留萼木葉中2 個新的萜類化合物

楊長水，張 悅，虞 婕，普智琳，冒浩羽，孔淑靜，徐海榮,2，董小耘,2*

1.揚州大學醫學院（轉化醫學研究院），江蘇 揚州 225009

2.江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室，江蘇 揚州 225009

3.國家中醫藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇 揚州 225009

留萼木Blachiapentzii(Müll.Arg.) Benth.為大戟科留萼木屬BlachiaBaill.植物，該屬約10 種，分布于亞洲熱帶地區，我國有4 種，主要分布于廣東南部和海南，生于山谷、河邊的林下或灌木叢中[1]。具有生物多樣性的大戟科植物[2]，在不同地域氣候環境下產生了化學結構多樣的代謝產物[3-4]，且表現出生物活性多樣性[5]，諸多物種已是常用中藥或藥用植物[6]，特殊生境的大戟科植物資源值得深入研究。鑒于本課題組前期對海南產三寶木屬[7-10]和宿萼木屬[11-12]植物的調查和研究，發現同地域同科近緣屬植物代謝產物類別相似性高[13-14]，尤其在海南高溫、高濕環境下，留萼木或許同近緣的宿萼木一樣，也能產生結構近似及新奇的天然產物[15]，具有開發前景的藥用價值。因此，亟待對該屬植物資源進行全面系統的化學研究，為留萼木屬植物資源的開發利用提供科學依據。

本實驗對海南產留萼木的葉子95%乙醇提取物部位進行了化學成分研究，從中分離鑒定了2 個新的萜類化合物（圖1），分別命名為留萼木素A（blapenin A，1）和3β-乙酰基多花獨尾草-8-烯-17-酸（3β-acetylmultiflora-8-en-17-oic acid，2），分別屬于降倍半萜類和三萜類。細胞活性測試顯示化合物2 對胃癌細胞具有一定的增殖抑制作用。

圖1 化合物1 和2 的化學結構Fig.1 Structures of compounds 1 and 2

1 儀器與材料

AVANCE 600 MHz 型核磁共振儀（德國Bruker公司）；maXis 型超高分辨飛行時間質譜儀（戴安公司）；J-810 型圓二色散光譜儀（日本JASCO 分光公司）；U-3900 型紫外光譜儀（日本SHIMADZU 公司）；IRAffinity-1 型紅外光譜儀（日本SHIMADZU公司）；WZZ-2B 型自動旋光儀（上海精科儀器公司）；LC3000 型半制備高效液相色譜儀（北京創新通恒科技有限公司）；HPLC 色譜柱為YMC-Pack ODS-A（250 mm×10 mm，5 μm）；DHG-9246A 型電熱干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SMZD (III)循環水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；RE 52-99 型旋轉蒸發儀（上海亞榮儀器廠）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司型號）；SW-CJ-1F 型單人雙面超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；ELX800 型全自動酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；5475R 型高速低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；RCO3000T-5-VBC 型CO2培養箱（美國Thermo 公司）；TS100 型倒置生物顯微鏡（日本Nikon 公司）；1300 Series 4'A2 型生物安全柜（美國Thermo 公司）；YC-300L 型醫用冰箱（中科美菱低溫科技有限責任公司）；DW-YL270 型低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責任公司）；平衡鹽溶液PBS（北京欣經科公司）；細胞培養皿（美國Costar 公司）；96 孔板（美國Corning 公司）；RPMI-1640 培養液（北京賽默飛生物化學制品有限公司）；Acutase 酶（美國Gibco 公司）；10%胎牛血清（美國Gibco 公司）；雙抗（青霉素和鏈霉素）（美國HyClone 公司）；CCK-8 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；MTT 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；順鉑（江蘇豪森藥業股份有限公司）；色譜柱（三愛思有限公司）。柱色譜用硅膠（100～200 目，青島海洋化工有限公司）；MCI 填料（75～150 μm，北京元寶山色譜技術有限公司）；反相柱色譜ODS C18填料（40～63 μm，德國Merck 公司生產）；石油醚、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇（國藥集團化學試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。順鉑（批號153593，江蘇豪森藥業股份有限對公司）。

人肺癌A549 細胞、人宮頸癌HeLa 細胞、人肝癌HepG2 細胞、胃癌HGC-27 細胞、胃腺癌AGS細胞和胃粘膜上皮細胞GES 均購于中國科學院上海細胞庫。

留萼木藥材于2019 年3 月采于海南省樂東縣，由中國醫學科學院藥用植物研究所云南分所李海濤副研究員鑒定為留萼木屬植物留萼木B.pentzii(Muell.Arg.) Benth.，標本（CSYBP20190301）存放于揚州大學醫學院藥學系植物標本室。

2 提取與分離

留萼木干燥葉7.0 kg 粉碎后，每次加95%乙醇30 L，浸泡7 d，進行3 次。收集并回收溶劑，干燥后得乙醇提取浸膏450.0 g。用水分散后，分別用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取3 次，得石油醚部位浸膏（A，126.7 g），醋酸乙酯部位浸膏（B，13.7 g），正丁醇部位浸膏（C，23.0 g）。醋酸乙酯萃取部位浸膏B 用硅膠柱色譜法以石油醚-醋酸乙酯混合溶劑（20∶1→10∶1→6∶1→3∶1→1∶1→1∶2）按極性遞增方式進行梯度洗脫，分成10 個組分（Fr.B.1～B.10）。Fr.B.4 通過MCI 柱色譜，用甲醇-水的梯度混合物（3∶7→1∶1→7∶3→1∶0）洗脫，得到6個主要組分（Fr.B.4.1～B.4.6）。Fr.B.4.2 經過半制備HPLC 色譜（乙腈-水2∶8）純化，得到化合物1（3.0 mg，tR＝14 min）。石油醚萃取部位浸膏A 用硅膠柱色譜法以石油醚-醋酸乙酯混合溶劑（100∶0→80 ∶1→50 ∶1→30 ∶1→15 ∶1→8 ∶1→5 ∶1→3∶1→1∶1→0∶1）按極性遞增方式進行梯度洗脫，分成14 個組分（Fr.A.1～A.14）。Fr.A.5 通過硅膠柱色譜，用石油醚-醋酸乙酯（20∶1→10∶1→6∶1→3∶1→1∶1）梯度洗脫，得到8 個主要組分（Fr.A.5.1～A.5.8），Fr.A.5.4 通過MCI 柱色譜，用甲醇-水的梯度混合物（3∶7→1∶1→7∶3→1∶0）洗脫，得到5 個主要組分（Fr.A.5.4.1～A.5.4.5），Fr.A.5.4.1 經過重結晶得到化合物2（12.0 mg）。

3 結構鑒定

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 數據 (600/150 MHz, CD3OD)Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 1(600/150 MHz, CD3OD)

1H-、13C-NMR 結合HSQC 譜圖結果表明化合物1 存在2 個甲基（δC21.9,δC24.0）、4 個亞甲基、2 個次甲基（包括1 個不飽和的次甲基δH5.80，δC127.5）和4 個季碳（包括1 個季烯碳δC165.4 和2個羰基碳δC179.5, 200.5）。HMBC 信號表明，季烯碳（δC165.4）和次甲基（δH5.80;δC127.5）構成1對雙鍵，上述基團已占據3 個不飽和度，分子結構還存在2 個環。

在HMBC 譜圖（圖2）中，存在從H-4 到C-3，從H-5 到C-1 和C-3，從H-2 到C-4 和C-6，從11-Me 到C-1、C-2、C-6 的相關信號；結合1H-1H COSY 譜圖，存在H-4/H-5，H-5/H-6 的相關信號，同時在1H-NMR 中，H-2（δH5.80, s）單峰信號的存在表明H-2 不存在偶合體系，說明存在1 個在C-1有甲基取代，C-3 有羰基取代的六元環A。1H-1H COSY 譜圖同樣存在1 個H-8/H-9 相關，結合HMBC譜圖中，H-8 與C-7、C-9、C-10 相關；H-9 與C-7、C-10 相關；12-Me 分別與C-7、C-8 相關，共同組成五元內酯環B，且C-7 上存在甲基取代。再根據HMBC 譜圖，H-8 與C-4 相關；H-4 與C-7、12-Me相關；說明環A 和環B 通過C-4 和C-7 相連。至此，化合物1 的平面結構由此確立。

圖2 化合物1 的主要HMBC、COSY 和NOESY 相關Fig.2 Key HMBC, COSY and NOESY correlations of compound 1

在NOESY 譜圖中，以H-4 (δH2.79)為β 相對構型。H-4/H-5β 信號強烈，也為β 構型。12-Me/H-5α 的相關表明12-Me 為α 構型。12-Me 與H-4 沒有相關。因此1 的相對構型為4S*, 7R*。接下來，應用電子圓二色譜（electronic circular dichroism，ECD）解決化合物1 的絕對構型。采用量子化學軟件Gaussion 09[16]計算化合物的ECD，并通過SpecDis 1.71[17]進行擬合。通過MMFF94 分子力場搜索構象，使用密度泛函理論計算（density functional theory，DFT）在b3lyp/6-31 g (d) 計算水平上以SMD溶劑模型進一步優化。經實驗與計算ECD 比較（圖3），與4S, 7R構型的CD 曲線一致，可確定化合物1 的立體構型為4S, 7R，通過SciFinder 庫檢索為新化合物，命名為留萼木素A（blapenin A），是沒藥烷型（bisabolane）倍半萜的11, 12, 13 三降衍生物（圖4）。

圖3 化合物1 的ECD 譜圖Fig.3 ECD spectra of compound 1

圖4 化合物1 的生源途徑Fig.4 Biogenic pathway of compound 1

根據沒藥烷型倍半萜骨架及取代情況，對其生源關系推導（圖4）：以化合物i 作為其前體，3-OH及7-OH 取代是常見現象，通過3-OH 發生氧化變為羰基，經C-10 和C-11 雙鍵位置發生水加成，生成中間體ii，其7-OH 和10-OH 發生脫水環合，得到中間體iii，隨后C-9 和C-10 雙鍵位置再發生水加成，得到10-OH 取代產物iv，其具有環內與環外鏈上的鄰位雙羥基結構特點，根據醇裂解反應機理[18]，可發生降碳反應，最終得到留萼木素A（1）的結構。

表2 化合物2 的1H-NMR 和13C-NMR 數據 (600/150 MHz, CDCl3)Table 2 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 2 (600/150 MHz, CDCl3)

通過與文獻數據對比，2 與化合物 3βhydroxymultiflora-8-en-17-oic acid[19]核磁數據高度相似，僅多1 個乙酰基信號 (δC171.2, 21.5;δH2.05,3H, s)。進一步通過1H-1H COSY 和HMBC 譜相關信號解析（圖5），除了乙酰基，其他位置連接一致。如，存在H-1 與H-2、H-2 與H-3、H-6 與H-7、H-11 與H-12、H-15 與H-16、H-18 與H-19、H-11 與H-22 的1H-1H COSY 相關信號；在HMBC 譜中，30-Me (δH1.00 s) 到C-19 (δC35.3)，C-20 (δC28.7)；從29-Me (δH0.94 s) 到C-20 (δC28.7)，C-21 (δC35.0)的相關信號，說明C-20 處存在偕二甲基；從H-16(δH2.25, dd,J= 9.0, 3.0 Hz) 和H-18 (δH2.32, dd,J=4.2, 12.0 Hz) 到28-COOH (δC183.0) 的信號說明28-COOH 與C-17 相連。NOESY 譜中，以H-3 (δH4.49)和23-CH3為α 相對構型，存在關鍵的H-3/23-CH3，23-CH3/H-5，H-3/H-5，25-CH3/H-11β，H-18/30-CH3，H-18/CH3-26 等相關信號（圖5），則H-3、H-5 均為α構型，H-18、25-CH3、26-CH3均為β 構型，對比化合物3β-hydroxymultiflora-8-en-17-oic acid 構型，比旋光方向一致，可確定化合物2 具有與其一致的相對構型。最終化合物2 的結構及構型見圖5，經SciFinder庫檢索為新化合物，因結構也同isomultiflorenylacetate[20]高度相似，僅在28 位的甲基氧化為羧基，故將化合物2 命名為3β-乙酰基多花獨尾草-8 烯-17 酸。

圖5 化合物2 的關鍵HMBC、COSY、NOESY 相關Fig.5 Key HMBC, COSY and NOESY correlations of compound 2

4 細胞毒實驗

4.1 部位浸膏及新化合物對A549、HeLa 和HepG2的細胞毒活性

根據課題組前期研究[10]，采用CCK-8 法分別測定化合物1 和2 和各萃取部位浸膏對A549 細胞、HeLa 細胞和HepG2 細胞的細胞毒活性，順鉑為陽性藥。結果醋酸乙酯部位浸膏對3 種腫瘤細胞的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值分別為（21.37±1.98）、（22.91±0.33）、（22.14±4.95）μg/mL，石油醚部位部位浸膏的IC50大于50 μg/mL，95%乙醇總提取物的IC50大于100 μg/mL；化合物1和2 對3 種腫瘤細胞的IC50值均大于40 μmol/L；順鉑對3 種腫瘤細胞的IC50值分別為（11.15±1.01）、（16.95±1.44）、（16.95±1.44）μmol/L。

4.2 新化合物對胃癌細胞的細胞毒活性

所得個別化合物活性測試結果不能代表整體浸膏活性。由于所選細胞株對測試結果存在差異性，為了進一步尋找可能的藥效物質，另采用MTT 法又分別測定化合物1 和2 對胃癌細胞HGC-27、AGS的細胞毒活性，并對比胃正常細胞GES，順鉑為陽性藥。發現化合物2 在80 μmol/L 對2 種胃癌細胞HGC-27、AGS 抑制率分別達到81.9%和89.2%，而對胃正常細胞GES 基本無影響，抑制率僅為14.4%，相對安全，值得后期深入開展機制探索研究。

5 討論

本實驗從海南產的留萼木屬植物留萼木的葉子中分離鑒定了2 個新的萜類化合物，分別為留萼木素A（1）和3β-乙酰基多花獨尾草-8-烯-17-酸（2），分別屬于降倍半萜類和三萜類。生物活性測試顯示醋酸乙酯萃取部位對幾種腫瘤細胞具有較好的細胞毒性，化合物2 對胃癌細胞具有一定的增殖抑制作用，表明該植物含有具有潛在抗腫瘤活性成分，后期可對其開展深入化學及生物學研究，為新藥研發提供新分子實體。根據大戟科植物親緣關系和化學分類學，本屬植物值得引起關注，并進行深入系統地研究，為留萼木屬植物資源綜合開發利用奠定前期物質基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突