龍膽苦苷腹腔注射對單側輸尿管梗阻小鼠腎間質纖維化的改善作用及其機制

彭炳鴻，曾琪，譚睿陟，粟宏偉，劉建，4

1 西南醫科大學附屬醫院腎病內科，四川瀘州 646000；2 西南醫科大學附屬中醫醫院中西醫結合研究中心；3 西南醫科大學附屬中醫醫院泌尿外科；4 西南醫科大學附屬中醫醫院腎病內科

慢性腎臟病（CKD）的發病率和病死率逐年遞增，最新報道顯示，我國成人CKD患病率為8.2%［1］。目前對于終末期CKD 尚缺乏有效的治療措施，因此急需尋找新的藥物以延緩CKD 進展。腎間質纖維化既是終末期腎病的典型共同病理改變，又是決定慢性腎臟病進程的關鍵因素，因此延緩腎間質纖維化對CKD的治療具有重要意義。龍膽苦苷（GPS）是從龍膽科植物中提取的裂環烯醚萜苷類化合物，具有抗炎鎮痛、抗氧化應激和清除自由基等作用，對肺纖維化、肝纖維化、腹膜纖維化等纖維化疾病有較好的治療效果［2-5］，但其對腎間質纖維化的作用和機制仍不清楚。2023年2月—7月，我們對單側輸尿管梗阻（UUO）小鼠給予GPS 進行干預，觀察小鼠腎間質纖維化的改善情況，并探討其可能的作用機制，旨在為后續藥物研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠31只，6～8周齡，體質量22～25 g，由成都藥康生物科技有限公司提供。飼養環境相對濕度50%～60%、溫度20～22 ℃，12 h/12 h 晝夜循環，自由攝食、飲水。本實驗經西南醫科大學實驗動物倫理委員會審批通過（批號：swmu20230038）。

1.1.2 藥品、試劑與儀器 GPS（成都德思特生物技術有限公司）；厄貝沙坦（法國賽諾菲公司）。Masson染色試劑盒（珠海貝索生物技術有限公司）；HE染色試劑盒（上海碧云天科技有限公司）；α-SMA 單克隆抗體（德國CST 公司）；Fn 多克隆抗體（美國Abcam公司）；GAPDH 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。酶標儀（Synergy2 型，美國Bio-Tek 公司）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；PCR 儀（LightCycler480Ⅱ型，瑞士Roche 公司）；生物顯微鏡（DM500型，日本Olympus公司）。

1.2 GPS對UUO小鼠腎間質纖維化的作用觀察

1.2.1 動物分組與模型制備 取25 只小鼠，隨機分為假手術組、模型對照組、GPS 低劑量組、GPS 高劑量組、厄貝沙坦組，每組各5只。采用結扎單側輸尿管的方式建立UUO 模型。腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，從背部靠近右腎位置切開皮膚，鈍性分離皮下、肌肉各層，暴露并游離出右腎和輸尿管，在輸尿管近腎端使用3-0 手術線進行雙結扎，中間剪斷，逐層關閉縫合。假手術組進行上述操作，但不結扎、不剪斷輸尿管。

1.2.2 藥物干預 造模完成后，GPS 低劑量組、GPS 高劑量組分別給予0.1、0.2 g/kg GPS 腹腔注射，厄貝沙坦組給予0.02 g/kg 厄貝沙坦腹腔注射，模型組和假手術組給予等體積生理鹽水腹腔注射，均1次/天，連續7 d。

1.2.3 標本采集 術后第8 天將小鼠處死，取右腎組織，一部分放入4%甲醛溶液中固定，用于組織形態學觀察；另一部分放置于-80 ℃保存，用于mRNA和蛋白檢測。

1.2.4 小鼠腎組織形態學觀察 取甲醛溶液固定的腎臟組織，脫水透明后石蠟包埋，切片備用。65 ℃烘烤2 h，脫蠟、復水，采用HE 染色法觀察組織形態學變化，Masson染色法觀察組織纖維化程度。

1.2.5 小鼠腎組織Fn、α-SMA 蛋白檢測 采用Western blotting 法。取凍存的腎臟組織，加入蛋白裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE 凝膠電泳，100 V 轉膜100 min，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入α-SMA、GAPDH 抗體（稀釋比例均為1∶1 000）、Fn 抗體（稀釋比例為1∶800），4 ℃孵育過夜；洗膜3 次，加入二抗（稀釋比例為1∶10 000），室溫孵育1 h（α-SMA、GAPDH）、2 h（Fn）；TBST 洗膜，曝光成像。以GAPDH 為內參，采用Image J 軟件分析目的蛋白的相對表達量。

1.2.6 小鼠腎組織Fn、α-SMA mRNA 檢測 采用實時定量PCR 法。取凍存的腎組織，采用TRIzol 法提取總RNA，測定RNA濃度和純度后逆轉錄為cDNA。PCR 擴增引物序列見表1。反應體系：上、下游引物各1 μL，2×擴增試劑10 μL，cDNA 2 μL，無菌無酶水。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個循環。以GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 PCR擴增引物序列

1.3 GPS對UUO小鼠腎組織基因表達的影響觀察

1.3.1 轉錄組測序 取6 只小鼠，隨機分為模型組和GPS 組各3 只。建立UUO 模型后，GPS 組給予0.2 g/kg GPS 腹腔注射，模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射，1次/天，連續7 d。第8天處死小鼠，取右腎組織分為兩份，一份寄往廣州基迪奧生物科技有限公司完成轉錄組測序；另一份置于-80 ℃凍存，用于后續差異表達關鍵基因的驗證。

1.3.2 轉錄組測序數據處理 測序得到的原始讀段包含低質量序列，利用Fastp 軟件進行分析和過濾，從而獲得潔凈讀段，以保證數據質量及結果可靠性。除去含數據接頭序列、低質量序列、全部都是A 堿基序列以及含未知堿基比例大于10%序列后，有效數據均高于99%，說明本實驗測序數據質量佳。利用RSEM 計算每個樣本中所有基因的表達量，并用DESeq2 法進行差異表達基因分析，篩選標準為FDR＜0.05 且|log2（FC）|＞1。借助基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）對差異表達基因的生物學功能和信號通路進行富集分析。

1.3.3 差異表達基因的驗證 取“1.3.1”中GPS組和模型組各3 只小鼠以及“1.2”中GPS 高劑量組和模型組各5 只小鼠的腎組織，采用PCR 方法檢測差異表達基因。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism9.0 統計軟件。符合正態分布的數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GPS對UUO小鼠腎間質纖維化的作用

2.1.1 各組腎組織病理形態學比較 HE 染色顯示，假手術組腎組織形態正常；模型對照組腎小管擴張，間質炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞空泡變性；與模型對照組比較，GPS 高、低劑量組和厄貝沙坦組病理損傷均有所減輕，其中GPS 高劑量組改善效果更明顯。Masson 染色顯示，假手術組腎間質未見明顯藍色膠原著色；模型對照組腎間質大量藍色膠原著色，且著色較深；與模型對照組比較，GPS 高、低劑量組和厄貝沙坦組腎間質藍色膠原著色均減少，其中GPS 高劑量組減少更加顯著。見OSID 碼圖1。

2.1.2 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA 蛋白表達比較見表2。

表2 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA蛋白表達量比較（± s）

表2 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA蛋白表達量比較（± s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與GPS 低劑量組比較，△P＜0.05。

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2.1.3 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA mRNA 表達比較 見表3。

表3 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA mRNA表達量比較（± s）

表3 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA mRNA表達量比較（± s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與GPS 低劑量組比較，△P＜0.05。

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2.2 GPS對UUO小鼠腎組織基因表達的影響

2.2.1 兩組差異表達基因篩選結果 與模型組比較，GPS 組共篩選出710 個差異表達基因，其中下調基因142個、上調基因568個。見OSID碼圖2。

2.2.2 差異表達基因的富集通路分析結果 GO分析顯示，差異表達基因的功能主要集中在細胞進程、生物調節、生物進程調控等方面，見OSID 碼圖3。KEGG 分析顯示，差異表達基因主要富集于Rap1、Ras、PI3K/AKT、MAPK信號通路等，見OSID碼圖4。

2.2.3 GPS 對差異表達關鍵基因的影響 對上述差異表達基因提高篩選標準，篩選|log2（Fc）|≥1.5且FDR＜0.05的基因，利用NCBI及其子數據庫PubMed篩選與纖維化相關的基因，并取其對纖維化的作用趨勢與測序結果的變化趨勢一致的基因，排名前10位的基因為Smyd1、TET1、GZMA、CXCL3、肝細胞生長因子（HGF）、VASH1、ADGRL4、TNFSF8、IL6Ra、含卷曲螺旋域蛋白3（CCDC3）。對這10個基因進行RT-qPCR 驗證，結果顯示，與模型組比較，GPS 組腎組織HGF、CCDC3 mRNA 表達升高（P均＜0.05），見表4。驗證結果與測序結果一致，說明該測序結果真實可信。其余8個基因因驗證結果與測序結果不一致，或測序結果Count 值為0 或1，故不考慮其為GPS干預靶點。

表4 兩組小鼠腎間質纖維化關鍵基因表達量比較（± s）

表4 兩組小鼠腎間質纖維化關鍵基因表達量比較（± s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

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3 討論

CKD 病理損傷的共同途徑是腎間質纖維化，同時也是CKD 進展為終末期腎臟病的關鍵病理環節，因此延緩腎間質纖維化進程是治療CKD 的關鍵。目前臨床治療主要采用的藥物包括激素、RAAS 抑制劑、SGLT-2 抑制劑等，但效果仍不夠理想。中藥已廣泛應用于我國腎臟病領域，成為CKD 一體化治療方案中不可或缺的一部分，因此從天然植物中發掘新藥以改善腎纖維化具有重要意義。已有研究表明，厄貝沙坦對腎臟具有較好的保護效果，選用其作為本研究的陽性對照藥物，可將GPS 的改善效果與其作對比，初步判斷GPS 的用藥價值。GPS 具有抗炎、抗氧化應激等活性，對纖維化有較好的改善效果。動物實驗表明，GPS 可通過抑制Shh 信號通路改善大鼠肝纖維化損傷［6］。CHEN 等［2］報道，GPS 能夠抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，降低TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平，改善肺部組織纖維化病變程度。李玉博等［5］報道，GPS 可以抑制氧化應激反應及腹膜間皮—間充質轉化進程，從而改善腹膜纖維化程度。本研究結果顯示，模型對照組小鼠腎組織病理損傷明顯，間質大量膠原纖維沉積；經GPS干預后，腎組織病理損傷減輕，間質膠原纖維明顯減少，表明GPS 能夠改善腎纖維化，且高劑量組的改善效果優于低劑量組。

腎臟纖維化病理機制十分復雜，主要包括細胞外基質（ECM）沉積、上皮間充質轉化（EMT）、炎癥細胞浸潤等［7］。成纖維細胞或肌成纖維細胞通過EMT誘導激活，造成ECM 大量沉積，使得正常腎臟組織結構遭到破壞，最終導致腎纖維化的發生［8］。Fn 和α-SMA 主要由肌成纖維細胞分泌，Fn、α-SMA 表達增強是EMT 的主要特征之一［10］。本研究結果顯示，模型對照組小鼠腎組織Fn、α-SMA 蛋白和mRNA 表達水平較假手術組明顯升高，表明模型對照組腎組織存在腎間質纖維化；經GPS 治療后，腎組織Fn、α-SMA 蛋白和mRNA 表達水平降低，表明GPS 可通過抑制EMT改善腎間質纖維化。

轉錄組測序是利用高通量測序技術檢測一定條件下的細胞或組織RNA 表達信息的技術，已廣泛應用于多種領域，包括臨床診斷與治療、基礎研究、新藥物研發、疾病分子機制等。本研究通過轉錄組測序技術分析模型組和GPS 組的轉錄組數據，共獲得710 個差異表達基因，通過進一步篩選和體內驗證得到2 個有效基因，HGF、CCDC3 在模型組中低表達，經GPS干預后顯著上調，與測序結果一致。HGF是一種具有廣泛生物活性的因子，對多種組織器官和細胞具有調控作用。HGF 是目前已知的唯一與c-Met 具有高親和力的天然配體，與c-Met 受體結合后，激活下游信號通路如Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK/STAT3、Wnt/β-catenin 和PI3K/AKT/NF-κB、mTOR 通路，從而調控細胞周期、生長和存活、EMT和血管生成、抗凋亡作用等多種生物學過程［10］。已有研究表明，HGF 可阻止纖維化的進展［11］。DONG等［12］報道，熊去氧膽酸通過激活ID1-WNT2/HGF 通路促進肝再生，從而減輕肝纖維化。BAO 等［13］報道，AAV9-HGF 與TGF-β/Smad 抑制劑協同作用通過抑制鐵死亡來減輕矽肺纖維化。CCDC3 是一種高度保守的蛋白質，在糖尿病腎病、脂質代謝、抗炎、動脈粥樣硬化和癌癥中發揮作用［14-15］。BARWINSKA 等［14］對人類腎切除術后腎組織標本和糖尿病腎病腎活檢標本中的腎間質進行激光顯微切割（LMD）和RNA 測序，發現CCDC3 在糖尿病腎病中表達下調，可能與其參與炎癥和免疫調節有關。CCDC3 還可以抑制血管內皮細胞中TNF-α/NF-κB誘導的促炎癥反應［16］。由此可見，HGF 和CCDC3均可通過多種途徑影響纖維化。GO 功能富集分析結果顯示，差異表達基因主要集中在細胞進程、生物調節、生物進程調控等方面；KEGG 通路富集分析發現，差異表達基因涉及Rap1 通路、Ras 通路、PI3K/AKT 通路、MAPK 通路等。這些信號通路上富集的靶點較多，與炎癥、氧化應激相關，同時調控細胞生長、增殖等一系列活動，進而參與纖維化的發生發展，也是潛在的治療靶點。這表明GPS 能夠改善腎間質纖維化，減輕腎臟損傷，治療CKD，其機制可能是通過調節多種信號通路，多途徑、多靶點緩解腎纖維化。

綜上所述，GPS 能夠改善UUO 小鼠腎間質纖維化，其作用機制可能與上調HGF 及CCDC3 表達、Rap1 通路、Ras 通路、PI3K/AKT 通路等生物學途徑有關。后續我們將進一步通過體外實驗進行佐證，為臨床用藥提供理論依據。