小麥穗型相關生長素通路基因發掘及TaARF23-A 與小穗數關聯分析

譚 丹 陳家婷 郜 鈺 張曉軍 李 欣 閆貴云 李 銳 陳 芳 常利芳 張樹偉 郭慧娟 暢志堅 喬麟軼

山西農業大學農學院 / 作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室 / 農業農村部有機旱作農業重點實驗室(部省共建), 山西太原 030031

穗是小麥的重要器官。小麥穗部形態與穗長、小穗數等農藝性狀密切相關, 直接影響植株產量。小麥穗型的建立可分為3 個階段, 即開花轉變期、小穗起止期和小花起止期[1]。其中, 小穗起止期是花序結構形成的關鍵階段, 涉及小穗的起始、排布和終止, 最終決定了小穗數目[2]。生長素是調控該時期小穗發育的主要內源激素之一, 可通過濃度梯度和信號傳導兩個方面來調節小穗的分化和排列[1,3]。

植物生長素一般由色氨酸(tryptophan, TRP)通過色胺(tryptamine, TRA)途徑或非色胺途徑合成[4]。在大麥小穗起止期, 色胺途徑受到基因調控而增強, 合成的生長素在小穗中從上到下濃度逐漸升高, 這種梯度分布影響大麥穗部棱型和側小穗發育, 增加了每穗小穗數和小穗密度進而提高產量[5-7]。此外, 生長素還作為信號分子進入細胞核, 通過激活生長素響應因子(Auxin Response Factors,ARFs)來促進或抑制下游靶基因的表達, 進而調控小穗發育[3,8]。ARFs 在決定小穗分生組織命運和花序結構方面發揮著關鍵作用[2,9]。在小麥小穗出現雙脊(double ridge)之前,ARFs 就已經開始受到生長素誘導而上調[8]。小麥品種科農9204 幼穗中的ARFs 在逆境環境下整體保持了較高的轉錄水平, 其單株穗數和小穗數顯著高于對照品種[10]。

為了進一步發掘小麥穗型相關的生長素通路基因,本研究選擇了2 個穗部形態差異明顯的小麥品系SY95-71和CH7034, 對其小穗起止期幼穗的內源生長素含量和轉錄組進行了比較分析, 從中鑒定候選基因; 并利用SY95-71 和CH7034 的RILs 群體及其多年多點穗部表型數據對候選基因開展關聯分析驗證, 以期為穗型發育機制解析提供參考, 并為小麥理想穗型改良提供分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥品系SY95-71 和CH7034 在GS24 時期(Growth Stage 24)[11]的幼穗用于內源生長素測定、轉錄組測序和qRT-PCR。其中, SY95-71 由四川農業大學舒煥麟副研究員和電子科技大學楊足君教授共同選育[12]; CH7034 由山西農業大學(原山西省農業科學院)暢志堅研究員選育[13]。SY95-71 和CH7034 的RIL 遺傳群體(含184 家系)及其在6 個大田環境下(2014 年成都、2015 年成都、2016 年運城兩點、2015 年臨汾和2016 年臨汾)的穗長、每穗小穗數和穗密度數據用于候選基因與穗型的相關性分析。上述材料均由作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室提供。

1.2 生長素含量測定

將樣本研磨后取50 mg 溶于1 mL 加有內標混合溶液的甲醇∶水∶甲酸 (15∶4∶1, v/v/v)提取劑, 離心取上清液濃縮, 再復溶于100 μL 80%甲醇中, 過濾后上樣, 利用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)系統檢測生長素合成途徑中的 5 個化合物含量, 包括色氨酸 TRP、吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA)、以及色胺途徑的色胺TRA、非色胺途徑的吲哚乙酰胺(Indole-3-acetamide, IAM)和吲哚已腈(Indole-3-acetonitrile, IAN)。設置3 個生物學重復。

1.3 轉錄組測序

利用Illumina 平臺對樣品進行測序, 測序數據經篩選后比對小麥品種中國春基因組參考序列(IWGSC_RefSeq_v1.1), 將比對上的reads 進行組裝和定量。采用FPKM 值作為衡量基因表達水平的指標。以|log2(FPKMSY/FPKMCH)|≥1 和 probability ≥0.8 為標準篩選差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs), 相關結果用MeV 輸出。基于百邁客云服務器工具(https://international.biocloud.net/)獲得DEGs 的功能注釋和GO 富集等信息。設置3 個生物學重復。

1.4 qRT-PCR

使用RNA 提取試劑盒(北京天漠)提取樣品總RNA, 利用反轉錄試劑盒(大連寶生物)將其反轉錄為cDNA。使用TB GreenTaqII 酶(大連寶生物)在QuantStudio 3 定量PCR儀(美國ABI)上完成qRT-PCR 反應, 內參基因為小麥Actin,相關引物A1-q 和A2-q 列于表1。每個反應重復3 次, 所得結果采用2–ΔΔCT法進行分析。設置5 個生物學重復。

表1 TaARF23 相關引物Table 1 Primers related TaARF23

1.5 標記開發

采用CTAB 法提取SY95-71、CH7034 及其RILs 群體葉片的基因組DNA。利用Taq酶(大連寶生物)以及引物P1 和P2 擴增親本中的候選基因, 將PCR 產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后挖膠測序。根據基因在 SY95-71 和CH7034 中的序列差異開發分子標記擴增RILs 群體DNA,產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)電泳檢測、硝酸銀染色, 記錄標記型。

1.6 關聯分析

RILs 群體的每個家系種植1 行, 行長2 m, 共種植15株。待植株成熟后每行隨機選擇5 株, 鑒定主穗最底部小穗至最頂部小穗的距離(不含芒長)計為穗長、主穗所有小穗數目計為小穗數, 將小穗數除以穗長獲得穗密度。利用t檢驗對RILs 群體穗部表型和候選基因標記型之間的相關性進行分析, 設P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SY95-71 和CH7034 幼穗中生長素含量差異顯著

SY95-71 與CH7034 具有不同的穗型, 前者為長芒、紡錘型穗, 后者為無芒、圓形密穗(圖1)。對2 份材料幼穗中的生長素含量進行測定, 結果顯示, 吲哚乙酸IAA 和底物色氨酸TRP 的含量沒有顯著差異; 非色胺途徑中的吲哚乙酰胺IAM 和吲哚已腈IAN 在幼穗中含量較低, 也沒有顯著差異; 色胺途徑中的關鍵物質色胺 TRA 在SY95-71 幼穗中含量為98.58 ng g–1, 極顯著高于CH7034中的18.63 ng g–1(P=0.001, 圖2)。據此推測, 色胺途徑可能是SY95-71 與CH7034 幼穗中生長素合成的主要來源;由于TRA 是IAA 的前體, 其在幼穗中的含量差異可能是造成兩者不同穗型的原因之一。

圖1 小麥品系SY95-71 和CH7034 的穗型Fig.1 Spike morphology of wheat lines SY95-71 and CH7034

圖2 生長素合成通路中5 個化合物在SY95-71 和CH7034 幼穗間的含量比較Fig.2 Comparison of the content of five compounds in the auxin synthesis pathway between young spikes of SY95-71 and CH7034

2.2 生長素相關GO 富集分析

對SY95-71 和CH7034 幼穗中的DEGs 進行GO 富集,從中篩選生長素相關條目。結果顯示(圖3), 在SY95-71中高表達的DEGs 被富集到14 個生長素相關條目, 其中生物進程類(biological process, BP) 11 個、分子功能類(molecular function, MF) 3 個; 在CH7034 中高表達的DEGs 被富集到12 個生長素相關條目, 其中BP 類8 個、MF 類4 個。

圖3 SY95-71 和CH7034 幼穗中生長素通路相關的GO 富集Fig.3 GO enrichment related to auxin pathway in young spike of SY95-71 and CH7034

在高置信區間(P<0.01)范圍內, 只有SY95-71 中富集到5 個生長素相關條目, 即 BP 類別中的吲哚乙酸代謝(indoleacetic acid metabolic process, GO:0009683)、吲哚乙酸生物合成(indoleacetic acid biosynthetic process, GO:0009684)和生長素生物合成(auxin biosynthetic process, GO:0009851),以及MF 類別中的吲哚乙酰胺水解酶活性(indoleacetamide hydrolase activity, GO:0043864)和吲哚-3-甘油-磷酸合酶活性(indole-3-glycerol-phosphate synthase activity, GO:0004425)。除了GO:0004425 以外, 其余4 個條目均是SY95-71 中富集到的特有條目, 猜測這些特有條目可能與SY95-71 幼穗中較高的TRA 含量有關。

2.3 SY95-71 幼穗中的生長素通路DEGs

我們從SY95-71 幼穗轉錄水平顯著高于CH7034 的DEGs 中篩選了與生長素生物合成和信號轉導相關的5 類基因(圖4), 分別是TDC(TryptophanDecarboxylase)、ARF、Aux/IAA(Auxin/IndoleAceticAcid)、SAUR(Small AuxinUpRNA)和GH3(Gretchen-Hagen3)。其中,TDC編碼色氨酸脫羧酶, 負責將色氨酸TRP 轉化為色胺TRA;ARF編碼生長素響應因子, 可調控下游原初響應基因Aux/IAA、SAUR和GH3的表達水平。與CH7034 相比, 上述DEGs 在SY95-71 中極顯著高表達的有1 個TDC基因(TraesCS4A02G43150)、2 個ARF基因(TraesCS7A02 G475700、TraesCS7A02G475600)和 3 個SAUR基因(TraesCS7D02G456500、TraesCS7D02G456400、TraesCS7 A02G468700)。

圖4 SY95-71 幼穗中生長素通路相關DEGsFig.4 DEGs related to auxin pathway in young spike of SY95-71

2.4 TaARF23-A 的qRT-PCR 驗證

ARF 既是生長素的響應因子, 又能在信號傳導路徑中作為轉錄因子調控下游基因網絡。因此, 我們進一步分析了在SY95-71 幼穗中轉錄水平最高的2 個ARF基因。在中國春參考基因組中,TraesCS7A02G475600和TraesCS7A02G475700是位于7A 染色體長臂上同一位點的一對串聯重復基因(圖5-a), 根據小麥ARF 家族成員編號[14], 將其分別命名為TaARF23-A1和TaARF23-A2。

圖5 TaARF23-A 分析Fig.5 Analysis of TaARF23-A

TaARF23-A1和TaARF23-A2在啟動子區、外顯子和內含子的序列完全相同, 但具有不同的轉錄本。與TaARF23-A1相比,TaARF23-A2的第1 個外顯子在剪切過程中缺少了9 bp, 據此開發特異定量引物A1q 和A2q (圖5-a)。qRT-PCR 結果表明, SY95-71 幼穗中TaARF23-A1和TaARF23-A2的表達量極顯著高于CH7034 (圖5-b～c), 與轉錄組測序結果一致。

2.5 TaARF23-A 與穗部表型的關聯分析

基于中國春參考基因組, 我們設計了2 對引物P1 和P2 來擴增CH7034 和 SY95-71 中TaARF23-A基因組序列。測序結果顯示, P1 和P2 的擴增產物均沒有雜峰(圖5-d),表明在 CH7034 或者 SY95-71 中,TaARF23-A1和TaARF23-A2也具有完全相同的基因組序列。

通過比對CH7034 和 SY95-71 中的TaARF23-A序列,在第一個外顯子中鑒定到3 個多態性位點, 包括2 個SNP和1 個InDel (圖5-a)。在InDel 位點, CH7034 具有12 bp的序列插入, SY95-71 中則缺失。據此開發了InDel 標記,該標記在CH7034 和SY95-71 中分別擴增出82 bp 和70 bp的條帶(圖5-e)。

利用InDel 標記鑒定CH7034 和SY95-71 的RILs 群體獲得標記型, 將其與群體穗部表型進行關聯分析, 結果顯示(圖6), 除了1 個環境(15L)以外, 該InDel 標記在其余5 個環境下與群體穗密度表型顯著相關(P<0.05), 在所有環境數據平均值下呈極顯著相關(P=5.57E-07); 進一步分析穗密度表型的2 個組分(穗長和小穗數), 發現InDel 標記與群體穗長不相關(P>0.05), 而與每穗小穗數呈極顯著相關(P<0.0001), 表明TaARF23-A與小穗數相關。

圖6 RILs 群體中InDel 標記型與6 個環境下穗部表型的相關性分析Fig.6 Correlation analysis between genotypes of InDel marker and phenotypes of spike in RILs population under six environments

3 討論

3.1 小麥穗型受生長素通路調控

生長素是調控小麥小穗發育的重要激素之一[1]。在本研究中, SY95-71 和CH7034 幼穗中的生長素主要由色胺途徑合成, 并在SY95-71 中富集到了特有的、與生長素合成和代謝相關的高置信 GO 條目。與 CH7034 相比,SY95-71 幼穗中的色氨酸脫羧酶基因TDC具有更高的轉錄水平, 可將底物色氨酸轉化為更高含量的色胺, 進而合成生長素。之后, 生長素通過TIR1/AFB 途徑[15]激活ARF,后者進一步調控原初響應基因Aux/IAA、SAUR和GH3的表達, 最終形成與CH7034 不同的穗型。然而, 吲哚乙酸IAA 在SY95-71 和CH7034 幼穗中沒有顯著差異, 這可能是由于幼穗是合成生長素的主要器官, 對IAA 濃度極為敏感, 過多的IAA 通常會被向下運輸到其他組織部位, 防止其對幼穗生長發育造成抑制, 并使植株保持一定程度的頂端優勢[16-17]。另外, 信號傳導通路也會對高濃度IAA產生負反饋機制, 如GH3編碼的酰基酰胺合成酶可催化IAA 與氨基酸結合而失活, 從而動態調節IAA 的含量[18]。因此, 幼穗中生長素含量差異可能會以其前體色胺的形式來體現, 這個現象在一些研究中已有報道[19]。

3.2 TaARF23-A 與小穗數相關

通過穗型調控小穗數是優化小麥產量的重要策略[20-21]。迄今已有多個小穗數基因被報道, 如WFZP[22]、WAPO1[23]、FT-D1[24]、TaCOL-B5[25]和TaNAC67[26]等。本研究鑒定出1 個與小穗數極顯著相關的生長素響應因子基因TaARF23-A。該基因包含2 個相鄰的串聯重復A1 和A2, 兩者具有完全相同的基因組序列, 但轉錄本不同, A1和A2 的表達量在不同穗型間均差異顯著。在小麥中, 某些基因經歷串聯重復事件后拷貝數增加, 對表型的調控能力會增強。如Rht-D1b經串聯重復后獲得2 個拷貝, 其降稈效應是單個拷貝的3 倍[27];TaCYP81D具有5 個串聯拷貝, 該位點使植株對鹽脅迫的耐受性增強[28]。因此,TaARF23-A1和TaARF23-A2的編碼產物可能都參與了對小穗數的調控。

此外,TaARF23-A的外顯子在SY95-71 和CH7034 間存在序列多態性, 根據InDel 位點開發了分子標記。在6個大田環境條件下,TaARF23-A的CH7034 型等位變異的小穗數為22.59, 比SY95-71 型等位變異(20.92)增加了1.67 個(P=2.12E-25)。該標記可用于育種工作中的種質篩選或分子輔助選擇。

3.3 TaARF23-A 可能的調控機制

本研究中,TaARF23-A在SY95-71 中比CH7034 具有更高的表達水平, 但SY95-71 型等位變異對應的小穗數卻較低, 可能的調控機制有2 個。一是TaARF23-A 為正向調控因子, 誘導了Aux/IAA 等抑制子的表達, 造成對小穗數的負調控, 例如啟動子區包含ARF 結合元件AuxRE的TaIAA-3A(TraesCS3A02G108400)可能為抑制子(圖7-a)。類似于 TaARF25-TaIAA21 模型, TaARF25 誘導TaIAA21表達, 但TaIAA21 負調控粒徑和粒重[29]。二是TaARF23-A 為負向調控因子, 抑制了SAUR等基因的表達(圖7-b)。SAUR 是生長素調控細胞生長的主要效應因子,saur19突變體的根部分生組織減少、側根數目減少[30], 因此猜測穗部SAUR基因受抑制后也可能會造成小穗數目減少。通常認為當ARF 中間區域(middle region)的谷氨酰胺Q-絲氨酸S-亮氨酸L 含量較高時, ARF 激活靶基因; 當MR 的絲氨酸S-脯氨酸P-甘氨酸G 含量較高時, ARF 抑制靶基因[31]。TaARF23-A 的MR 區域(240～321 氨基酸)包含QSL 個數為18, SPG 個數為14, 其為正向調控因子的可能性較大。然而最新研究表明, ARF 對靶基因具有雙重功能,在不同生長發育時期表現出特定的激活或抑制作用[32]。此外,TaARF23-A外顯子中的3 處序列多態性造成的蛋白水平變異, 也可能對其功能產生影響。這些需要后續大量試驗進行驗證。

圖7 TaARF23-A 的預測靶基因Fig.7 Predictive target genes for TaARF23-A

致謝: 電子科技大學楊足君教授、四川省農業科學院楊恩年研究員和山西農業大學鄭軍研究員在群體構建、大田種植以及表型鑒定方面給予了大力支持, 謹致謝忱！