覆盆子化學成分的分離鑒定及其新型大麻素2 型受體激動劑的篩選和抗骨質疏松作用評價

陳昌倫，胡思婧，朱麗麗，姚璐蒙，王星星，張安娜，張巧艷，秦路平，吳建軍

浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 311402

《中國藥典》2020 年版規定覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子（亦稱為掌葉覆盆子）RubuschingiiHu.的干燥果實。覆盆子作為一種藥食兩用植物，在中國已有1 500 多年的用藥歷史，并且常被作為補腎中藥廣泛用于中醫臨床上，其性微溫，味甘酸，具有補肝明目、補腎固精、縮尿的功效。近年來，從覆盆子中以分離出245 個化合物，包括黃酮類[1-3]、萜類[1-3]、生物堿類[1-2]、甾體類[1-2]、有機酸類[1-2]等。中醫理論中認為腎主骨、藏精、生髓[4]，骨質疏松癥的主要病機是腎精虧虛、骨髓減少。因此，從補腎中藥覆盆子出發尋找有效的抗骨質疏松活性化合物是一條有效的途徑。

大麻素2 型受體（cannabinoid receptor type 2，CB2R）蛋白具有多種藥理活性，包括鎮痛、抗炎、抗纖維化以及抗骨質疏松[5-8]。骨質疏松癥是一種以成骨細胞形成新骨和破骨細胞對骨吸收代謝失衡所引起的以單位體積骨量減少、骨的微觀結構退化為特征的全身性疾病。有研究表明CB2R 與骨質疏松癥有一定的聯系[9]。Ofek 等[10]使用了一種合成特異性激動CB2R 的激動劑HU-308，并在去卵巢骨質疏松小鼠模型中評估該CB2R 特異性激動劑在減少骨質丟失方面的潛力。

因此，本研究以CB2R 為靶點進行活性導向分離，得到 24 個化合物，分別鑒定為山柰酚（kaempferol，1）、木犀草苷（luteolin-7-O-glucoside，2）、銀椴苷（tiliroside，3）、金絲桃苷（hyperoside，4）、橙皮素（hesperetin，5）、刺芒柄花素（formononetin，6）、槲皮素（quercetin，7）、對羥基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid，8）、迷迭香酸（rosmarinic acid，9）、對羥基苯甲酸乙酯（ethyl 4-hydroxybenzoate，10）、水楊酸（salicylic acid，11）、沒食子酸（gallic acid，12）、咖啡酸（caffeic acid，13）、原兒茶酸（protocatechuic acid，14）、鞣花酸（ellagic acid，15）、香草酸（vanillic acid，16）、loliolide（17）、對羥基苯甲酸甲酯（methyl 4-hydroxybenzoate，18）、ethyl dioxindole-3-acetate（19）、苦莓苷F1（niga-ichigoside F1，20）、科羅索酸（corosolic acid，21）、委陵菜酸（tormentic acid，22）、山楂酸（maslinic acid，23）、野鴉椿酸（euscaphic acid，24）。通過雙熒光素酶篩選體系、cAMP 積聚水平、CB2R蛋白表達來對分離得到的單體化合物進行進一步篩選和評價它們對CB2R 的激動活性，并評估篩選的化合物對破骨細胞的調控作用，為進一步開發掌葉覆盆子提供科學依據。

1 材料

1.1 藥材

覆盆子購買自浙江省磐安縣，經浙江中醫藥大學藥學院秦路平教授鑒定為薔薇科植物掌葉覆盆子R.chingiiHu.的干燥未成熟果實，樣品標本（20201201RBC）存放于浙江中醫藥大學藥學院中藥鑒定與品質評價實驗室。

1.2 細胞

人胚胎腎細胞HEK293（GNHu43）、小鼠單核巨噬細胞RAW264.7（TCM13）購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。HEK293-CB2 細胞和HEK293-EGFP 細胞分別為轉染穩定表達CB2R 和綠色熒光蛋白的細胞，由課題組前期實驗研究獲得，具體轉染流程參考課題組前期實驗研究[11]。

1.3 試劑

DMEM 培養基（批號8117161，美國Gibco 公司）、青霉素-鏈霉素（批號15140-122，美國Gibco公司）、FBS 胎牛血清（批號10091-148，美國Gibco公司）、CCK-8 增殖檢測試劑盒（ab228554，中國Biosharp）、Western 及IP 細胞裂解液（P0013，上海碧云天生物科技有限公司）、增強型BCA 蛋白定量試劑盒（P0010，上海碧云天生物科技有限公司）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（RG028，上海碧云天生物科技有限公司）、腺苷酸環化酶激活劑forskolin（S1612）、人環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）檢測試劑盒（MM-0006H1，酶免生物有限公司）、CB2R 激動劑 HU308（ab254226，英國Abcam公司）、CB2R抑制劑AM630（GC10147，美國GLPBIO 公司）、Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody（7074S，美國CST 公司）、Beta-Tubulin Rabbit Ab（2146S，美國CST 公司）、Anti-Cannabinoid Receptor Ⅱ（ab3561，英國Abcam 公司）。

1.4 儀器

半制備高效液相色譜儀（1200，Agilent 科技有限公司）；二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；雙垂直電泳儀、凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；多功能酶標儀（美國Bio-Tec 公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 提取與分離

掌葉覆盆子未成熟果實（10 kg）粉碎后，過100目篩網，使用95%的乙醇加熱回流提取3 次（每次3 h），合并3 次的醇提液并將醇提液濃縮至無醇味以獲得浸膏。將浸膏（302.51 g）用1 L 水使之懸浮，用等量的石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到石油醚層浸膏（15.20 g）、二氯甲烷層浸膏（34.60 g）、醋酸乙酯層浸膏（39.20 g）和正丁醇層浸膏（57.30 g）。取醋酸乙酯層浸膏35.00 g 經100～200 目正相硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（30∶1～5∶1）和二氯甲烷-甲醇（70∶1～0∶1）梯度洗脫得到7 組流分Fr.1～7。Fr.7（4 579.62 mg）再經300～400 目硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（3∶1～1∶1）梯度洗脫，得到9 組流分Fr.7-1～7-9，其中Fr.7-6（99.10 mg）、Fr.7-8（12.35 mg）、Fr.7-9（171.82 mg）經半制備液相分離。Fr.7-6 通過半制備高效液相色譜，以甲醇-水（60∶40）等度洗脫得到化合物1（23.62 mg，tR＝13.5 min）。

Fr.7-8 通過半制備高效液相色譜，以甲醇-水（45∶55）等度洗脫，得到化合物2（2.82 mg，tR＝9.3 min）。Fr.7-9 通過半制備高效液相，以甲醇-水（40∶60）等度洗脫，得到化合物3（6.82 mg，tR＝7.2 min）和4（10.52 mg，tR＝19.8 min）。Fr.7-5（159.40 mg）經300～400 目硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（5∶1～2∶1）梯度洗脫得到3 組流分Fr.7-5-1～7-5-3。其中Fr.7-5-1（29.50 mg）通過以異丙醇-水混合體系進行重結晶得到化合物5（7.93 mg）。Fr.7-5-3（95.5 mg）通過300～400 目正相硅膠，以石油醚-醋酸乙酯（3∶1～1∶1）洗脫得到Fr.7-5-3-1（21.74 mg）和Fr.7-5-3-2（16.25 mg）。Fr.7-5-3-1 經半制備高效液相色譜，以甲醇-水（55∶45）等度洗脫得到化合物6（3.94 mg，tR＝24.7 min）。再將組分Fr.7-5-3-2 經半制備高效液相，以甲醇-水（40∶60）等度洗脫得到化合物7（5.27 mg，tR＝21.4 min）。Fr.7-3（75.3 mg）通過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以甲醇-水（20∶80～100∶0）為體系進行梯度洗脫，得到化合物8（12.73 mg）。

取二氯甲烷萃取層浸膏33.00 g，通過100～200目硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（30∶1～2∶1）和二氯甲烷-甲醇（70∶1～0∶1）梯度洗脫共得到9 組流分為Fr.1～9。Fr.4（686.30 mg）經300～400 目硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（8∶1、6∶1）梯度洗脫得到3 組流分Fr.4-1～4-3。其中Fr.4-2（261.20 mg）通過半制備高效液相色譜，以甲醇-水（50∶50）等度洗脫得到化合物9（7.10 mg，tR＝13.7 min）和10（4.27 mg，tR＝26.5 min）。Fr.4-1（109.70 mg）溶于適量甲醇中，通過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（50∶50～0∶100）為流動相梯度洗脫，得到化合物11（17.92 mg）和12（14.26 mg）。Fr.4-3（136.71 mg）通過300-400 目硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（6∶1、4∶1、2∶1）梯度洗脫得到3 組流分Fr.4-3-1～4-3-3。其中Fr.4-3-3（36.82 mg）通過半制備型高效液相，以甲醇-水（55∶45）等度洗脫得到化合物13（5.28 mg，tR＝31.7 min）。

Fr.5（180.10 mg）經300～400 目正相硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1、6∶1、4∶1）梯度洗脫得到5 組流分Fr.5-1～5-5。其中Fr.5-2（58.00 mg）再經300～400 目硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（7∶1、4∶1）梯度洗脫得到2 組流分Fr.5-2-1～5-2-2，將Fr.5-2-2（25.17 mg）通過半制備型高效液相，以甲醇-水（60∶40）等度洗脫，得到化合物14（4.92 mg，tR＝16.4 min）。Fr.5-5（95.70 mg）通過300～400 目正相硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（4∶1、1∶1）梯度洗脫，得到3 組流分Fr.5-5-1～5-5-3。將Fr.5-5-2（38.27 mg）繼續通過300～400 目正相硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇（7∶1、4∶1）梯度洗脫，得到化合物15（3.82 mg）。

Fr.6（1 356.00 mg）通過300～400 目正相硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（6∶1、4∶1）梯度洗脫，得到7 組流分Fr.6-1～6-7。取Fr.6-4（344.40 mg）在經300～400 目正相硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（7∶1、5∶1）梯度洗脫，得到2 組流分Fr.6-4-1～6-4-2，將Fr.6-4-2（284.40 mg）繼續通過300-400目正相硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（6∶1、4∶1）梯度洗脫，得到3 組流分Fr.6-4-2-1～6-4-2-3。再將Fr.6-4-2-3（63.92 mg）通過半制備型高效液相色譜，以甲醇-水（45∶55）等度洗脫，得到化合物16（6.30 mg，tR＝15.7 min）。Fr.6-6（158.40 mg）經300～400 目正相硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（7∶1）等度洗脫得到3 組流分Fr.6-6-1～6-6-3。Fr.6-6-3（83.30 mg）通過300～400 目正相硅膠，以石油醚-醋酸乙酯（5∶1、2∶1）梯度洗脫，得到3 組流分Fr.6-6-3-1～6-6-3-3。Fr.6-6-3-2（41.43 mg）通過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以甲醇-水（50∶50～0∶100）梯度洗脫得到2 組流分Fr.6-6-3-2-1～6-6-3-2-2。將Fr.6-6-3-2-2（18.51 mg）通過半制備型高效液相色譜，以甲醇-水（40∶60）等度洗脫得到化合物17（6.50 mg，tR＝29.4 min）。

Fr.7（1 936.00 mg）通過300～400 目正相硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（5∶1、3∶1、2∶1）梯度洗脫，得到8 組流分Fr.7-1～7-8。Fr.7-2（107.60 mg）經300～400 目正相硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（6∶1）等度洗脫，得到2 組流分Fr.7-2-1～7-2-2，將組分Fr.7-2-2（31.90 mg）通過半制備型高效液相色譜，以甲醇-水（48∶52）等度洗脫，得到化合物18（7.24 mg，tR＝34.3 min）。將Fr.7-6（272.90 mg）經300～400 目正相硅膠柱分離，以石油醚-醋酸乙酯（4∶1、2∶1）梯度洗脫，得到3 組流分Fr.7-6-1～7-6-3。將Fr.7-6-3（179.40 mg）通過300～400 目正相硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇（5∶1、2∶1）梯度洗脫得到4 組流分Fr.7-6-3-1～7-6-3-4。再將Fr.7-6-3-4（123.90 mg）繼續通過300～400 目正相硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇（4∶1、2∶1）梯度洗脫得到2 組流分Fr.7-6-3-4-1（36.31 mg）、Fr.7-6-3-4-2（52.92 mg）。將Fr.7-6-3-4-2（52.92 mg）通過半制備高效液相，以甲醇-水（35∶65）等度洗脫，得到化合物19（5.10 mg，tR＝42.7 min）。

將Fr.7-7（232.00 mg）通過300～400 目正相硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（4∶1、2∶1）梯度洗脫，得到3 組流分Fr.7-7-1～7-7-3。取Fr.7-7-3（123.90 mg）繼續通過300～400 目正相硅膠柱分離，以二氯甲烷-甲醇（6∶1、3∶1）梯度洗脫得到4 組流分Fr.7-7-3-1～7-7-3-4。將Fr.7-7-3-3（59.46 mg）通過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以甲醇-水（45∶55～0∶100）梯度洗脫得到2 組流分Fr.7-7-3-3-1 和Fr.7-7-3-3-2。將組分Fr.7-7-3-3-2（15.38 mg）通過半制備型高效液相，以乙腈-水（36∶64）等度洗脫，得到化合物20（4.28 mg，tR＝39.6 min）。

Fr.8（1 345.00 mg）通過D101 大孔樹脂，以甲醇-水（0∶100～100∶0）梯度洗脫，得到5 組流分Fr.8-1～8-5。Fr.8-4（583.38 mg）通過300～400 目正相硅膠柱分離，以二氯甲烷-甲醇（4∶1、2∶1）梯度洗脫，得到4 組流分Fr.8-4-1～8-4-4。Fr.8-4-3（182.30 mg）經300～400 目正相硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（5∶1、2∶1）梯度洗脫，得到3組流分Fr.8-4-3-1～8-4-3-3。Fr.8-4-3-3（31.73 mg）在通過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以甲醇-水（40∶60～0∶100）梯度洗脫，得到化合物21（4.72 mg）。

Fr.8-4-4（208.20 mg）經300～400 目正相硅膠柱分離，以石油醚-醋酸乙酯（4∶1、2∶1）梯度洗脫，得到3 組流分Fr.8-4-4-1～8-4-4-3。將Fr.8-4-4-2（35.96 mg）通過半制備型高效液相色譜，以乙腈-水（42∶58）等度洗脫得到化合物22（3.95 mg，tR＝34.6 min）。Fr.8-4-4-3（110.14 mg）通過300～400 目正相硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（3∶1）等度洗脫得到2 組流分Fr.8-4-4-3-1～8-4-4-3-2。繼續將Fr.8-4-4-3-2（63.73 mg）通過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以甲醇-水（80∶20）等度洗脫得到2 組流分Fr.8-4-4-3-2-1～8-4-4-3-2-2。再將Fr.8-4-4-3-2-2（31.79 mg）通過半制備型高效液相，以甲醇-水（45∶55、30∶70）梯度洗脫得到化合物23（3.72 mg，tR＝26.7 min）和24（4.18 mg，tR＝11.4 min）。

2.2 細胞培養

人胚胎腎細胞HEK293 和小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 均使用含10% FBS 和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養基，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

破骨細胞由RANKL 誘導液刺激RAW264.7 細胞分化獲得，RANKL 誘導液的配制為每1 mL 培養液加入5 μL RANKL（5 ng/mL）。向RAW264.7 細胞中加入RANKL 誘導液培養5 d 來獲得破骨細胞。

2.3 具有特異性激動CB2R 活性化合物的篩選

2.3.1 CCK-8 檢測細胞活性 將分離得到的24 個化合物用二甲基亞砜（DMSO）配制成母液（質量濃度為100 μg/μL），在用培養基稀釋為不同質量濃度的藥液（25、50、100 μg/mL），DMSO 在藥液中的終體積分數在0.1%以下。將HEK293-CB2 細胞以3×103的密度接種于96 孔板中培養24 h，貼壁后加入不同質量濃度的藥液培養48 h 后用CCK-8法檢測細胞活性，使用多功能酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（A）。

2.3.2 陽性細胞篩選 將HEK293-CB2 細胞以3×104的密度接種于48 孔板上，待細胞貼壁后饑餓培養24 h。加入1 μmol/L 的CB2R 激動劑HU308 和不同質量濃度的24 個單體化合物藥液處理細胞6 h，以正常加入培養基組為對照組，HU308 為陽性對照組，24 個不同質量濃度單體化合物為實驗組。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測藥物對HEK293-CB2 細胞內CB2R 的激活情況，通過計算相對發光值來定量表示CB2R 激動水平。

2.3.3 陰性細胞篩選 為了消除假陽性化合物的干擾，將上一步中篩選得到的化合物用未轉染CB2R 的HEK293-EGFP 陰性細胞進一步篩選。將HEK293-EGFP 細胞以3×104的密度接種于48 孔板上，貼壁后饑餓培養24 h，用1 μmol/L HU308 和不同質量濃度的5 個單體化合物處理細胞6 h，通過計算相對發光值來確定CB2R 的表達水平。

2.3.4 篩選的化合物對CB2R 激動作用的特異性檢測 使用CB2R 抑制劑AM630 驗證化合物對CB2R的特異性激活作用。HEK293-CB2 細胞接種于48 孔板（3×104個/孔）。貼壁后饑餓24 h，用1 μmol/L AM630 和上一步篩選得到的2 個單體化合物（橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯）處理細胞6 h，通過計算相對發光值來確定細胞內CB2R 的激動情況。

2.4 橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對CB2R 的激動作用分析

2.4.1 細胞內cAMP 水平的測定 將HEK293-CB2細胞以5×105個/孔的密度接種于6 孔板中，待細胞貼壁后用forskolin（腺苷酸環化酶激活劑）刺激HEK293-CB2 細胞內cAMP 含量增加，并饑餓處理24 h，分別加入1 μmol/L HU308 和不同質量濃度（0、25、100、200、400、800 μg/mL）的橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯培養細胞6 h，細胞用PBS 洗滌2 次后，加入細胞裂解液于冰上裂解細胞30 min，收集細胞裂解液以3 000 r/min 離心20 min，取上清液。按照說明書用cAMP 試劑盒測定細胞上清液中的cAMP 水平。

2.4.2 Western blotting 檢測CB2R 蛋白表達 設置對照組、給藥組（100 μg/mL）和給藥＋抑制劑（1 μmol/L）組。將HEK293-CB2 細胞接種于6 孔板中（5×105個/孔）。待細胞貼壁后饑餓處理24 h，給予細胞100 μg/mL 的橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯處理6 h。提取HEK293-CB2 細胞總蛋白，用BCA 試劑盒對蛋白進行定量，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到PVDF 膜上。用封閉液封閉PVDF 膜2 h 后，加入CB2R 抗體（1∶500）和β-Tubulin 抗體（1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜。用洗滌液清洗膜3 次（每次10 min），然后與相應二抗（1∶1 000）在室溫下孵育1 h，清洗3 次后加入BeyoECL 顯影劑，用Monad QuickChemi 5100 化學發光儀分析蛋白條帶并用Image J 軟件處理。

2.4.3 藥物對細胞自身熒光的激活分析 使用已轉染綠色熒光增強蛋白的HEK293-CB2 細胞，觀察橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對細胞的激活作用，細胞正常培養貼壁后給予藥物處理6 h，吸棄培養基，用PBS 洗滌細胞3 次，將細胞置于熒光顯微鏡下觀察細胞自身發出的綠色熒光。

2.5 橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對破骨細胞的作用

2.5.1 破骨細胞活力和TRAP 活性與染色測定 將RAW264.7 細胞接種于96 孔板（6×103個/孔）中，孵育24 h，再用橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯（100 μg/mL）處理細胞48 h，用CCK-8 法檢測細胞活力。

另外將RAW264.7 細胞接種于96 孔板（1×104個/孔），分為對照組、給藥組（100 μg/mL）和給藥＋抑制劑（1 μmol/L）組。用化合物（橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯）和RANKL 誘導液共處理細胞5 d 后，按照TRAP 活性實驗步驟檢測破骨細胞的TRAP 活性。

TRAP 反應液的制備：將40 mg 對硝基苯基磷酸二鈉和0.2 g 酒石酸鉀鈉混合均勻，用1 mol/L 鹽酸調節pH 至3.5 后，溶解于15 mL 無菌水中，在加入無菌水定量至20 mL。

按照上述種板方法進行TRAP 染色，以鑒定破骨細胞，并在正置顯微鏡下觀察藥物對破骨細胞分化的影響。

2.5.2 破骨細胞F-肌動蛋白環（F-actin）的免疫熒光染色 將RAW264.7 細胞以5×104個/孔的密度接種到直徑35 mm 的激光共聚焦培養皿中培養24 h，設置對照組、給藥組（100 μg/mL）和給藥＋抑制劑（1 μmol/L）組。用RANKL 誘導液稀釋藥物（100 μg/mL）和抑制劑AM630，并給予細胞共培養5 d。細胞用PBS 清洗2 次，在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min。去掉多聚甲醛后，用PBS 洗滌2 次，在室溫下用0.2% Triton X-100 處理5 min，細胞用PBS洗滌2 次，加入5 μg/mL 的鬼筆環肽染液，于37 ℃下孵育30 min，再次用PBS 洗滌2 次，DAPI 染液染色5 min，細胞繼續用PBS 洗滌2 次后，每皿加入200 μL PBS 使細胞浸潤，于激光共聚焦顯微鏡下觀察破骨細胞的F-actin 環結構。

2.5.3 破骨細胞骨吸收的測定 將牛皮質骨片浸泡在含1%雙抗的PBS 溶液中。每小時更換1 次PBS，重復浸泡3 次，將骨片于紫外線下照射1 h 并按照48 孔板孔徑剪成圓形，置于48 孔板中。RAW264.7 細胞接種于48 孔板（5×104個/孔），培養貼壁。用RANKL 誘導液將待測化合物（橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯）稀釋至100 μg/mL，給予細胞培養9 d，期間每隔3 d 更換1 次培養液。取出骨切片，用PBS 清洗2 次，用2.5%戊二醛固定10 min，在用0.25 mol/L 氨水超聲清洗3 次（每次5 min），于室溫下晾干。用1%甲苯胺藍染料染色15 min，用超純水清洗直到不再褪色，于顯微鏡下觀察骨切片表面，并拍照記錄。

2.6 數據分析

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1：黃色粉末，易溶于甲醇，ESI-MSm/z287.05 [M＋H]+，相對分子質量 286，分子式C15H10O6。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ: 8.07(2H, d,J= 8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d,J= 8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.37 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-8), 6.16 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, Methanol-d4)δ:177.3 (C=O), 165.5 (C-7), 162.4 (C-9), 160.5 (C-4′),158.2 (C-5), 148.0 (C-2), 137.1 (C-3), 130.7 (C-2′, 6′),123.7 (C-1′), 116.3 (C-3′, 5′), 104.5 (C-10), 99.3 (C-6),94.5 (C-8)。以上數據與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物1 為山柰酚。

化合物2：黃色粉末，易溶于甲醇和乙醇，ESIMSm/z471.10 [M＋Na]+，相對分子質量448，分子式C21H20O11。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 12.99(1H, s, 5-OH), 7.45 (1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-6′), 7.42(1H, d,J= 2.2 Hz, H-2′), 6.91 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′),6.79 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-8), 6.75 (1H, s, H-3), 6.45(1H, d,J= 2.2 Hz, H-6), 5.08 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-1′′),3.70 (1H, d,J= 10.3 Hz, H-2′′), 3.50～3.42 (2H, m, H-3′′, 5′′), 3.32～3.23 (2H, m, H-6′′), 3.17 (1H, t,J= 9.0 Hz, H-4′′)。13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6)δ: 181.8(C-4), 164.4 (C-2), 162.9 (C-7), 160.9 (C-5), 156.9 (C-9), 149.7 (C-4′), 145.7 (C-3′), 121.5 (C-1′), 119.2 (C-6′), 115.9 (C-5′), 113.5 (C-2′), 105.4 (C-10), 103.3 (C-3), 99.9 (C-1′′), 99.5 (C-6), 94.8 (C-8), 77.2 (C-3′′),76.3 (C-5′′), 73.1 (C-2′′), 69.5 (C-4′′), 60.5 (C-6′′)。以上數據與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物2 為木犀草苷。

化合物3：淡黃色結晶（乙醇-水），易溶于甲醇，分子式C30H26O13。1H NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ: 7.98 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2′,6′), 7.40 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-7′′), 7.30 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2′′′,6′′′), 6.80 (4H,dd,J= 15.5, 8.7 Hz, H-3′,5′), 6.30 (1H, d,J= 2.1 Hz,H-8), 6.12 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6), 6.07 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′′′), 5.25 (1H, d,J= 7.4 Hz, H-1′′), 4.30(1H, dd,J= 11.8, 2.3 Hz, H-6′′a), 4.19 (1H, dd,J= 11.8,6.7 Hz, H-6′′b)；13C-NMR (150 MHz, Methanol-d4)δ:179.4 (C-4), 168.8 (C-9′′′), 165.9 (C-7), 162.9 (C-5),161.5 (C-4′), 161.2 (C-4′′), 159.4 (C-9), 158.4 (C-2),146.5 (C-7′′′), 135.2 (C-3), 132.2 (C-2′, 6′), 131.2 (C-2′′′, 6′′′), 127.1 (C-1′′′), 122.7 (C-1′), 116.8 (C-3′′′, 5′′′),116.0 (C-3′, 5′), 114.8 (C-8′′′), 105.6 (C-1′′), 103.9 (C-10), 99.9 (C-6), 94.8 (C-8), 78.0 (C-5′′), 75.8 (C-2′′),75.7 (C-3′′), 71.7 (C-4′′), 64.3 (C-6′′)。以上數據與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物3 為銀椴苷。

化合物4：黃色粉末，易溶于甲醇、乙醇，ESIMSm/z465.10 [M＋H]+，相對分子質量464，分子式C21H20O12。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.67(1H, dd,J= 8.5, 2.3 Hz, H-6′), 7.52 (1H, s, H-2′), 6.81(1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 6.41 (1H, s, H-8), 6.20 (1H,s, H-6), 5.38 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-1), 5.16 (1H, d,J=4.7 Hz, 4-OH), 4.89 (1H, d,J= 5.6 Hz, 2-OH), 4.51～4.42 (1H, m, H-4′′), 3.64 (1H, dd,J= 5.9, 3.4 Hz, H-3′′), 3.56 (1H, qd,J= 7.0, 3.2 Hz, H-6′′), 3.45 (1H, ddt,J= 7.8, 5.9, 3.8 Hz, H-2′′, 5′′), 3.36 (4H, d,J= 13.7 Hz,H-4′), 3.33 (1H, t,J= 6.0 Hz, H-2), 3.28 (1H, ddd,J=10.5, 8.0, 5.6 Hz, H-3′)；13C-NMR (150 MHz, DMSOd6)δ: 177.5 (C-4), 164.1 (C-7), 161.2 (C-5), 160.9 (C-2), 156.3 (C-9),148.4 (C-4′)，144.8 (C-3′), 133.5 (C-3),121.9 (C-1′), 121.1 (C-6′), 115.9 (C-5′), 115.2 (C-2′),103.9 (C-10), 101.8 (C-1′′), 98.6 (C-6), 93.5 (C-8), 75.8(C-5′′),73.2 (C-3′′), 71.2 (C-2′′), 67.9 (C-4′′), 60.1 (C-6′′)。以上數據與文獻報道基本一致[15]，故化合物4鑒定為金絲桃苷。

化合物5：無色針狀晶體（甲醇），易溶于甲醇、乙醇，分子式C16H14O6。1H-NMR (600 MHz, Methanold4)δ: 6.94 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2′), 6.93 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5′), 6.90 (1H, dd,J= 8.3, 2.0 Hz, H-6′), 5.90 (1H,d,J= 2.1 Hz, H-6), 5.88 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-8), 5.30(1H, dd,J= 12.8, 3.1 Hz, H-2), 3.86 (3H, s, -OCH3),3.05 (1H, dd,J= 17.1, 12.7 Hz, H-3a), 2.70 (1H, dd,J= 17.1, 3.1 Hz, H-3b)；13C-NMR (150 MHz,Methanol-d4)δ: 197.6 (C=O), 168.3 (C-7), 165.4 (C-5),164.7 (C-9), 149.3 (C-3′), 147.8 (C-4′), 133.1 (C-1′),118.9 (C-6′), 114.5 (C-2′), 112.6 (C-5′), 97.1 (C-10),96.2 (C-8), 80.3 (C-2), 56.4 (-OCH3), 44.1 (C-3)。以上數據與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物5 為橙皮素。

化合物6：褐色粉末狀，易溶于甲醇、乙醇，難溶于水，分子式C16H12O4。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.33 (1H, s, H-1), 7.97 (1H, d,J= 8.8 Hz,H-5), 7.50 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.98 (2H, d,J=8.7 Hz, H-3′, 5′), 6.94 (1H, dd,J= 8.7, 2.2 Hz, H-6),6.87 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-8), 3.78 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 174.6 (C-4), 162.5(C-7), 158.9 (C-4′), 157.4 (C-9), 153.1 (C-2), 130.0 (C-2′, 6′), 127.3 (C-5), 124.2 (C-1′), 123.2 (C-3), 116.6 (C-10), 115.1 (C-6), 113.6 (C-5′, C-3′), 102.1 (C-8), 55.1(-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[17]，故化合物6 鑒定為刺芒柄花素。

化合物7：黃色粉末，不溶于水，難溶于甲醇，易溶于二甲基亞砜，ESI-MSm/z303.05 [M＋H]+，相對分子質量302，分子式C15H10O7。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 12.48 (1H, s, 5-OH), 7.68 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2′), 7.54 (1H, dd,J= 8.4, 2.2 Hz, H-6′),6.89 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 6.41 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8′), 6.19 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6)δ: 175.8 (C=O), 163.8 (C-7), 160.5(C-5), 156.2 (C-9), 147.6 (C-4′), 146.8 (C-2), 144.9 (C-3′), 135.7 (C-3), 122.1 (C-1′), 120.1 (C-6′), 115.6 (C-5′), 115.1 (C-2′), 103.1 (C-10), 98.1 (C-6), 93.4 (C-8)。以上數據與文獻報道基本一致[18]，故化合物7 鑒定為槲皮素。

化合物8：白色結晶（甲醇-水），微溶于水，易溶于二甲基亞砜，分子式C7H6O3。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ: 7.88 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, 6),6.82 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (150 MHz,Methanol-d4)δ: 170.1 (C-7), 163.3 (C-4), 133.0 (C-2,6), 122.7 (C-1), 116.0 (C-3, 5)。以上數據與文獻報道基本一致[19]，故鑒定化合物8 為對羥基苯甲酸。

化合物9：黃白色粉末，易溶于水、甲醇、乙醇，分子式C18H16O8。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 7.55 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-7), 7.04 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-2), 6.95 (1H, dd,J= 8.2, 2.1 Hz, H-6), 6.78 (1H,d,J= 8.1 Hz, H-5′), 6.61 (1H, dd,J= 8.1, 2.1 Hz, H-5), 6.27 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8), 5.18 (1H, dd,J= 8.5,4.2 Hz, H-8′), 3.10 (1H, dd,J= 14.3, 4.2 Hz, H-7′α),3.00 (1H, dd,J= 14.4, 8.5 Hz, H-7′β)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 173.8 (C-9′), 168.5 (C-9), 149.7 (C-4′), 147.7 (C-7), 146.8 (C-3′), 146.2 (C-4), 145.3 (C-3),129.4 (C-1′), 127.7 (C-1), 123.1 (C-6), 121.8 (C-5),117.6 (C-2′), 116.5 (C-5′), 116.3 (C-6′), 115.2 (C-2),114.2 (C-8), 74.8 (C-8′), 37.97 (C-7′)。以上數據與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物9 為迷迭香酸。

化合物10：無色晶體（乙醇），易溶于甲醇、乙醇，分子式C9H10O3。1H-NMR (600 MHz, Methanold4)δ: 7.87 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3, 5), 6.82 (2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6), 4.30 (2H, q,J= 7.1 Hz, -OCH2), 1.36(3H, t,J= 7.1 Hz, -CH3)；13C-NMR (150 MHz,Methanol-d4)δ: 168.3 (-CO-), 163.4 (C-4), 132.7 (C-2,6), 122.5 (C-1), 116.1 (C-3, 5), 61.7 (-OCH2-), 14.6 (-CH3)。以上數據與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物10 為對羥基苯甲酸乙酯。

化合物11：白色結晶（甲醇），易溶于甲醇、乙醇，分子式C7H6O3。1H-NMR (600 MHz, Methanold4)δ: 7.85 (1H, dd,J= 7.9, 1.8 Hz, H-6), 7.46 (1H, ddd,J= 8.7, 7.2, 1.7 Hz, H-4), 6.93～6.86 (2H, m, H-3, 5)；13C NMR (150 MHz, Methanol-d4)δ: 173.5 (-COOH),163.2 (C-2), 136.6 (C-4), 131.5 (C-6), 120.0 (C-5),118.1 (C-3), 113.9 (C-1)。以上數據與文獻報道基本一致[22]，故鑒定化合物11 為水楊酸。

化合物12：白色結晶粉末，易溶于熱水、甲醇，分子式C7H6O5。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ:7.06 (2H, s, H-2, 6)；13C-NMR (150 MHz, Methanold4)δ: 168.9 (-COOH), 145.0 (C-3, 5), 138.2 (C-4),120.6 (C-1), 108.9 (C-2, 6)。以上數據與文獻報道基本一致[23]，故化合物12 鑒定為沒食子酸。

化合物13：黃色結晶粉末，易溶于甲醇、乙醇，分子式C9H8O4。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ:7.53 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-7), 7.04 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-2), 6.93 (1H, dd,J= 8.2, 2.1 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5), 6.22 (1H, d,J= 15.8 Hz, H-8)；13CNMR (150 MHz, Methanol-d4)δ: 171.0 (C-9), 149.4(C-3), 147.0 (C-7), 146.8 (C-4), 127.8 (C-1), 122.8 (C-6), 116.5 (C-8), 115.5 (C-5), 115.1 (C-2)。以上數據與文獻報道基本一致[24]，故化合物13 鑒定為咖啡酸。

化合物14：白色近棕褐色粉末，易溶于水、甲醇、乙醇，ESI-MSm/z155.03 [M＋H]+，相對分子質量154，分子式C7H6O4。1H-NMR (600 MHz,Methanol-d4)δ: 7.43 (3H, s, H-6), 7.42 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-2), 6.79 (2H, d,J= 8.0 Hz, H-5)；13C-NMR (150 MHz, Methanol-d4)δ: 170.2 (C-7), 151.5 (C-4), 146.1(C-3), 123.9 (C-6), 123.1 (C-1), 117.7 (C-2), 115.8 (C-5)。以上數據與文獻報道基本一致[25]，故鑒定化合物14 為原兒茶酸。

化合物15：灰黃色粉末，易溶于甲醇，分子式C14H16O8。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.47 (2H,s, H-5, 5′)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 159.2(C-7, 7′), 148.0 (C-4, 4′), 139.5 (C-3, 3′), 136.4 (C-2,2′), 112.4 (C-1, 1′), 110.3 (C-5, 5′), 107.8 (C-6, 6′)。以上數據與文獻報道基本一致[26]，故鑒定化合物15 為鞣花酸。

化合物16：白色結晶性粉末，易溶于甲醇、乙醇，分子式C8H8O4。1H-NMR (600 MHz, Methanold4)δ: 7.56 (2H, dd,J= 6.0, 1.9 Hz, H-2,H-6), 6.84 (1H,d,J= 8.8 Hz, H-5), 3.89 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR(150 MHz, Methanol-d4)δ：170.0 (-COOH), 152.7 (C-4), 148.7 (C-3), 125.3 (C-6), 123.1 (C-1), 115.8 (C-5),113.8 (C-2), 56.4 (-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[27]，故鑒定化合物16 為香草酸。

化合物17：黃色油狀液體，易溶于甲醇，分子式C11H16O3。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ: 5.75(1H, s, H-7), 4.22 (1H, s, H-3), 2.42 (1H, d,J= 13.3 Hz, H-4a), 1.99 (1H, d,J= 14.4 Hz, H-2a), 1.76 (3H, s,H-11), 1.47 (3H, s, H-9), 1.28 (3H, s, H-10)；13C-NMR(150 MHz, Methanol-d4)δ: 185.7 (C-6), 174.5 (C-8),113.3 (C-7), 88.9 (C-5), 67.2 (C-3), 47.9 (C-4), 46.5 (C-2), 37.2 (C-1), 31.0 (C-10), 27.4 (C-11), 26.9 (C-9)。以上數據與文獻報道基本一致[28]，故鑒定化合物17 為loliolide。

化合物18：白色結晶粉末，易溶于甲醇，微溶于水，分子式C8H8O3。1H-NMR (600 MHz, Methanold4)δ: 7.86 (2H, d,J= 8.9 Hz, H-2, 6), 6.82 (2H, d,J=8.8 Hz, H-3, 5), 3.84 (3H, s, -COOCH3)；13C-NMR(150 MHz, Methanol-d4)δ: 168.7 (C-7), 163.5 (C-4),132.7 (C-2, 6), 122.2 (C-1), 116.1 (C-3, 5), 52.2 (-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[29]，故鑒定化合物18 為對羥基苯甲酸甲酯。

化合物19：淡黃色油性粉末，易溶于甲醇，分子式C12H13ON。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ:7.35 (1H, d,J= 7.4 Hz, H-4), 7.25 (1H, td,J= 7.7, 1.3 Hz, H-6), 7.05～7.00 (1H, m, H-5), 6.88 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-7), 3.89 (2H, d,J= 7.0 Hz, H-10), 3.09 (1H, d,J= 15.2 Hz, H-8), 3.02 (1H, d,J= 15.2 Hz, H-8), 1.00(3H, s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, Methanol-d4)δ:180.8 (C-2), 170.4 (C-9), 143.6 (C-7a), 131.7 (C-3a),130.9 (C-4), 125.2 (C-6), 123.5 (C-5), 111.2 (C-7), 74.8(C-3), 61.6 (C-10), 42.9 (C-8), 14.1 (C-11)。以上數據與文獻報道基本一致[30]，故鑒定化合物19 為ethyl dioxindole-3-acetate。

化合物20：白色粉末狀，易溶于甲醇，分子式C36H58O11。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ: 5.32(1H, d,J= 8.3 Hz, H-1′), 1.34 (3H, s, H-27), 1.21 (3H,s, H-29), 1.04 (3H, s, H-25), 0.93 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-30), 0.78 (3H, s, H-26), 0.70 (3H, s, H-24)；13C-NMR(150 MHz, Methanol-d4)δ: 178.6 (C-28), 139.8 (C-13),129.5 (C-12), 95.8 (C-1′), 78.6 (C-3′), 78.4 (C-5′), 78.3(C-3), 73.9 (C-2′), 73.7 (C-19), 71.2 (C-4′), 69.7 (C-2),66.5 (C-23), 62.5 (C-6′), 54.9 (C-18), 48.3 (C-5), 47.9(C-9, C-17), 44.1 (C-4), 42.9 (C-14), 42.8 (C-20), 41.3(C-8), 39.0 (C-10), 38.3 (C-22), 33.5 (C-7), 29.6 (C-15), 27.2 (C-29), 27.1 (C-21), 26.5 (C-16), 24.8 (C-27),24.7 (C-11), 19.3 (C-6), 17.7 (C-25), 17.6 (C-30), 16.6(C-26), 13.9 (C-24)。以上數據與文獻報道基本一致[31]，故鑒定化合物20 為苦莓苷F1。

化合物21：白色粉末，易溶于甲醇，難溶于水，分子式C30H48O4。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:11.97 (1H, s, -COOH), 5.13 (1H, brs) 為環內雙鍵質子信號, 1.07 (3H, s, H-23), 0.70 (3H, s, H-24), 0.85(3H, s, H-25), 0.68 (3H, s, H-26), 1.28 (3H, s, H-27),0.89 (3H, s, H-29), 0.84 (3H, s, H-30) 為7 個甲基質子信號；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 178.2 (C-28), 138.2 (C-13), 124.5 (C-12), 82.2 (C-3), 67.1 (C-2),54.7 (C-5), 52.3 (C-18), 47.0 (C-1, 9), 46.9 (C-17), 46.8(C-14), 41.7 (C-8), 38.9 (C-4), 38.5 (C-20), 38.4 (C-19), 37.5 (C-10), 36.3 (C-22), 32.6 (C-7), 30.2 (C-21),28.8 (C-23), 27.5 (C-15), 23.7 (C-27), 23.2 (C-11), 22.9(C-16), 21.0 (C-30), 17.9 (C-6), 17.1 (C-24), 16.9 (C-26), 16.9 (C-29), 16.4 (C-25)。以上數據與文獻報道基本一致[32]，故鑒定化合物21 為科羅索酸。

化合物22：灰色粉末，易溶于醇，分子式C30H48O5。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ: 1.34(1H, s, H-27), 1.19 (1H, s, H-29), 1.01 (2H, d,J= 7.0 Hz, H-23)；13C-NMR (150 MHz, Methanol-d4)δ: 182.2(C-28), 140.1 (C-13), 129.3 (C-12), 84.6 (C-3), 73.6 (C-19), 69.5 (C-2), 56.7 (C-5), 55.1 (C-18), 48.2 (C-1, 9),43.1 (C-20), 42.7 (C-14), 41.1 (C-17), 40.5 (C-8), 39.2(C-4, 22), 38.9 (C-10), 34.1 (C-7), 29.6 (C-23), 29.3 (C-15), 27.3 (C-21), 27.1 (C-29), 26.6 (C-16), 24.8 (C-27),24.7 (C-11), 19.7 (C-6), 17.5 (C-24), 17.4 (C-26), 17.0(C-25), 16.6 (C-30)。以上數據與文獻報道基本一致[33]，故鑒定化合物22 為委陵菜酸。

化合物23：白色晶體（甲醇-水），易溶于甲醇、乙醇，分子式 C30H48O4。1H-NMR (600 MHz,Methanol-d4)δ: 5.25 (1H, s, H-12), 1.17 (1H, s, 23),1.01 (2H, d,J= 5.3 Hz, H-27), 0.95 (1H, s, H-24), 0.91(1H, s, H-26), 0.81 (2H, d,J= 4.8 Hz, H-30, 25)；13CNMR (150 MHz, Methanol-d4)δ: 181.8 (C-28), 145.4(C-13), 123.5 (C-12), 84.5 (C-3), 69.5 (C-2), 56.7 (C-5), 48.1 (C-9), 47.6 (C-8), 47.3 (C-19), 42.9 (C-1), 42.7(C-17), 40.6 (C-14), 40.5 (C-18), 39.3 (C-10), 34.9 (C-4), 33.9 (C-21), 33.8 (C-29), 33.6 (C-7), 31.6 (C-22),29.3 (C-20), 28.8 (C-23), 26.4 (C-15), 24.6 (C-27), 24.1(C-11), 23.9 (C-30), 19.6 (C-16), 17.7 (C-6), 17.4 (C-24), 17.1 (C-25)。以上數據與文獻報道基本一致[34]，故鑒定化合物23 為山楂酸。

化合物24：白色粉末，可溶于甲醇，分子式C30H48O5。1H-NMR (600 MHz, Methanol-d4)δ: 5.30(1H, t,J= 3.7 Hz, H-12), 1.35 (1H, s, H-27), 1.20 (1H,s, H-25), 0.99 (2H, s, H-23), 0.93 (1H, d,J= 6.7 Hz, H-30), 0.87 (1H, s, H-26), 0.79 (1H, s, H-24)；13C-NMR(150 MHz, Methanol-d4)δ: 182.3 (C-28), 140.1 (C-13),129.4 (C-12), 80.1 (C-3), 73.6 (C-19), 67.2 (C-2), 55.1(C-18), 48.2 (C-5), 43.1 (C-17), 42.8 (C-9), 42.5 (C-1),41.3 (C-14, 20), 39.5 (C-8), 39.4 (C-4), 39.1 (C-10, 22),34.1 (C-7), 29.6 (C-23), 29.2 (C-15), 27.3 (C-21), 27.1(C-29), 26.6 (C-16), 24.9 (C-27), 24.7 (C-11), 22.4 (C-24), 19.3 (C-6), 17.5 (C-26), 16.9 (C-30), 16.6 (C-25)。以上數據與文獻報道基本一致[35]，故鑒定化合物24為野鴉椿酸。

3.2 活性化合物的篩選

采用CCK-8 法檢測待測化合物（25、50、100 μg/mL）作用HEK293-CB2 細胞6 h 后的細胞活力。與對照組相比，分離得到的24 個化合物對HEK293-CB2 細胞的活性沒有顯著影響。

如表1 所示，以HU308（1 μmol/L，CB2R 的特異性激動劑）為參照，評價化合物對HEK293-CB2細胞的激動作用。從24 個化合物中初步篩選出5 個對HEK293-CB2 細胞有激動作用的化合物，分別為槲皮素、橙皮素、山柰酚、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯。其中槲皮素和山柰酚對HEK293-CB2 細胞的刺激作用最強，其最小給藥質量濃度（25 μg/mL）已超過HU308 對CB2R 的激動作用。其余3 種化合物的最大給藥質量濃度（100 μg/mL）對CB2R 的激動作用與陽性藥物HU308 相同。因此，選擇槲皮素、橙皮素、山柰酚、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯進行后續分析。

表1 24 個化合物通過雙熒光素酶篩選體系對CB2R 的激活活性 (±s, n = 5)Table 1 CB2R activity of 24 isolated compounds screened using double luciferase screening system (±s, n = 5)

表1 24 個化合物通過雙熒光素酶篩選體系對CB2R 的激活活性 (±s, n = 5)Table 1 CB2R activity of 24 isolated compounds screened using double luciferase screening system (±s, n = 5)

加粗表示有活性；與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1。bold indicates activity; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 ****P < 0.000 1 vs control group.

化合物 劑量 相對熒光素酶發光值（CB2/EGFP） 化合物 劑量 相對熒光素酶發光值（CB2/EGFP） 化合物 劑量 相對熒光素酶發光值（CB2/EGFP）對照 — 30.86±2.73 對照 — 16.75±1.88 對照 — 15.99±1.51 HU308 1 μmol·L?1 89.21±1.77**** HU308 1 μmol·L?1 47.01±1.24**** HU308 1 μmol·L?1 45.49±0.85****山柰酚 25 μg·mL?1 154.62±7.34**** 迷迭香酸 25 μg·mL?1 16.60±0.86 loliolide 25 μg·mL?1 15.27±1.41 50 μg·mL?1 175.40±3.17**** 50 μg·mL?1 15.00±1.37 50 μg·mL?1 15.96±1.42 100 μg·mL?1 254.80±3.47**** 100 μg·mL?1 15.11±1.42 100 μg·mL?1 16.53±1.09對照 — 37.81±1.07 對照 — 33.01±1.20 對照 — 24.43±2.95 HU308 1 μmol·L?1 109.26±1.02**** HU308 1 μmol·L?1 89.43±1.29**** HU308 1 μmol·L?1 68.89±1.44****木犀草苷 25 μg·mL?1 36.55±2.63 對羥基苯甲酸乙酯25 μg·mL?1 36.65±2.00****50 μg·mL?1 34.14±2.29 50 μg·mL?1 93.34±3.35**** 50 μg·mL?1 45.00±2.39****25 μg·mL?1 72.47±3.16**** 對羥基苯甲酸甲酯100 μg·mL?1 34.99±3.60 100 μg·mL?1 122.80±4.55**** 100 μg·mL?1 55.22±0.69****對照 — 27.62±0.77 對照 — 24.61±2.48 對照 — 16.78±1.24 HU308 1 μmol·L?1 78.15±0.70**** HU308 1 μmol·L?1 68.65±1.20**** HU308 1 μmol·L?1 47.02±0.97****銀椴苷 25 μg·mL?1 33.39±3.85*** 水楊酸 25 μg·mL?1 25.96±2.15 ethyl dioxindole- 3-acetate 25 μg·mL?1 17.14±1.09 50 μg·mL?1 29.87±1.16 50 μg·mL?1 25.51±2.25 50 μg·mL?1 19.44±1.24**100 μg·mL?1 27.23±1.68 100 μg·mL?1 29.06±2.04** 100 μg·mL?1 18.06±1.12對照 — 38.03±1.01 對照 — 33.06±1.81 對照 — 19.05±0.82 HU308 1 μmol·L?1 109.17±0.75**** HU308 1 μmol·L?1 96.46±1.26**** HU308 1 μmol·L?1 55.04±0.94****金絲桃苷 25 μg·mL?1 37.04±2.73 沒食子酸 25 μg·mL?1 29.30±1.89** 苦莓苷 F1 25 μg·mL?1 19.18±0.78 50 μg·mL?1 38.98±2.02 50 μg·mL?1 24.30±1.95**** 50 μg·mL?1 19.08±1.22 100 μg·mL?1 38.17±2.61 100 μg·mL?1 16.33±0.76**** 100 μg·mL?1 19.69±1.00對照 — 15.28±1.01 對照 — 27.68±0.76 對照 — 30.15±1.77 HU308 1 μmol·L?1 45.79±1.38**** HU308 1 μmol·L?1 78.11±1.14**** HU308 1 μmol·L?1 87.68±2.13****橙皮素 25 μg·mL?1 23.65±5.13*** 咖啡酸 25 μg·mL?1 29.12±1.68 科羅索酸 25 μg·mL?1 23.65±1.62****50 μg·mL?1 28.14±2.41**** 50 μg·mL?1 30.50±1.89* 50 μg·mL?1 8.17±0.88****100 μg·mL?1 39.70±1.74**** 100 μg·mL?1 30.05±1.12* 100 μg·mL?1 1.76±0.36****對照 — 31.20±1.78 對照 — 39.92±3.66 對照 — 17.61±0.82 HU308 1 μmol·L?1 79.50±1.45**** HU308 1 μmol·L?1 113.13±1.16**** HU308 1 μmol·L?1 49.89±0.85****刺芒柄花素 25 μg·mL?1 21.48±2.37**** 原兒茶酸 25 μg·mL?1 42.26±4.27 委陵菜酸 25 μg·mL?1 16.55±0.52 50 μg·mL?1 11.45±1.25**** 50 μg·mL?1 41.62±1.93 50 μg·mL?1 17.83±1.09 100 μg·mL?1 8.43±1.09**** 100 μg·mL?1 39.82±2.27 100 μg·mL?1 18.40±0.82對照 — 18.73±1.88 對照 — 14.96±0.80 對照 — 19.36±0.82 HU308 1 μmol·L?1 48.58±1.10**** HU308 1 μmol·L?1 45.35±1.65**** HU308 1 μmol·L?1 56.21±1.14****槲皮素 25 μg·mL?1 70.45±4.86**** 鞣花酸 25 μg·mL?1 10.05±0.96**** 山楂酸 25 μg·mL?1 20.64±0.88 50 μg·mL?1 92.79±1.48**** 50 μg·mL?1 12.19±0.79 50 μg·mL?1 14.64±1.06****100 μg·mL?1 111.97±2.15**** 100 μg·mL?1 12.54±2.19 100 μg·mL?1 0.85±0.10****對照 — 36.61±1.09 對照 — 40.08±2.20 對照 — 14.36±1.07 HU308 1 μmol·L?1 116.08±1.40**** HU308 1 μmol·L?1 117.21±0.67**** HU308 1 μmol·L?1 41.46±1.47****對羥基苯甲酸25 μg·mL?1 33.48±1.13* 香草酸 25 μg·mL?1 39.67±1.67 野鴉椿酸 25 μg·mL?1 14.50±1.18 50 μg·mL?1 39.61±1.71** 50 μg·mL?1 36.34±2.76* 50 μg·mL?1 14.49±0.86 100 μg·mL?1 33.34±1.65* 100 μg·mL?1 36.88±1.53**** 100 μg·mL?1 15.10±1.21

通過HEK293-EGFP 陰性細胞進一步驗證以確定5 個化合物是否具有特異性激動CB2R 作用。結果表明，只有橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對HEK293-EGFP 細胞沒有激活作用（圖1-A～E），說明這2 個化合物是通過CB2R 發揮激動作用。

圖1 通過雙熒光素酶篩選的化合物對CB2R 的激動作用 (±s, n = 5)Fig.1 Agonist effect of compounds screened by double luciferase on CB2R (±s, n = 5)

為了進一步篩選出對CB2R 具有特異性激活作用的化合物，將橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯分別與CB2R 抑制劑AM630（1 μmol/L）混合后給予HEK293-CB2 細胞共培養。結果顯示，加入抑制劑 AM630 后，橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對HEK293-CB2 細胞的激活作用完全消失，與對照組相比無統計學差異（圖1-F、G），說明它們對CB2R 的激動作用被AM630 拮抗。進一步表明，橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯通過特異性激活CB2R 發揮作用。

3.3 橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對HEK293-CB2細胞內cAMP 表達水平的影響

G 蛋白偶聯受體偶聯的CB2R 可通過抑制細胞內腺苷酸晚期環化酶的活性來減少cAMP 的產生。如圖1-H～J 所示，橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯組的cAMP 含量隨著藥物濃度的增加而降低，表明這2 個化合物可顯著激動CB2R 并抑制細胞內cAMP 的產生。HU308、橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯的半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為54.19 nmol/L、178 μg/mL 和230.2 μg/mL。

3.4 橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對CB2R 蛋白的影響

給藥組CB2R 蛋白表達明顯高于對照組（圖2-A），與給藥組相比，加入CB2R 特異性抑制劑AM630 可拮抗化合物對CB2R 蛋白的激動，并減弱CB2R 蛋白的表達。此外，對羥基苯甲酸甲酯對CB2R 蛋白的激活作用強于橙皮素。

圖2 篩選的化合物對HEK293-CB2 細胞內CB2R 蛋白的激動水平 (±s , n=3)Fig.2 Activation level of CB2R by selected compounds in HEK293-CB2 cells (±s , n=3)

由于HEK293-CB2 細胞同時也轉染了增強型綠色熒光蛋白（EGFP），它們可通過CB2R 被激活而發出綠色熒光，其熒光強度反映了CB2R 的激活程度。用體視顯微鏡觀察對羥基苯甲酸甲酯和橙皮素對CB2R 的激動作用。結果表明橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯組的熒光強度和發光細胞數均高于對照組（圖2-B）。

3.5 橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯可抑制破骨細胞TRAP 酶活性

如圖3-A 所示，100 μg/mL 的給藥質量濃度對RAW264.7 細胞的活力沒有顯著影響。TRAP 酶是破骨細胞骨吸收的標志物[36]。破骨細胞的細胞核可以通過TRAP 染色進行觀察。如對照組橙色箭頭所示，破骨細胞具有3 個以上的細胞核，這證明RANKL 成功誘導RAW264.7 細胞分化為破骨細胞（圖3-C）。與對照組相比，橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯顯著抑制RANKL 誘導的破骨細胞分化，并且這種抑制作用可被AM630 逆轉（圖3-C）。TRAP 活性測定顯示，橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯顯著抑制破骨細胞的活性，在加入抑制劑AM630 后，破骨細胞TRAP 活性回到正常值（圖3-B）。結果表明，橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對破骨細胞活性的抑制作用依賴于CB2R。

圖3 化合物對來源于RAW264.7 細胞的破骨細胞TRAP 活性及TRAP 染色后AM630 對其活性的逆轉作用 (±s, n = 12)Fig.3 Effects of selected compounds on TRAP activity of osteoclasts derived from RAW264.7 cells and reversal effect of AM630 on osteoclasts based on TRAP staining (±s , n = 12)

3.6 橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯可破壞破骨細胞F-actin 的完整性

F-actin 環不僅是破骨細胞的微管和微絲結構，也是破骨細胞偽足的主要骨架蛋白。如圖4 所示，通過比較在AM640 存在和不存在條件下對破骨細胞F-actin 環的影響，分析對照組破骨細胞的F-actin環為完整的圓形且細胞數量較多。給藥組破骨細胞的F-actin 環面積減少，環破損且環的厚度也減少甚至消失。與給藥組相比，抑制劑組破骨細胞的F-actin 環完整性較好，表明抑制劑AM630 可逆轉橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯對破骨細胞F-actin 環完整性的影響。

圖4 篩選的化合物 (100 μg·mL?1) 對破骨細胞F-actin 環的影響 (±s , n = 5)Fig.4 Effects of selected compounds (100 μg·mL?1) on osteoclasts based on F-actin ring staining (±s , n = 5)

3.7 橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯可抑制破骨細胞的骨吸收

破骨細胞骨吸收是骨質疏松癥發生最主要的原因之一[37-38]。如圖5-A 所示，在對照組的骨切片中觀察到較多的骨吸收陷窩，而在給藥組中觀察到的骨吸收陷窩較少。然而，在加入抑制劑AM630 后，骨片表面形成了更多的骨吸收陷窩。通過Image J 計算骨吸收陷窩的面積，以對照組為定值歸一化處理后結果如圖5-B 所示。結果表明，橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯可通過激活CB2R 而抑制破骨細胞的骨吸收，但這種抑制作用可被AM630 逆轉。

4 討論

本研究從中藥覆盆子醋酸乙酯和二氯甲烷部分中分離鑒定了24 個化合物，其中黃酮類化合物7個、有機酸類化合物7 個、萜類化合物6 個、木脂素類化合物1 個、其他類化合物3 個。篩選鑒定了2 種新的CB2R 激動劑（橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯）可以通過激活CB2R 以增加其蛋白表達，并抑制HEK293-CB2 細胞中cAMP 的積累，并且橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯以CB2R 依賴的方式影響破骨細胞功能的正常發揮（圖6）。

圖6 本研究整體示意圖Fig.6 Graphic abstract of this study

植物來源的大麻素因其高效和低毒成為治療各種慢性病的首選化合物之一[39]。CB2R 的特異性激動劑具有良好的前景，因為它們在骨丟失中發揮著有益的調節作用，并且對中樞神經系統沒有不良反應。成骨細胞和破骨細胞之間的平衡失調是導致骨質疏松發生的主要原因之一。成骨細胞和破骨細胞表面均存在CB2R，當細胞表面的CB2R 被激活時，可以通過調節成骨細胞和破骨細胞之間的平衡來維持正常的骨代謝，從而防止骨質疏松的發生。

基于上述實驗結果，本研究篩選鑒定了2 個新的可特異性激動CB2R 的化合物（橙皮素和對羥基苯甲酸甲酯）。橙皮素屬于二氫黃酮，其主要藥理作用包括抗氧化、抗炎和調血脂作用。現有研究表明，橙皮素可以通過減少破骨細胞的數量和血清中Ⅰ型膠原C 端交聯肽的水平來改善去卵巢小鼠的骨丟失并調節骨代謝[40]。對羥基苯甲酸甲酯主要用作食品和化妝品中的抗菌防腐劑，但其抗骨質疏松作用尚無報道。本研究為以CB2R 為靶點治療骨質疏松的藥物來源提供了參考，并為揭示了掌葉覆盆子的抗骨質疏松作用與其補腎作用的關系提供。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突