滲透脅迫下玉米自然反義轉錄本cis-NATZmNAC48 啟動子的功能分析

毛 燕 鄭名敏 牟成香 謝吳兵 唐 琦

1 成都師范學院, 四川成都 611130; 2 四川農業大學玉米研究所, 四川成都 611130

滲透脅迫是由于外界水分虧缺和細胞失水過多,進而使細胞水勢降低, 最終導致植物生長受影響的過程。包括干旱、高溫和高鹽等非生物脅迫。非生物脅迫是全球農作物減產的主要原因之一, 可直接導致作物的產量降低50%以上, 造成巨大經濟損失[3]。因此, 研究植物對滲透脅迫的響應機制對于后續作物改良育種具有重要的意義。

自然反義轉錄本(Natural Antisense Transcripts,NATs)是生物體內產生的一種內源性RNA, 可與其對應的互補RNA 通過堿基配對, 形成自然正義-反義轉錄物配對的雙鏈RNA[4]。在植物生長發育和逆境響應等過程中發揮著重要的作用。在鹽脅迫下,擬南芥脅迫相關基因Δ1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase (P5CDH)與其自然反義轉錄SRO5形成24 nt 的siRNA 并指導P5CDH初始剪切, 為后形成的21 nt siRNA 建立一個相位, 進一步降解P5CDH,進而調控擬南芥的耐鹽性[5]。Zhao 等[6]研究發現低溫下,MADSAFFECTINGFLOWERING4(MAF4)被其反義轉錄本MAS激活, 抑制擬南芥過早開花。“高產”和“早熟”在水稻產量中是2 個矛盾的因素, 阻礙著水稻產量的進一步提高。水稻開花促進因子OsSOC1的自然反義轉錄本 Early floweringcompletely dominant (Ef-cd)在不影響作物產量的情況下可將水稻成熟時間提前7～20 d[7]。AsDOG1是Delay of Germination 1 (DOG1)的自然反義轉錄本,在種子成熟過程中以順式的調控方式抑制DOG1基因的表達, 防止種子進入休眠[8]。此外, Yatusevich等[9]研究發現抑制asDOG1的表達可增加擬南芥的耐旱性。

啟動子作為基因表達的關鍵調控區域, 其在基因轉錄調控中發揮關鍵作用。因此, 通過分析滲透脅迫下玉米自然反義轉錄本啟動子表達特性, 有助于了解NATs 的調控機制。關于NATs 啟動子的研究,僅在少量文獻中有報道, 其主要目的在于探索自然反義轉錄本的表達模式[10-11]。前期研究表明,cis-NATZmNAC48是位于玉米ZmNAC48基因位點的自然反義轉錄本, 缺乏蛋白編碼潛能, 其可能通過雙鏈RNA 依賴機制負調控玉米ZmNAC48基因表達進而影響玉米氣孔開閉, 調控植物耐旱性[12]。為了進一步探索cis-NATZmNAC48在滲透脅迫的功能, 本研究通對cis-NATZmNAC48啟動子序列分析, 初步了解cis-NATZmNAC48啟動子序列各調控元件及功能。通過獲得Procis-NATZmNAC48: GUS 和ProZmNAC48: GUS 轉基因材料, 以確定cis-NATZmNAC48啟動子活性是否受滲透脅迫的影響。通過分析滲透脅迫下cis-NATZmNAC48啟動子甲基化情況, 進一步明確cis-NATZmNAC48在滲透脅迫下的表達機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料玉米耐旱自交系AC7643 和干旱敏感自交系AC7729/TZSRW 由四川農業大學玉米研究所提供。擬南芥哥倫比亞0 型(COL)由本實驗室保存。

1.2 玉米干旱試驗

在人工氣候中, 將AC7643 和AC7729/TZSRW玉米種子催芽后, 將其移入裝有蛭石的發芽盤上,放入培養室中生長, 用蒸餾水灌溉。待其長到二葉一心后, 使用營養液進行水培, 每3 d 換1 次營養液(營養液配方參照《無土栽培原理與技術》), 每天通3 h 的氧氣。長日照(16 h 光/8 h 黑暗)下生長, 待其長到五葉一心后, 隨機選擇部分幼苗采用 20%PEG-6000 處理, 其他幼苗仍然在正常的營養液中生長作為對照。分別取處理和對照6 h 材料的根, 用液氮速凍后放于–80℃冰箱保存, 用于DNA 提取, 該部分DNA 用作甲基化分析; 其中用20% PEG-6000處理后的AC7729/TZSRW 根系中提取的DNA 作為PCR 模板用于啟動子區域片段的擴增。

1.3 cis-NATZmNAC48 和ZmNAC48 啟動子生物信息分析

以cis-NATZmNAC48cDNA序列、ZmNAC48蛋白質編碼序列在EnsemblPlants網站(http://plants.ensembl.org/index.html)上檢索玉米B73參考基因組, 獲取cis-NATZmNAC48和ZmNAC48上游啟動子序列。將獲取基因上游啟動子序列, 利用生物信息網站PlantCARE(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[1]和New PLACE (https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)[2]預測啟動子調控元件。

1.4 DNA 提取及啟動子克隆

用GENEOU Plant DNA Isolation kit (LabGENE)試劑盒提取玉米AC7643 和AC7729/TZSRW 根系DNA。利用Primer 5.0設計引物PNA-1F/1R和PNS-1F/1R (表1), 用于cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子克隆。以提取的AC7729/TZSRW根系DNA為模板, 采用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme,江蘇南京)進行PCR擴增。擴增產物與pEASY-Blunt (北京全式金生物技術股份有限公司)載體鏈接, 轉化T1感受態細胞(北京全式金生物技術股份有限公司), 菌液檢測、測序, 最終獲得序列正確的單克隆。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 啟動子載體構建

將擴增的cis-NATZmNAC48(1284 bp)和ZmNAC48(1246 bp)啟動子序列構建到載體pCAMBIA1391 (采用雙酶切,Hind III 和BamH I)。運用試劑盒ClonExpress Multis one step cloning kit (Vazyme, 江蘇南京)將線性的載體pCAMBIA1391和加上同源序列的目的序列進行連接反應。反應結束后, 進行大腸桿菌感受態轉化(菌株Trans1-T1), 測序, 獲得Procis-NATZmNAC48:GUS和ProZmNAC48:GUS載體。質粒提取采用Plasmid mid kit D6904 (Omega, 美國)試劑盒。

1.6 Procis-NATZmNAC48:GUS 和ProZmNAC48:GUS 擬南芥材料獲得

將構建的 Procis-NATZmNAC48:GUS 和 ProZmNAC48:GUS 載體轉化到農桿菌菌株EHA105 中(北京博邁德基因技術有限公司), 通過花序侵染法轉化擬南芥[13]。獲得T0代種子用75%酒精清洗10 min, 再用清水清洗2～3 次后播種到含50 mg mL–1卡那霉素1/2 MS 培養基, 陽性植株移栽至土壤中, 取T1代葉片提取 DNA, 檢測目的基因, 直到篩選出純合植株。

1.6 轉基因擬南芥GUS 染色

將21 d 大小的ProZmNAC48: GUS 和Procis-NATZmNAC48:GUS 轉基因擬南芥放入新鮮GUS 染色液[0.1 mol L–1磷酸緩沖液(pH 7.0), 50 mmol L–1K3Fe (CN)6, 50 mol L–1K4Fe (CN)6, 0.5 mol L–1Na2EDTA, 1% Triton,20 mmol L–1X-Gluc]中于37℃恒溫避光過夜, 用無水乙醇脫色, 直至組織色素被去除, 在普通顯微鏡下觀察染色情況。

1.7 轉基因擬南芥GUS 酶活性測定

將轉基因擬南芥的種子和野生型材料的種子用75%酒精清洗10 min 后, 用清水清洗2～3 次后播種到1/2 MS 固體培養基(不含任何抗生素)上, 4℃生長2 d, 移到長日照條件下生長5 d 后, 將擬南芥移到新的1/2 MS 固體培養基上, 繼續長日照培養7 d 后,將轉基因擬南芥和野生型材料幼苗移出分別放置在1/2 MS 液體培養基和含20% PEG-6000 的1/2 MS 液體培養基繼續培養 6 h 后取樣, 一部分樣品用于RNA 提取, 測定GUS基因表達量; 另一部分樣品用于測定GUS 酶活性, GUS 酶活性測定采用GUS 熒光分析的方法[11], 共進行3 次生物學重復。

1.8 BSP (Bisulfite sequencing PCR)技術

用試劑盒EZ DNA Methylation-gold kit (ZYMO RESEARCH)處理所提取的DNA。處理后的DNA 雙鏈中的“C”轉化為“U”, 通過PCR 將“U”轉化為“T”。利用在線引物設計網站MethPrimer 設計引物(表1),以處理后的DNA 作為模板克隆目的序列。所得到的目的序列連接到T 載體上, 挑取至少20 個單克隆,送樣測序。測序結果正確的序列利用網站Kismeth(http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl#) 進行比對分析[14]。

2 結果與分析

2.1 玉米cis-NATZmNAC48及其正義基因ZmNAC48啟動子序列分析

以cis-NATZmNAC48序列和ZmNAC48蛋白質編碼序列檢索玉米B73 參考基因組, 獲取基因上游啟動子序列。利用生物信息網站 PlantCARE 和 New PLACE 預測啟動子調控元件發現(表2 和表3),cis-NATZmNAC48(2000 bp)和ZmNAC48(1500 bp)啟動子序列中除具有CAAT-box, TATA-box 等基本元件外,cis-NATZmNAC48啟動子序列中還包含ACE, G-box等的光響應元件, TGA-element 生長素響應元件以及ABRE 脫落酸響應元件, 同時也包含WRKY 轉錄因子結合序列W-box;ZmNAC48啟動子區域中包含GA-motif 光響應元件, 厭氧相關元件ARE, 玉米醇溶蛋白代謝調節相關元件O2-site, 組織特異表達調控元件 NON-box, 以及轉錄因子 MYB 結合位點MBS, Myb-binding sites。

2.2 玉米cis-NATZmNAC48及其正義基因ZmNAC48啟動子序列克隆及載體構建

為了探究自然反義轉錄本cis-NATZmNAC48及其正義基因ZmNAC48啟動子在滲透脅迫響應中的功能, 以B73 基因組獲得的上游啟動子作為參考序列,設計特異引物, 以玉米AC7729/TZSRWB 自交系根系DNA 為模板進行PCR 擴增, 最后經測序顯示擴增獲得的cis-NATZmNAC48啟動子序列大小為1284 bp,ZmNAC48啟動子序列大小為1246 bp。將獲得的啟動子序列構建到含有GUS 基因的表達載體上, 并轉化擬南芥, 獲得由cis-NATZmNAC48啟動子驅動的Procis-NATZmNAC48:GUS 轉基因株系和ZmNAC48啟動子驅動的ProZmNAC48:GUS 轉基因株系。

2.3 玉米cis-NATZmNAC48 和ZmNAC48 啟動子表達模式分析

為了探究cis-NATZmNAC48和ZmNAC48的表達模式, 我們將生長至21 d 大小的擬南芥進行GUS染色, 經GUS 染色分析發現Procis-NATZmNAC48:GUS和ProZmNAC48:GUS 轉基因擬南芥根、莖、葉中均有GUS 表達(圖1-A)。

圖1 Cis-NATZmNAC48 和ZmNAC48 啟動子功能分析Fig.1 Function analysis of cis-NATZmNAC48 and ZmNAC48 promoter

為了明確cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子是否為滲透脅迫響應啟動子, 本研究用20% PEG-6000處理14 d 大小的擬南芥植株6 h 后, 分析轉基因材料中GUS基因表達量和GUS 酶活性, 發現ProZmNAC48:GUS 擬南芥中GUS基因的表達量及GUS 酶活性顯著增加, 而Procis-NATZmNAC48: GUS 中GUS基因的表達量及 GUS 酶活性顯著下調(圖1-B)。可見cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子響應滲透脅迫。

2.4 玉米cis-NATZmNAC48 和ZmNAC48 啟動子區域DNA 甲基化水平分析

為了解析cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子應答滲透脅迫后調控自然反義轉錄本的表達的特異性,我們分析了玉米耐旱自交系AC7643 和干旱敏感自交系AC7729/TZSRWB 根系在正常供水和含20%PEG-6000 處理 24 h 后根系中cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子序列中DNA 甲基化情況發現, 在cis-NATZmNAC48序列前400～1000 bp 為DNA 甲基化區域, 滲透脅迫后, 該區域甲基化并沒有發生顯著變化(圖2-A)。ZmNAC48轉錄起始位點前500～900 bp為DNA 甲基化區域, 滲透脅迫處理后該甲基化富集程度降低(圖2-B)。

圖2 Cis-NATZmNAC48 和ZmNAC48 啟動子區域DNA 甲基化Fig.2 DNA methylation in cis-NATZmNAC48 and ZmNAC48 promoter

為了進一步驗證啟動子甲基化在滲透脅迫下的變化情況, 我們采用BSP 的方法, 分析滲透脅迫處理后,cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子甲基化區域甲基化變化。如圖3-A～E, 可以看到在cis-NATZmNAC48啟動子甲基化區域檢測到了GC、GCH 和CHH 甲基化富集, 且脅迫處理后玉米耐旱自交系AC7643 中甲基化富集增加, 干旱敏感自交系AC7729/TZSRWB中甲基化富集減少。且在脅迫處理中僅CHH 類甲基化發生顯著變化, GC 類和GCH 類甲基化未發生顯著變化。

圖3 Cis-NATZmNAC48 和ZmNAC48 啟動子區域DNA 甲基化分析Fig.3 DNA methylation characteristics in cis-NATZmNAC48 and ZmNAC48 promoter

分析單個位點甲基化變化, 發現顯著變化的甲基化位點均不在各順式調控位點上(圖4)。當我們對ZmNAC48啟動子甲基化區域進行擴增時, 僅擴增到如圖2-B 中引物1F/1R 間的區域, 該區域并未檢測到甲基化富集(圖3-F)。

圖4 Cis-NATZmNAC48 啟動子甲基化區域順式元件預測Fig.4 Cis-element prediction of cis-NATZmNAC48 promoter

3 討論

探究滲透脅迫下玉米各基因的分子調控機制,有利于提高玉米抵抗逆境脅迫的能力, 為玉米抗逆分子育種提供理論基礎和基因資源。NATs 作為一類重要的 lncRNAs, 在生物體內普遍存在, 大約有22%的人類、15%的果蠅、7%的水稻和9%的擬南芥基因含有NATs, 在玉米中約46%的轉錄本為NATs,其中約有29%的NATs 響應滲透脅迫[4,15]。因此, 深入研究NATs 的表達調控, 對理解玉米抗逆分子機制具有重要的意義。此前研究發現cis-NATZmNAC48可能通過雙鏈RNA 依賴機制負調控玉米ZmNAC48基因表達進而影響玉米氣孔開閉, 調控植物耐旱性[12]。啟動子作為基因調控的關鍵因子, 其序列中分布著與基因功能密切相關的順式調控元件。因此,解析滲透脅迫下cis-NATZmNAC48啟動子的功能可為后續cis-NATZmNAC48的調控分析奠定重要的基礎。

用PlantCARE[1]和New PLACE[2]分析啟動子序列, 顯示玉米cis-NATZmNAC48啟動子含TGA、ABRE,W-box;ZmNAC48啟動子含有ARE、MBS 等逆境脅迫應答元件(表2)。ABA-responsive element (ABRE)是ABA 應答的核心元件, 其在基因響應脫水、高鹽、低溫和ABA 脅迫處理中扮演著重要的角色[16-17]。W-box 序列可被WRKY 轉錄因子特異結合, 研究表明W-box 主要存在于與抗病、損傷、衰老、干旱相關基因的啟動子區域, 因此WRKY 轉錄因子與植物的生物與非生物脅迫應答密切相關[18]。Abe 等研究發現MYB, MYC 轉錄因子識別位點如MBS 序列, 在干旱誘導RD22 基因表達中具有重要作用[19]。可見cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子在cis-NATZmNAC48和ZmNAC48響應逆境脅迫具有重要作用。此外, 通過分析Procis-NATZmNAC48: GUS 和ProZmNAC48: GUS 轉基因擬南芥在滲透脅迫下GUS基因表達情況及其GUS 酶活性, 證明cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子響應滲透脅迫。

DNA 甲基化是影響啟動子活性的調控事件之一。在有機體中, DNA 甲基化和基因表達之間的關系不是絕對的, 但一般的規律是: 甲基化作用阻止基因表達, 而表達則需要去甲基化作用[20-21]。TaGli-γ-2.1屬于小麥麥膠蛋白基因家族成員, 是小麥面筋強度的負調控因子, 其啟動子區域的高甲基化導致TaGli-γ-2.1基因表達量的降低, 提高了小麥面筋強度, 豐富了小麥品質育種資源[22]。滲透脅迫和鹽脅迫誘導小麥甘油醛-3 磷酸脫氫酶基因TaGAPC1啟動子區域的CG 和CHG 兩種類型的甲基化程度降低[23]。本研究中我們發現cis-NATZmNAC48啟動子區域甲基化會因為滲透脅迫而發生改變。滲透脅迫處理6 h, 玉米耐旱自交系AC7643 中甲基化富集增加, 干旱敏感自交系AC7729/TZSRWB 中甲基化富集減少(圖3)。其中玉米耐旱自交系AC7643根系中cis-NATZmNAC48的表達量沒有發生顯著變化,而在干旱敏感自交系AC7729/TZSRWB 根系中cis-NATZmNAC48的表達量顯著減少[12]。滲透脅迫處理24 h,玉米耐旱自交系AC7643 和干旱敏感自交系AC7729/TZSRWB 中甲基化富集沒有變化(圖2)。其中玉米耐旱自交系 AC7643 和干旱敏感自交系 AC7729/TZSRWB 根系中cis-NATZmNAC48的表達量顯著減少[12]。因此關于cis-NATZmNAC48啟動子區域甲基化變化是否影響cis-NATZmNAC48, 又是如何影響cis-NATZmNAC48表達, 進而調控植物耐旱性, 還有待進一步研究。但通過本研究我們可以確定的是滲透脅迫會影響cis-NATZmNAC48啟動子區域DNA 甲基化富集。

4 結論

玉米自然反義轉錄本cis-NATZmNAC48啟動子序列中含有TGA, ABRE, W-box 等非生物脅迫響應應答元件, 響應干旱等非生物脅迫。通過獲得轉基因材料進一步證明cis-NATZmNAC48和ZmNAC48啟動子響應滲透脅迫。通過分析滲透脅迫下cis-NATZmNAC48啟動子甲基化情況發現,cis-NATZmNAC48啟動子區域DNA 甲基化受滲透脅迫影響, 但滲透脅迫下DNA甲基化變化顯著的位點并未在個順式調控元件中。