、1 010、618 cm?1處有特征峰，其中3 430 cm?1處有1 個-OH 伸縮振動的寬峰，1 010 cm?1處有1 個由C-O 伸縮振動引起的強(qiáng)峰，說明黃芪多糖中存在氫鍵。2 930 cm?1處有CH2次甲基中C-H 鍵伸縮振動引起的吸收峰，1 640 cm?1處有羧基中O-H 鍵震動引起的吸收峰，1 420 cm?1處有羧基中的C-O 鍵伸縮振動引起的吸收峰，1 160 cm?1處有由多糖糖苷結(jié)構(gòu)中C-O-C 的不對稱縮振動引起的吸收峰[28-29]。SF-MC 在1 645、1 520 cm?1處有特征峰，代表著絲素蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)[30]。

Ori&APS-SF-MC 的特征峰為3 430、2 930、1 640、1 520、1 420、1 010、760、618 cm?1。除了共同特征吸收峰基本一致外，Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料在760、618 cm?1出現(xiàn)了特征吸收峰，對照黃芪多糖和冬凌草甲素紅外吸收峰。可知此處為黃芪多糖和冬凌草甲素特征吸收峰，而在SF-MC 中沒有其特征吸收峰，由此可以說明Ori&APS-SF-MC復(fù)合傷口敷料中含有黃芪多糖和冬凌草甲素，且未改變有效成分，在SF-MC 中加入冬凌草甲素和黃芪多糖后峰型變尖，表明了冬凌草甲素和黃芪多糖通過氫鍵與SF-MC 相互作用。

2.6 復(fù)合傷口敷料SEM 分析

將復(fù)合傷口敷料進(jìn)行噴金處理，采用SEM 對復(fù)合傷口敷料的表面微觀形貌進(jìn)行觀察。表面微觀形貌見圖3，制備得到的Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料達(dá)到較為理想的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，微觀呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)相互連接分布均勻且飽滿，可以吸收傷口滲出液，有利于促進(jìn)傷口愈合。

圖3 不同倍數(shù)下Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料的SEM圖像 (倍數(shù)×500, ×1 000)Fig.3 SEM images of Ori&APS-SF-MC composite wound dressings at different multiples (multiple × 500, × 1 000)

2.7 包封率與載藥量的測定

采用HPLC 法測定Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料中冬凌草甲素的包封率和載藥量[31]；采用硫酸-苯酚法測定Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料中黃芪多糖的包封率和載藥量[32]，根據(jù)下列公式計算，實驗平行3 次。

包封率＝復(fù)合傷口敷料中藥物的質(zhì)量/投藥量

載藥量＝復(fù)合傷口敷料中藥物的質(zhì)量/復(fù)合傷口敷料的質(zhì)量

經(jīng)測定，Ori&APS-SF-MC 中冬凌草甲素的包封率為（99.70±0.04）%，載藥量為（3.66±0.05）%；黃芪多糖的包封率為（92.47±0.14）%，載藥量為（83.57±0.12）%。即制備得到的復(fù)合傷口敷料中冬凌草甲素和黃芪多糖包封率高，載藥量與理論載藥量相近，分析這是由于在制備過程中藥物損失較少，藥物溶液穩(wěn)定分散在復(fù)合傷口敷料中。

2.8 體外藥物累積釋放測定

2.8.1 冬凌草甲素體外藥物累積釋放 將復(fù)合傷口敷料浸入5 mL 的pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，置于37 ℃恒溫水浴搖床中以100 r/min 震蕩，定時吸取液體測定藥物釋放量，并加入等體積的PBS 來補(bǔ)償釋放介質(zhì)。HPLC 法測定冬凌草甲素的累積釋放量[33-34]，評價冬凌草甲素的釋放行為，繪制藥物累積釋放曲線。

2.8.2 黃芪多糖體外藥物累積釋放 將復(fù)合傷口敷料浸入10 mL PBS 緩沖液中，置于37 ℃恒溫水浴搖床中以100 r/min 震蕩，定時吸取1 mL 液體測定藥物釋放量，并加入等體積的PBS 來補(bǔ)償釋放介質(zhì)。通過硫酸-苯酚法測定釋放介質(zhì)中多糖的質(zhì)量濃度[35]，評價黃芪多糖的體外釋放行為，繪制藥物累積釋放曲線。

2.8.3 藥物釋放結(jié)果 復(fù)合傷口敷料在PBS 中的冬凌草甲素和黃芪多糖累積釋放曲線如圖4 所示，在20 min 以內(nèi)冬凌草甲素和黃芪多糖內(nèi)快速釋放，在20 min 時累積釋放率分別為（90.90±0.35）%和（89.17±2.35）%；當(dāng)30 min 時，藥物累積釋放率分別達(dá)到（96.79±0.82）%和（92.52±1.03）%。表明該藥物作為傷口敷料釋藥性能優(yōu)異。

圖4 復(fù)合傷口敷料藥物釋放曲線 (±s , n = 3)Fig.4 Drug release curve of composite wound dressing(±s , n = 3)

2.9 抗菌實驗

傷口被細(xì)菌等微生物感染是制約傷口愈合的一個重要因素，所以傷口敷料通常要具有良好的抗菌能力，可以有效殺死細(xì)菌，抑制傷口處細(xì)菌以及有害微生物的繁殖滋生，并且可以抵抗細(xì)菌對人體的感染，從而大大降低患者傷口處部位有害微生物的感染風(fēng)險，進(jìn)而加速傷口愈合，因此，敷料具有抗菌性是非常必要的[18,36]。本實驗考察不同質(zhì)量濃度的冬凌草甲素、黃芪多糖、SF-MC 對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭陰性菌大腸肝菌的抗菌效果。

2.9.1 菌懸液的制備 采用菌落稀釋法，挑取平板上2 或3 個菌落，使其懸浮于裝有0.9%無菌生理鹽水的試管中，充分震蕩，混勻后與0.5（1×108/mL）標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比對，分別制成濃度為0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏慕瘘S色葡萄球菌和大腸桿菌菌懸液備用。

2.9.2 牛津杯擴(kuò)散法 在無菌條件下，用已滅菌的培養(yǎng)基制成平板，待冷卻凝固后，分別加入200 μL 2 種菌懸液，然后用無菌涂布器涂布均勻。待表面干燥后，并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)平板中，在水平放置的平板中均勻地放置3 只牛津杯。

以SF-MC 復(fù)合傷口敷料溶液為對照組，將載有低、中、高質(zhì)量濃度（0.8、1.6、3.2 mg/mL 冬凌草甲素）Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料溶液和載有低、中、高質(zhì)量濃度（33.3、66.7、133.3 mg/mL 黃芪多糖）APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料溶液100 μL，分別加入牛津杯中（金黃色葡萄球菌平板），以及將載有高質(zhì)量濃度的APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料溶液和高質(zhì)量濃度的Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料溶液100 μL，分別加入牛津杯中（大腸桿菌平板），每種加3 孔作為平行樣。置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下，培養(yǎng)24 h。分別觀察并測量抑菌圈直徑大小。結(jié)果如表1 和圖5-A 所示，抑菌圈的直徑與冬凌草甲素的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，具有極其顯著性差異（P＜0.000 1）。在高質(zhì)量濃度時抑菌圈直徑為（22.37±0.23）mm，中質(zhì)量濃度時抑菌圈直徑為（18.17±0.31）mm，低質(zhì)量濃度時抑菌圈直徑為（15.83±0.25）mm。如圖5-C 所示，低、中、高質(zhì)量濃度（33.3、66.7、133.3 mg/mL）組APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料溶液對金黃色葡萄球菌皆無抗菌作用。

表1 各復(fù)合傷口敷料對金黃色葡萄球菌的抗菌效果(牛津杯擴(kuò)散法,±s , n = 3)Table 1 Antibacterial effect of each composite wound dressing on Staphylococcus aureus (Oxford cup diffusion method,±s , n = 3)

表1 各復(fù)合傷口敷料對金黃色葡萄球菌的抗菌效果(牛津杯擴(kuò)散法,±s , n = 3)Table 1 Antibacterial effect of each composite wound dressing on Staphylococcus aureus (Oxford cup diffusion method,±s , n = 3)

“?”表示不含；與SF-MC 組比較：****P＜0.000 1；表2 同。“?” indicating that it does not contain; ****P＜0.000 1 vs SF-MC group;same as table 2.

樣品 質(zhì)量濃度/(mg?mL?1) 抑菌圈直徑/mm 冬凌草甲素 黃芪多糖SF-MC 復(fù)合傷口敷料 ? ? 0.00 Ori&APS-SF-MC 3.2 133.3 22.37±0.23****復(fù)合傷口敷料 1.6 133.3 18.17±0.31****0.8 133.3 15.83±0.25****APS-SF-MC 復(fù)合 ? 33.3 0.00傷口敷料 ? 66.7 0.00? 133.3 0.00

圖5 各組代表性抑菌圈結(jié)果 (n = 3)Fig.5 Results of representative inhibition zone of each group (n = 3)

如圖5-D 所示，復(fù)合傷口敷料對大腸桿菌無抗菌作用，這一結(jié)果與已有報道的研究結(jié)果一致[6]。

2.9.3 直接放置法 在無菌條件下，用已滅菌的培養(yǎng)基制成平板，待冷卻凝固后，分別加入200 μL 菌懸液，然后用無菌涂布器涂布均勻。待表面干燥后，以SF-MC 復(fù)合傷口敷料為對照組，直接將不同質(zhì)量濃度的復(fù)合傷口敷料貼在平板上。置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下，培養(yǎng)24 h。分別觀察并測量抑菌圈直徑大小。結(jié)果如表2 和圖5-B 所示，與對照組相比，隨著冬凌草甲素質(zhì)量濃度的增加，抗菌能力加強(qiáng)，具有極其顯著性差異（P＜0.000 1）。在高質(zhì)量濃度時抑菌圈直徑為（27.43±0.31）mm，中質(zhì)量濃度時抑菌圈直徑為（25.60±0.26）mm，低質(zhì)量濃度時抑菌圈直徑為（22.40±0.20）mm。

表2 各復(fù)合傷口敷料對金黃色葡萄球菌的抗菌效果(直接放置法,±s , n = 3)Table 2 Antibacterial effect of each composite wound dressing on S.aureus (direct placement method,±s , n = 3)

樣品 冬凌草甲素質(zhì)量濃度/(mg?mL?1)抑菌圈直徑/mm SF-MC 復(fù)合傷口敷料 ? 0.00 Ori&APS-SF-MC 3.2 27.43±0.31****復(fù)合傷口敷料 1.6 25.60±0.26****0.8 22.40±0.20****

2.9.4 涂布平板法 在無菌條件下，以1×105菌懸液為空白組，SF-MC 復(fù)合傷口敷料為對照組，將不同質(zhì)量濃度的復(fù)合傷口敷料放入1×108菌懸液中均勻混合，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下，培養(yǎng)24 h 后，再將其質(zhì)量濃度稀釋到1×105倍，然后用己滅菌的培養(yǎng)基制成平板，待冷卻凝固后，分別加入100 μL 菌懸液，然后用無菌涂布器涂布均勻。置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下，培養(yǎng)24 h。取出觀察瓊脂平板上的菌落數(shù)。結(jié)果如圖6 所示，與空白組和對照組相比，隨著冬凌草甲素質(zhì)量濃度的增加，抗菌能力加強(qiáng)。表明冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。冬凌草甲素抗菌主要是通過抑制金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜形成和抑制呼吸代謝進(jìn)行抑菌[37]。

圖6 涂布平板法的結(jié)果 (金黃色葡萄球菌)Fig.6 Results of coating plate method (S.aureus)

綜上，抗菌實驗結(jié)果表明，0.8 mg 的冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抗菌效果，但對大腸桿菌無作用，黃芪多糖高達(dá)20 mg 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌皆無作用，與文獻(xiàn)報道的不同[38-39]。空白復(fù)合傷口敷料對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都無作用。金黃色葡萄球菌是傷口感染最常見的細(xì)菌，本實驗復(fù)合傷口敷料處方分別選用0.8 mg 冬凌草甲素和20 mg 黃芪多糖制備。

2.10 傷口愈合性能測試

2.10.1 模型制作 雄性昆明小鼠，6～7 周齡，30只，體質(zhì)量（30±2）g，腹腔麻醉后使用脫毛膏將背部細(xì)毛脫去，隨后使用皮膚打孔器在小鼠背部打出一個直徑為8 mm 的圓形全層傷口，拍照記錄，作為傷口愈合全過程的第0 天。

2.10.2 實驗分組和給藥方法 實驗分為5 組，每組6 只。本實驗分為給藥組（Ori&APS-SF-MC）、冬凌草甲素組（Ori-SF-MC）、多糖組（APS-SF-MC）、陰性對照組（SF-MC）及空白對照組。將不同組別的復(fù)合傷口敷料在254 nm 的紫外光下照射30 min 滅菌隨后覆蓋小鼠背部皮膚缺損區(qū)域，選用適宜的無菌彈性膠帶覆蓋并固定在缺損皮膚創(chuàng)面周圍，避免小鼠啃咬皮膚缺損區(qū)域，空白對照組傷口不做任何處理。第0、1、3、5 天更換敷料。恒溫恒濕喂養(yǎng)。

2.10.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 8、Origin 以及Image J 軟件系統(tǒng)分析處理。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Two-way ANOVA 法分析，以P＜0.05 為差異有顯著性意義，P＜0.01 為差異有非常顯著性意義，P＜0.001為差異有極其顯著性意義。

2.10.4 傷口愈合情況分析及愈合率測定 觀察不同組別中小鼠傷口隨時間的愈合情況，在特定時間點，第0、3、7、10、14 進(jìn)行拍照，以供后期觀察、比較和分析。采用Image J 軟件和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行計算機(jī)圖形處理和計算小鼠傷口的面積，并對傷口愈合率進(jìn)行計算。采用以下公式計算傷口愈合率[40]。

愈合率＝(初始傷口面積－未愈合傷口面積)/初始傷口面積

結(jié)果如圖7 所示，各組在造模當(dāng)天（第0 天）傷口近圓形，有組織液滲出及膿性物分泌；造模后第3 天，各組傷口結(jié)痂，無組織液滲出，有紅腫現(xiàn)象及輕微炎癥現(xiàn)象，傷口明顯縮小；造模后的第7天，各組傷口結(jié)痂部分脫落，縮痂明顯，但仍存在紅腫現(xiàn)象；造模后第10 天，Ori&APS-SF-MC 組、APS-SF-MC 組以及SF-MC 組的傷口結(jié)痂皮幾乎已全部脫落，Ori-SF-MC 組和空白對照組的傷口結(jié)痂皮還未全部脫落；造模后第14 天，各組的傷口進(jìn)一步縮小，其中Ori&APS-SF-MC 組的傷口結(jié)痂皮已全部脫落，無紅腫及炎癥現(xiàn)象，說明傷口愈合完全，APS-SF-MC 組的傷口處還有小塊淤血，Ori-SF-MC組、SF-MC 組及空白對照組仍有痂皮未脫落，說明傷口愈合不完全，且空白對照組仍有大片痂皮未脫落，傷口周邊還有輕微紅腫現(xiàn)象，說明傷口還沒有愈合，肉眼可見各組傷口愈合情況出現(xiàn)差異。

圖7 小鼠傷口愈合的直觀展示 (標(biāo)尺1 mm)Fig.7 Visual display of wound healing in mice (scale bar 1 mm)

結(jié)果如表3 和圖8 所示，對于愈合率來說，在給藥7 d 后，Ori&APS-SF-MC 組（P＜0.000 1）、Ori-SF-MC 組（P＜0.05）、APS-SF-MC 組（P＜0.000 1）和SF-MC 組（P＜0.000 1）的傷口愈合率均顯著高于空白對照組；在第10 天后，與空白對照組相比，APS-SF-MC（P＜0.000 1）組和Ori&APS-SF-MC 組（P＜0.000 1）的傷口愈合率均顯著高于空白對照組，與SF-MC 組相比，APS-SF-MC（P＜0.001）組和Ori&APS-SF-MC 組（P＜0.001）的傷口愈合率均顯著高于SF-MC 組，而空白對照組、SF-MC 組和Ori-SF-MC 組的傷口愈合率均無顯著性差異，這說明可能是黃芪多糖對傷口愈合有促進(jìn)作用；在第14天后，與空白對照組相比較，Ori&APS-SF-MC 組（P＜0.000 1）、Ori-SF-MC 組（P＜0.001）、APS-SFMC 組（P＜0.001）的傷口愈合率均顯著高于空白對照組，與SF-MC 組相比，Ori&APS-SF-MC 組（P＜0.001）、Ori-SF-MC 組（P＜0.05）、APS-SF-MC 組（P＜0.05）的傷口愈合率均顯著高于SF-MC 組，但總體來說，Ori&APS-SF-MC 組的傷口愈合率高于Ori-SF-MC 組和APS-SF-MC 組。

表3 不同時間點不同復(fù)合敷料組的傷口愈合率 (±s, n = 6)Table 3 Wound healing rate of different composite dressing groups at different time points (±s , n = 6)

表3 不同時間點不同復(fù)合敷料組的傷口愈合率 (±s, n = 6)Table 3 Wound healing rate of different composite dressing groups at different time points (±s , n = 6)

與空白對照組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1；與SF-MC 組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001。*P < 0.05 ***P < 0.001 ****P < 0.000 1 vs blank control group; #P < 0.05 ###P < 0.001 vs SF-MC group.

樣品 傷口愈合率/%3 d 7 d 10 d 14 d空白對照 25.48±4.59 44.25±1.71 62.32±0.71 80.58±0.19 SF-MC 26.54±1.74 61.37±3.46**** 69.11±1.73 84.30±0.68 APS-SF-MC 33.42±6.78 59.85±2.70**** 80.70±0.42****### 93.40±1.15***#Ori-SF-MC 36.85±3.40 53.47±0.42* 68.42±4.15 92.75±0.73***#Ori&APS-SF-MC 38.11±3.20 62.53±2.07**** 81.78±1.25****### 97.38±0.68****###

圖8 各組愈合率比較 (±s , n = 6)Fig.8 Comparison of wound healing rate in each group(±s , n = 6)

綜上所述，結(jié)果表明冬凌草甲素和黃芪多糖聯(lián)用具有抗菌和加速傷口愈合的功效。

2.10.5 剪取傷口組織 清洗小鼠皮膚傷口組織，處死后，迅速切取包含整個傷口區(qū)域的邊長為1.2 mm的正方形全層皮膚組織樣品并置于生理鹽水中充分漂洗殘余血液，隨后將其浸沒于 4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）中固定。

2.10.6 蘇木精-伊紅染色 取出固定好的傷口組織，乙醇分級脫水，石蠟包埋，切片，部分傷口組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色，封片，最后于顯微鏡下觀察表皮結(jié)構(gòu)、真皮-表皮連接狀態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤和新生血管等傷口愈合情況，并攝片記錄。在顯微鏡下觀察傷口的H&E 染色病理切片，結(jié)果如圖9 所示，空白對照組的皮膚損傷中心表面未見愈合，表皮層以及真皮層淺層仍處于壞死階段，可見大量的壞死細(xì)胞和壞死組織成分，可見較多的炎性細(xì)胞壞死。SF-MC 組皮膚損傷處表皮基本愈合，表皮增厚，真皮層可見大量的成纖維細(xì)胞以及新生血管，局部伴有輕度出血，并伴有較多的炎性細(xì)胞浸潤，但未見明顯的新生附屬器官，其傷口愈合原因可能是由于純絲素蛋白材料會被機(jī)體降解成短肽鏈而被吸收，可以促進(jìn)傷口的愈合，與已有研究結(jié)果一致[41]。APS-SF-MC 組皮膚損傷處表皮愈合，愈合表皮增厚，角質(zhì)層增厚；真皮層可見大量的成纖維細(xì)胞以及新生血管，這可能是黃芪多糖促進(jìn)新生血管的生成，從而促使傷口愈合。Ori-SF-MC 組皮膚損傷中心表皮、真皮未愈合，外側(cè)可見膿腫灶，損傷兩側(cè)表皮明顯增厚，真皮層伴有較多的炎性細(xì)胞浸潤。因此，與其他對照組相比，Ori&APS-SF-MC組的皮膚損傷表面基本愈合，表皮層增厚，真皮層可見大量的成纖維細(xì)胞以及新生血管修復(fù)。

圖9 HE 染色評價各組皮膚病理變化 (標(biāo)尺50 μm)Fig.9 Pathological changes of skin in each experimental group detected by HE staining (scale bar 50 μm)

2.10.7 Masson染色 對剩余組織切片進(jìn)行Masson染色，膠原纖維會被染成藍(lán)色，觀察各組動物真皮內(nèi)膠原纖維排列狀態(tài)和新生血管情況。選擇合適的區(qū)域和放大倍數(shù)進(jìn)行攝片記錄。采用Image J 軟件進(jìn)行膠原纖維面積百分比的計算。Masson 膠原纖維面積百分比分析方法是指每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少3 個200 倍視野進(jìn)行拍照，拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。

Masson 染色是膠原纖維的經(jīng)典染色，膠原纖維也是真皮層的主要成分。結(jié)果如表4 和圖10 所示，在第14 天時，空白對照組、SF-MC 組、APS-SF-MC組、Ori-SF-MC 組以及Ori&APS-SF-MC 組的膠原纖維面積百分比分別為25.45%、26.26%、29.46%、27.60%、47.73%，其中，空白對照組的纖維組織最小，其次是SF-MC 組，APS-SF-MC 組、Ori-SF-MC組，Ori&APS-SF-MC 組的纖維組織面積最大，高達(dá)40%以上；Ori&APS-SF-MC 組的膠原纖維很明顯多于其他對照組，并達(dá)到峰值伴有膠原沉積現(xiàn)象。空白對照組、SF-MC 組以及APS-SF-MC 組皮膚損傷處可見大量的新生膠原纖維，但膠原纖維排列紊亂、走形不一致；Ori-SF-MC 組膠原排列欠規(guī)則，損傷中心處未愈合；即與其他對照組相比，Ori&APS-SFMC 組的皮膚損傷處可見較多的新生膠原纖維，膠原排列較規(guī)則有序。從中可以進(jìn)一步得出結(jié)論，使用Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料的組織切片中纖維組織面積最大，說明傷口愈合效果最好，協(xié)同作用對傷口愈合的促進(jìn)效果最佳。

表4 皮膚組織內(nèi)膠原纖維組織表達(dá)面積百分比Table 4 Percentage of fibrous tissue expression area in skin tissue

圖10 Masson 染色評價各組皮膚膠原含量 (標(biāo)尺50 μm)Fig.10 Evaluation of collagen content in skin of each group by Masson staining (scale bar 50 μm)

3 討論

由傷口愈合情況與傷口組織學(xué)形態(tài)結(jié)果證明，與空白對照組和SF-MC 組相比，APS-SF-MC 組的愈合率較高，說明黃芪多糖對傷口愈合有促進(jìn)作用而無抗菌作用。現(xiàn)已有報道黃芪多糖可通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、改善微循環(huán)、改變傷口局部微環(huán)境、提供能量代謝物質(zhì)以及促進(jìn)代謝產(chǎn)物的清除、促進(jìn)新生血管的生成、上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子ICAM-1 的表達(dá)、增強(qiáng)中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮滲出在傷口局部聚集，吞噬消化細(xì)菌、清除壞死組織等途徑促進(jìn)傷口愈合，并體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“去腐生肌、偎膿長肉”理論的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)[29,42-43]。因此，黃芪多糖是用于制備包括敷料、水凝膠、薄膜等在內(nèi)的傷口愈合治療產(chǎn)品的重要成分，制備的產(chǎn)品具有良好的生物相容性、降低毒性等方面的優(yōu)勢[44]。

而與空白對照組和SF-MC 組相比，Ori-SF-MC組的愈合率較高，說明可能是冬凌草甲素的抗菌作用進(jìn)一步促進(jìn)傷口愈合。但與Ori-SF-MC 組和APSSF-MC 組相比，Ori&APS-SF-MC 組愈合率更高，說明可能是冬凌草甲素的抗菌作用聯(lián)合黃芪多糖的促進(jìn)傷口愈合作用，進(jìn)一步提高傷口愈合率，加速傷口的愈合。

綜上所述，本研究制備得到的復(fù)合傷口敷料抗菌效果好、包封率高、載藥量與理論載藥量相近，體外釋藥性能優(yōu)異，促進(jìn)傷口愈合效果顯著，Ori&APS-SF-MC 復(fù)合傷口敷料在醫(yī)用傷口敷料領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用潛力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突