窩兒七的化學(xué)成分研究

白紅云，趙 晨，孫彥君,3*，弓建紅，陳 輝，李 孟，馮衛(wèi)生,3

1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 鄭州 450046

2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 河南 鄭州 450046

3.河南省中藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)中心, 河南 鄭州 450046

窩兒七為小檗科（Berberidaceae）多年生草本植物中華山荷葉DiphylleiasinensisLi.的干燥根及根莖[1]。主要分布于湖北、陜西、甘肅、四川和云南等省。味苦、辛，性平，有毒。具有祛風(fēng)除濕、活血祛瘀、解毒等功效。主要用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、小腹疼痛、毒蛇咬傷、癰腫瘡疔等癥狀[2]。化學(xué)成分研究表明，窩兒七中含有木脂素、黃酮、甾體、有機(jī)酸、糖等類型化合物。現(xiàn)代藥理活性研究表明，窩兒七具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、殺蟲(chóng)等[3]重要藥理作用。本研究為闡明窩兒七藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)成分研究，并測(cè)試部分化合物對(duì)DPPH 自由基的清除能力。本課題組從窩兒七95%乙醇和50%乙醇提取物中共分離得到21 個(gè)化合物，分別鑒定為 [4,5-二羥基-2-(1-羥基乙基)苯基][(4-羥基)苯基]甲酮（[4,5-dihydroxy-2-(1-hydroxyethyl)phenyl][(4-hydroxy)phenyl]methanone，1）、(＋)-7′-甲氧基落葉松樹(shù)脂醇[（＋）-7′-methoxylariciresinol，2]、7′R-羥基落葉松樹(shù)脂醇（7′Rhydroxylariciresinol，3）、3-甲氧基槲皮素（3-methoxy-quercetin，4）、二氫槲皮素（dihydroquercetin，5）、二氫山柰酚（dihydrokaempferol，6）、山柰酚（kaempferol，7）、槲皮素（quercetin，8）、podoverine B（9）、大黃酚-1-O-β-D-葡萄糖苷（chrysophanol-1-O-β-D-glucopyranoside，10）、大黃酚-8-O-β-D- 葡萄糖苷（ chrysophanol-8-O-β-Dglucopyranoside，11）、尿嘧啶（uracil，12）、胸腺嘧啶核苷（thymidine，13）、uridine-5′α-hydroxypropanoate（14）、對(duì)甲氧基苯甲醛（p-anisaldehyde，15）、對(duì)羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid，16）、香草醛（vanillin，17）、3,4-二羥基苯甲酸（3,4-dihydroxybenzoic acid，18）、羥基酪醇（hydroxytyrosol，19）、3′,5′-二羥基苯基-4-羥基苯甲酸酯（3′,5′-dihydroxyphenyl-4-hydroxybenzoate，20）、5-羥甲基糠醛（5-hydromethyl furaldehyde，21）。其中化合物1 對(duì)DPPH 自由基具有較強(qiáng)的清除能力，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）為8.52 μmol/L，且強(qiáng)于陽(yáng)性藥物水溶性維生素E（trolox，14.95 μmol/L）。化合物4 對(duì)DPPH 自由基具有一定的清除能力，IC50值為22.69 μmol/L。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE Ⅲ 500 型核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；Bruker maxis HD 型飛行時(shí)間質(zhì)譜（德國(guó)Bruker 公司）；Thermo EVO 300 型紫外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Thermo Nicolet IS 10 型紅外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；制備型高效液相色譜儀（北京賽譜銳思科技有限公司）；N-1000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；SHB-B95A 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DFZ-3 型真空干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）；大孔吸附樹(shù)脂AB-8；薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech 公司）；MCI Gel CHP-20（日本三菱化學(xué)）；YMC-Pack ODS-A 色譜柱（日本YMC 有限公司，250 mm×10 mm，5 μm）；甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；其他試劑均為分析級(jí)。

陽(yáng)性對(duì)照藥物trolox（貨號(hào)238813，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，Sigma 公司）。窩兒七藥材于2019 年7 月采集于四川省，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為山荷葉屬植物中華山荷葉D.sinensisLi.的干燥根莖。憑證樣品（DS 20190728）存放于河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。

2 提取與分離

干燥的窩兒七根莖（40 kg），用95%乙醇、50%乙醇各回流提取3 次，每次2 h，濃縮得到浸膏（5.2 kg）。總提物用甲醇溶解，按1∶2 的比例分散在硅藻土中，經(jīng)不同極性的有機(jī)溶劑洗脫，得二氯甲烷部位（1 942 g）、醋酸乙酯部位（690 g）、甲醇部位（1 808 g）。

甲醇部位（1 808 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇（100∶0、100∶1、100∶3、100∶5、100∶7、100∶10、100∶30、100∶50、0∶100）洗脫，得到Fr.M1～M7。Fr.M2（1.2 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，甲醇洗脫，得到化合物7（50.6 mg）與8（60.3 mg）。Fr.M4（117.5 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，甲醇洗脫，得到Fr.M4-1～M4-3。Fr.M4-2（39.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇（100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、3∶1）洗脫，得到Fr.M4-2-1～M4-2-3。Fr.M4-2-2（4.6 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（53∶47，6 mL/min）洗脫，得到Fr.M4-2-2-1（1.8 g，tR＝8.8～10.3 min），再經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（15∶85，6 mL/min）洗脫，得到化合物21（6.5 mg，tR＝22.0 min）、14（5 mg，tR＝30.7 min）。Fr.M5（120.6 g）經(jīng)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂，乙醇-水（0%、10%、30%、50%、60%、70%、90%）洗脫，得到Fr.M5-1～M5-4。Fr.M5-2（32.8 g）經(jīng)MCI 柱色譜，甲醇-水（10%、30%、50%、70%）洗脫，得到Fr.M5-2-1～M5-2-3，F(xiàn)r.M5-2-2（3.5 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（50∶50，6 mL/min）洗脫，得到化合物2（30.0 mg，tR＝22.0 min）、3（5.0 mg，tR＝10.8 min）。Fr.M5-3（27.1 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，甲醇洗脫，得到Fr.M5-3-1～M5-3-3。Fr.M5-3-2（3.9 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（58∶42，6 mL/min）洗脫，得到化合物15（4.4 mg，tR＝19.9 min）。

醋酸乙酯部位（690 g），經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇（100∶0、100∶1、100∶3、100∶5、100∶7、100∶10、100∶30、100∶50、100∶100）洗脫，得到Fr.E1～E5。Fr.E2（55.7 g）析出白色粉末，經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶，得到化合物17（10.0 mg）。Fr.E3（100.6 g）經(jīng)ODS 柱色譜，甲醇-水（10%、30%、50%、70%）洗脫，得到 Fr.E3-1～E3-3。Fr.E3-1（42.9 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，甲醇洗脫，得到Fr.E3-1-1～E3-1-3。Fr.E3-1-1（25.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次石油醚-醋酸乙酯（100∶3、100∶5、100∶7、100∶10、100∶30、100∶50、100∶100、0∶100）洗脫，得到Fr.E3-1-1-1～E3-1-1-5。Fr.E3-1-1-3（4.9 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次石油醚-醋酸乙酯（100∶3、100∶5、100∶7、100∶10、100∶30、100∶50、100∶100、0∶100）洗脫，得到 Fr.E3-1-1-3-1～E3-1-1-3-8，F(xiàn)r.E3-1-1-3-2（1.2 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（40∶60，6 mL/min）洗脫，得到化合物18（8 mg，tR＝12.9 min）、19（3 mg，tR＝12.4 min）；Fr.E3-1-1-3-5（0.5 g）中沉淀與母液分離，沉淀用甲醇反復(fù)洗滌，得到化合物12（5 mg）；Fr.E3-1-1-3-7（0.7 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（10∶90，6 mL/min）洗脫，得到化合物13（5 mg，tR＝38.3 min）。Fr.E3-1-1-3-4（0.7 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（30∶70，6 mL/min）洗脫，得到化合物1（5 mg，tR＝39.9 min）。Fr.E3-1-2（8.6 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-醋酸乙酯（100∶3、100∶5、100∶7、100∶10、100∶30、100∶50、100∶100、0∶100）洗脫，得到Fr.E3-1-2-1～E3-1-2-6，F(xiàn)r.E3-1-2-3（1.2 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（66∶34，3 mL/min）洗脫，得到化合物5（3 mg，tR＝10.7 min）、20（3 mg，tR＝11.2 min）、6（2.8 mg，tR＝12.1 min）。組分Fr.E3-2（25.3 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱分離，甲醇洗脫，得到Fr.E3-2-1～E3-2-3，F(xiàn)r.E3-2-2（1.8 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（45∶55，3 mL/min）洗脫，得到化合物16（10 mg，tR＝15.8 min）。組分Fr.E3-3（24.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-醋酸乙酯（100∶3、100∶5、100∶7、100∶10、100∶30、100∶50、100∶100），得到Fr.E3-3-1～E3-3-7。Fr.E3-3-4（5.5 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，甲醇洗脫，得到Fr.E3-3-4-1～E3-3-4-6。Fr.E3-3-4-2（1.7 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（70∶30，6 mL/min）洗脫，得到化合物9（6 mg，tR＝21.8 min）。Fr.E3-3-4-6（0.8 g）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（70∶30，6 mL/min）洗脫，得到化合物4（3.5 mg，tR＝28.7 min）。Fr.E3-3-5（2.8 g）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，甲醇洗脫，得到Fr.E3-3-5-1～E3-3-5-7。Fr.E3-3-5-3（95.8 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜，甲醇-水（62∶38，3 mL/min）洗脫，得到化合物10（3.0 mg，tR＝16.4 min）、11（3.2 mg，tR＝17.5 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：棕紅色粉末。UV 顯示最大吸收波長(zhǎng)為194、202、286 nm。IR 光譜顯示有羥基（3 264 cm?1）、羰基（1 639 cm?1）和苯環(huán)（1 589, 1 513 cm?1）的吸收。HR-ESI-MS 譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z275.091 8 [M＋H]+,（計(jì)算值為275.091 9），確定化合物1 的分子式為C15H14O5。1H-NMR 譜中（表1），顯示6 個(gè)芳?xì)湫盘?hào) [δH7.57 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2′,H-6′), 6.84 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3′, H-5′), 6.72 (1H, s,H-6), 6.63 (1H, s, H-3)]，2 個(gè)亞甲基（包括1 個(gè)氧代亞甲基）[δH2.60 (2H, t,J= 7.3 Hz, H-7), 3.41 (2H, t,J= 7.3 Hz, H-8)]。13C-NMR 和HSQC 譜顯示15 個(gè)碳信號(hào)，包括1 個(gè)酮羰基δC195.5 (C-7′)，12 個(gè)芳香碳，2 個(gè)亞甲基碳信號(hào)（包括1 個(gè)氧代亞甲基）[δC35.9 (C-7), 62.5 (C-8)]。1H-1H COSY 譜中（圖1），顯示δH2.60 (H-7) 和δH3.41 (H-8) 相關(guān)，說(shuō)明H-7與H-8 相連。δH7.57 (H-2′, 6′) 和δH6.84 (H-3′, 5′)相關(guān)，說(shuō)明化合物1 的結(jié)構(gòu)中存在對(duì)二取代苯環(huán)。HMBC 譜中（圖1），由亞甲基δH2.60 (H-7) 與δC129.7 (C-1), 129.8 (C-2), 118.0 (C-6) 的遠(yuǎn)程相關(guān)，結(jié)合芳?xì)湫盘?hào)δH6.72 (H-6), 6.63 (H-3) 與C-1、C-2 以及與2 個(gè)鄰位含氧芳香碳δC142.4 (C-4), 147.0 (C-5)的遠(yuǎn)程相關(guān)，表明化合物1 含有4,5-二羥基-2-(1-羥基乙基)苯基結(jié)構(gòu)片段。由對(duì)二取代苯環(huán)上氫信號(hào)δH7.57 (H-2′, 6′)，4,5-二羥基-2-(1-羥基乙基)苯基上芳香氫信號(hào)6.63 (H-3) 均與羰基碳信號(hào)δC195.5 (C-7′)的HMBC 相關(guān)，由此提示2 個(gè)結(jié)構(gòu)片段通過(guò)酮羰基(C-7′) 連接。因此，化合物1 鑒定為 [4,5-二羥基-2-(1-羥基乙基)苯基][(4-羥基)苯基]甲酮，為1 個(gè)新化合物，命名為山荷葉甲酮A（diphymethanone A）。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖1 化合物1 和20 的關(guān)鍵1H-1H COSY () 和HMBC () 相關(guān)Fig.1 Key 1H-1H COSY () and HMBC ()correlations of compounds 1 and 20

圖2 化合物1 和20 的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of compounds 1 and 20

表1 化合物1 和20 的核磁數(shù)據(jù) (500/125 MHz)Table 1 NMR Spectroscopic data of compounds 1 and 20 (500/125 MHz)

化合物20：黃色油狀物。UV 顯示最大吸收波長(zhǎng)為202、217、262 nm。IR 光譜顯示有羥基（3 377 cm?1）、羰基（1 712 cm?1）和苯環(huán)（1 607, 1 514 cm?1）的吸收。HR-ESI-MS 譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z269.041 8 [M＋Na]+,（計(jì)算值為269.042 6），確定化合物20 的分子式為C13H10O5。1H-NMR 譜中（表1），顯示1 個(gè)二取代苯環(huán) [δH7.99 (2H, d,J= 8.7 Hz,H-2, 6), 6.88 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5)]，1 個(gè)三取代苯環(huán) [δH6.12 (2H, d,J= 2.1 Hz, H-2′, 6′), 6.18 (1H,dd,J= 2.1, 2.1 Hz, H-4′)]。13C-NMR 和HSQC 譜顯示13 個(gè)碳信號(hào)，包括1 個(gè)酯羰基δC166.6 (C-7)，12個(gè)芳香碳。1H-1H COSY 譜中（圖1），顯示δH7.99(H-2, H-6) 和δH6.88 (H-3, H-5) 相關(guān)，說(shuō)明化合物20 的結(jié)構(gòu)中存在對(duì)二取代苯環(huán)。HMBC 譜中（圖1），由H-2, H-6 與C-7 的遠(yuǎn)程相關(guān)，以及H-3, H-5與δC164.2 (C-4) 的遠(yuǎn)程相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道[4]中對(duì)羥基苯甲酸核磁數(shù)據(jù)對(duì)比基本一致，表明化合物20 含有對(duì)羥基苯甲酸結(jié)構(gòu)片段。H-2′, H-4′以及H-6′的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[5]中的間苯三酚5.67 (3H, s, H-2,4, 6) 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)位移明顯增大，且δC101.6(C-2′, 6′) 為1 組化學(xué)等價(jià)芳環(huán)碳信號(hào)，證明δC154.0(C-1′) 上的OH 被取代。由此表明化合物含有3,5-二羥基-1-苯基結(jié)構(gòu)片段，且2 個(gè)結(jié)構(gòu)片段通過(guò)酯羰基 (C-7) 連接。故鑒定化合物 20 為 3′,5′-dihydroxyphenyl-4-hydroxybenzoate，為新天然產(chǎn)物。經(jīng)查閱文獻(xiàn)無(wú)核磁數(shù)據(jù)，首次對(duì)化合物20 的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬。

化合物4：黃色油狀物。ESI-MSm/z: 339 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.54 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2′), 7.44 (1H, dd,J= 8.5, 2.2 Hz, H-6′),6.90 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 6.41 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 6.19 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6), 3.78 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 177.9 (C-4), 164.1 (C-7), 161.3 (C-5), 156.3 (C-9), 155.6 (C-2),148.7 (C-4′), 145.2 (C-3′), 137.7 (C-3), 120.8 (C-1′),120.6 (C-6′), 115.7 (C-5′), 115.4 (C-2′), 104.2 (C-10),98.5 (C-6), 93.6 (C-8), 59.7 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，故鑒定化合物4 為3-甲氧基槲皮素。

化合物5：淡黃色粉末。ESI-MSm/z: 327 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 6.96 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2′), 6.84 (1H, dd,J= 8.1, 1.8 Hz, H-6′),6.80 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5′), 5.92 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 5.88 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-6), 4.91 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-2), 4.49 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，故鑒定化合物5 為二氫槲皮素。

化合物6：淡黃色粉末。ESI-MSm/z: 311 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.56 (1H, s,-OH), 7.31 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2′, 6′), 6.78 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-3′, 5′), 5.91 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 5.85(1H, d,J= 2.0 Hz, H-6), 5.04 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-2), 4.58 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，故鑒定化合物6 為二氫山柰酚。

化合物7：黃色粉末。ESI-MSm/z: 309 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.03 (2H, d,J= 8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.85 (2H, d,J= 8.9 Hz, H-3′, 5′),6.41 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故鑒定化合物7 為山柰酚。

化合物8：黃色粉末。ESI-MSm/z: 325 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.50 (1H, s,-OH), 7.65 (1H, s, H-2′), 7.50 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-6′),6.83 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-5′), 6.41 (1H, s, H-8), 6.20(1H, s, H-6)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 176.2(C-4), 164.4 (C-7), 161.4 (C-5), 157.1 (C-9), 147.4 (C-4′), 146.8 (C-2), 144.9 (C-3′), 136.0 (C-3), 122.9 (C-1′),120.4 (C-6′), 114.9 (C-5′), 114.6 (C-2′), 103.3 (C-10),98.0 (C-6), 93.1 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故鑒定化合物8 為槲皮素。

化合物10：黃色粉末。ESI-MSm/z: 439 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.94 (1H, s,-OH), 7.75 (1H, t,J= 7.5 Hz, H-6), 7.72 (1H, s, H-4),7.66 (1H, dd,J= 7.5, 1.0 Hz, H-5), 7.54 (1H, s, H-2),7.36 (1H, dd,J= 7.5, 1.0 Hz, H-7), 5.17 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-1′), 4.58～3.24 (6H, m, sugar-H), 2.48 (3H, s,-CH3)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 187.7 (C-9), 182.2 (C-10), 161.4 (C-8), 158.4 (C-1), 147.4 (C-3),136.2 (C-6), 134.5 (C-4a), 132.5 (C-10a), 124.3 (C-7),122.7 (C-2), 121.3 (C-4), 118.3 (C-5, 9a), 116.8 (C-8a),100.5 (C-1′), 77.3 (C-5′), 76.6 (C-3′), 73.4 (C-2′), 69.6(C-4′), 60.6 (C-6′), 21.8 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定化合物10 為大黃酚-1-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物11：黃色粉末。ESI-MSm/z: 439 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.88 (1H, s,-OH), 7.88 (1H, dd,J= 7.6, 2.6 Hz, H-5), 7.86 (1H, dd,J= 8.1, 7.6 Hz, H-6), 7.71 (1H, dd,J= 8.1, 2.6 Hz, H-7), 7.51 (1H, s, H-4), 7.21 (1H, s, H-2), 5.16 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-1′), 3.72～3.22 (6H, m, sugar-H), 2.43(3H, s, -CH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ:187.6 (C-9), 182.1 (C-10), 161.6 (C-1), 158.2 (C-8),147.7 (C-3), 136.0 (C-6), 134.8 (C-10a), 132.2 (C-4a),124.1 (C-2), 122.5 (C-7, 8a), 120.6 (C-5), 119.4 (C-4),114.8 (C-9a), 100.5 (C-1′), 77.3 (C-5′), 76.6 (C-3′), 73.3(C-2′), 69.5 (C-4′), 60.6 (C-6′), 21.5 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物11 為大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物12：黃色粉末。ESI-MSm/z: 135 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 11.0 (1H, s,H-3), 10.8 (1H, s, H-1), 7.38 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-6),5.44 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-5)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 164.4 (C-4), 151.6 (C-2), 142.2 (C-6),100.3 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物12 為尿嘧啶。

化合物13：白色粉末。ESI-MSm/z: 265 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.82 (1H, s, H-4), 6.28 (1H, t,J= 6.8 Hz, H-1′), 4.40 (1H, m, H-3′),3.90 (1H, d,J= 3.3 Hz, H-4′), 3.80 (1H, dd,J=12.0,3.7 Hz, H-5′b), 3.73 (1H, dd,J=12.0, 3.7 Hz, H-5′a),2.22 (2H, m, H-2′), 1.94 (3H, s, -CH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 166.4 (C-2), 152.4 (C-6), 138.2 (C-4), 111.5 (C-3), 88.8 (C-4′), 86.2 (C-1′), 72.2 (C-3′),62.8 (C-5′), 41.2 (C-2′), 12.4 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定化合物13 為胸腺嘧啶核苷。

化合物15：白色粉末。ESI-MSm/z: 159 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 9.76 (1H, s,CHO), 7.72 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5), 6.82 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, 6′), 2.62 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 191.2 (C-7), 166.9 (C-1),133.0 (C-3, 5), 129.9 (C-4), 114.9 (C-6, 2), 55.6 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，故鑒定化合物15 為對(duì)甲氧基苯甲醛。

化合物16：白色晶體（甲醇）。mp 213.4～215.2 ℃，ESI-MSm/z: 161 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.88 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2, 6),6.82 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 167.7 (COOH), 161.4 (C-4), 131.6 (C-2,6), 122.1 (C-1), 115.0 (C-3, 5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，故鑒定化合物16 為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物17：白色晶體（甲醇）。mp 79.8～81.2 ℃，ESI-MSm/z: 175 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 9.70 (1H, s, -CHO), 7.37 (1H, dd,J= 8.7, 1.9 Hz, H-2), 7.26 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-6), 6.84(1H, d,J= 8.7 Hz, H-5), 3.80 (3H, s, -OCH3)；13CNMR (125 MHz, CD3OD)δ: 192.5 (C-7), 154.9 (C-4),149.6 (C-3), 130.1 (C-1), 127.9 (C-6), 116.1 (C-5),111.0 (C-2), 56.0 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，故鑒定化合物17 為香草醛。

化合物18：灰黑色晶體（甲醇）。mp 200.2～201.1 ℃，ESI-MSm/z: 177 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.37 (1H, s, H-6), 7.34 (1H, d,J=8.3 Hz, H-2), 6.81 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5)；13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 168.2 (COOH), 150.8 (C-4),145.8 (C-3), 122.5 (C-1, 6), 117.3 (C-2), 115.8 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]，故鑒定化合物18 為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物19：灰黑色晶體（甲醇）。mp 171.3～175.1 ℃，ESI-MSm/z: 177 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 6.58 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-7), 6.55(1H, d,J= 1.9 Hz, H-4), 6.42 (1H, dd,J= 8.0, 1.9 Hz,H-8), 3.57 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-1), 2.56 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-2)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 145.0 (C-5), 143.7 (C-6), 130.5 (C-3), 119.8 (C-8), 116.7 (C-4),115.8 (C-7), 62.9 (C-1), 38.6 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，故鑒定化合物19 為羥基酪醇。

化合物21：黃色油狀物。ESI-MSm/z: 149 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 9.55 (1H, s,-CHO), 7.50 (1H, d,J= 3.5 Hz, H-2), 6.61 (1H, d,J=3.5 Hz, H-3), 4.51 (2H, d,J= 5.2 Hz, H-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]，故鑒定化合物21 為5-羥甲基糠醛。

4 DPPH 自由基清除活性

通過(guò)DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)[24]，對(duì)化合物1、4、10、11、20 的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。將不同濃度樣品與DPPH（終濃度為100 μmol/L）混合反應(yīng)，設(shè)定3 個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不含藥物的空白對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照（trolox），30 ℃、1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A）值，檢測(cè)波長(zhǎng)為515 nm。待測(cè)化合物對(duì)DPPH自由基清除活性的IC50值采用Reed-Muench 方法計(jì)算。結(jié)果顯示，化合物1 對(duì)DPPH 自由基具有較強(qiáng)的清除能力且強(qiáng)于陽(yáng)性藥 trolox（IC5014.95 μmol/L），IC50值為8.52 μmol/L，化合物4 對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，IC50值為 22.69 μmol/L，其余化合物IC50值均大于50 μmol/L。

5 討論

本研究從窩兒七甲醇和醋酸乙酯部位中分離鑒定了21 個(gè)化合物，包括2 個(gè)木脂素類成分（2、3）、6 個(gè)黃酮類（4～9）、2 個(gè)蒽醌類（10、11）、3 個(gè)生物堿類（12～14）、7 個(gè)酚酸類（15～21）。其中化合物1 為新化合物，命名為山荷葉甲酮A。化合物20為新天然產(chǎn)物，其氫譜和碳譜數(shù)據(jù)為首次報(bào)道。化合物2、3、5、6、9～11、13、14、17 和19～21 為首次從山荷葉屬植物中分離得到。首次從該屬植物中發(fā)現(xiàn)了生物堿類和蒽醌類化合物的存在，證實(shí)了窩兒七藥材化學(xué)成分類型的多樣性。采用DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)，測(cè)試化合物1、4、10、11、20 的抗氧化活性。結(jié)果顯示，化合物1 對(duì)DPPH 自由基具有較強(qiáng)的清除能力，化合物4 對(duì)DPPH 自由基具有一定的清除能力。綜上，本研究結(jié)果豐富了窩兒七的化學(xué)成分，也為窩兒七的抗氧化活性研究提供了參考和依據(jù)。

窩兒七常被用作民間草藥，療效確切，藥理作用廣泛，其中抗腫瘤研究已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。前期文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，窩兒七含有的木脂素類化合物和雙黃酮類化合物可能是發(fā)揮抗腫瘤作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以鬼臼毒素為代表的芳基萘內(nèi)酯型木脂素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用[25]，四氫呋喃型木脂素 (＋)-7′-甲氧基落葉松樹(shù)脂醇（2）對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒活性[6]，IC50值為32.2 μmol/L，含有的異戊烯基化雙黃酮類化合物podoverine B（9）對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性[26]，IC50值為26.5 μmol/L。截至目前，窩兒七抗腫瘤活性物質(zhì)的研究主要集中于芳基萘內(nèi)酯型木脂素類化合物，而其中的雙黃酮類化合物結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，是否與木脂素類化合物協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用，有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突