BRCA1基因與肺腺癌免疫細胞浸潤和預后的關系

駱許靜 孫 楨 馬耀先 方曉瑞

作者單位：461000 河南省許昌市中心醫院

肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是高發性的侵襲性非小細胞肺癌,發病率占全部肺癌的40%[1]。近年來,肺腺癌治療主要以手術、放化療、分子靶向治療及免疫治療等綜合方案為主,極大程度的提高LUAD患者預后,但因患者個體差異與耐藥性等因素影響,治療效果仍被限制[2]。所以,迫切尋找肺腺癌的致病機制與高效、精準的診治手段具有重要意義。臨床大量證據發現腫瘤微環境(tumor immune microenvironment,TME)參與腫瘤疾病的發生及發展,TME為大量基質細胞維持,如腫瘤干細胞、癌內皮細胞、癌相關成纖維細胞及浸潤免疫細胞[3-4]。癌細胞與其支持細胞間共同作用介導腫瘤發生增殖、抗凋亡、免疫逃逸等。大量研究報道,TME標志物可評估黑色素瘤、尿路上皮癌患者的預后,免疫相關標志物水平與免疫治療密切相關[5-6]。進一步研究表明,免疫微環境中基因特征表達,可能是預測免疫抑制劑治療效果的潛在生物標記物。

乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)可介導DNA增強細胞修復DNA侵損能力,與癌癥發展相關[7]。臨床已發現BRCA1基因是預測乳腺癌療效、預后的重要因子[8]。目前BRCA1在LUAD中作用研究較少,關于其免疫治療效果及預后預測價值不明。本研究通過公共數據庫,分析BRCA1基因表達與LUAD免疫細胞浸潤和預后的關系,研究其在肺腺癌免疫微環境中可能的作用,深入探討BRCA1基因在肺腺癌發生、發展及治療中的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2019年1月至2022年1月間68例手術切除新鮮肺腺癌組織與癌旁肺組織(>癌組織邊緣10 cm)標本,患者均為首次就診,術前未采取任何抗腫瘤治療,術后病理證實為肺腺癌。其中男性41例,女性27例,年齡29～78歲,平均年齡(67.49±9.23)歲;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期58例,Ⅲ～Ⅳ期10例;淋巴結轉移27例。本次研究提交我院倫理委員會并審核通過,并取得患者或家屬簽字知情同意書。

1.2 qRT-PCR檢測BRCA1mRNA水平

新鮮標本存放于RNA穩定性RNA later保存液(上海鈺博生物科技有限公司)中2 ℃保存待用,RNA提取:采用Trizol試劑(賽默飛世爾科技中國有限公司)盒提取組織中總RNA并提純,參照熒光定量PCR試劑盒(賽默飛世爾科技中國有限公司)說明配置20 μlPCR反應體系,BRCA1引物序列:上游5' AUGGCCUC--CGUCU-C-CCAGCUUGC 3,下游3' UUCCA-AGUUGUAAAAUGUGGUCGA-CG 5';反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,40個循環,采用2-△△Ct方法與GAPDH水平為基線對結果矯正處理BRCA1mRNA相對表達量。

1.3 免疫組化

取癌組織和癌旁組織標本后給予生理鹽水沖洗,沖洗后將標本樣品保存于凍存管中,采用油性筆記號并編號,保存于-196 ℃液氮罐中。為確保組織中RNA酶有效性不被破壞,在樣本離體后10 min內完成檢驗,采用4%多聚甲醛溶液(賽默飛世爾科技中國有限公司)固定樣本,采用石蠟包埋后切厚度為4 μm的切片,應用全自動免疫組化染色儀(型號:AttoStar?-4800A,艾托金生物醫藥(蘇州)有限公司),染色程度參照BRCA1試劑盒(上海酶聯生物科技)說明書進行。結果判定:BRCA1陽性著色為細胞核呈棕黃色。

1.4 公共數據庫分析

1.4.1 Oncomine數據庫分析BRCA1基因在肺腺癌組織中的表達 采用Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)分析BRCA1基因在泛癌中的表達水平。設置條件為:“Gene:BRCA1”“Analysis Type:Cancer vs.Normal”“THRESHOLD BY:P-VALUE<0.01,FOLD CHAGE>2,GENE RNAK=Top 10%,Date type:All”。

1.4.2 Kaplan-meier Plotter數據庫分析 Kaplan-meier Plotter數據庫在GEO、EGA與TCGA等公共數據庫基因芯片及RNA-seq數據基礎上建立,可對特定基因臨床預后價值進行評估,根據患者樣本參照基因中位表達(高表達與低表達)分為兩組,采用Kaplan-Meier生存曲線分析肺腺癌患者的總體生存率。

1.4.3 TIMER數據庫分析 TIMER數據庫(http://timer.cistrome.org/)作為系統分析不同癌癥類型的免疫浸潤綜合數據庫,可通過TCGA(The cancer genome atlas)數據庫腫瘤中采用Diff Exp模塊辨別腫瘤與鄰近正常組織之間靶基因的差異表達,本研究中,采用TIMER數據庫分析BRCA1在肺腺癌中的表達。通過反卷積方法從基因表達譜中分析肺腺癌浸潤免疫的豐富度,采用Immune Association模塊中Gene分析BRCA1基因表達與免疫細胞浸潤豐度的關系。

1.5 統計學分析

應用R軟件包(4.1.3版本)完成統計學分析,癌組織及癌旁組織中BRCA1 mRNA表達水平呈正態分布,組間采用t檢驗;Kaplan-Meier生存曲線評估BRCA1基因對肺腺癌預后的影響;Spermans相關性檢驗 BRCA1基因與免疫細胞浸潤的相關性,以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 肺腺癌BRCA1基因差異表達

采用Oncomine數據庫比較不同惡性腫瘤及配對癌旁組織中BRCA1基因水平,見圖1;分析顯示肺腺癌(LUAD)中BRCA1基因水平高于癌旁組織(P<0.05),見圖2;qRT-PCR檢測結果顯示肺腺癌組織中BRCA1 mRNA表達水平高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3,與Oncomine數據庫結果一致。

圖1 Oncomine數據庫分析各種類型惡性腫瘤組織與癌旁組織中BRCA1基因表達

LUAD為肺腺癌組織;Normal為癌旁組織。

圖3 qRT-PCR檢測BRCA1 mRNA表達水平

2.2 肺腺癌BRCA1免疫組化

免疫組化學染色法檢測BRCA1表達,癌旁組織見清晰的細胞結構,大小均勻,排列規則,見低度BRCA1淺棕黃色表達、癌組織腺癌細胞大小不一,呈混亂排列,且結構異常,BRCA1在細胞核中呈棕黃色。

2.3 BRCA1基因表達與肺腺癌免疫細胞浸潤的相關性

TIMER數據庫分析,BRCA1表達與中心粒細胞(γ=0.147,P=1.28×10-3)浸潤水平具有強相關性,但與B細胞(γ=-0.09,P=4.73×10-2)、CD8+T細胞(γ=0.047,P=3.00×10-1)、CD4+T細胞(γ=0.039,P=3.91×10-1)、巨噬細胞(γ=-0.038,P=4.05×10-1)及樹突狀細胞(γ=0.039,P=3.85×10-1)無相關性,見圖4。

圖4 BRCA1基因表達與肺腺癌免疫細胞浸潤的相關性

2.4 BRCA1基因表達與肺腺癌預后的關系

Kaplan-meier Plotter數據庫分析,BRCA1基因高表達肺腺癌患者總生存期短于低表達者,無病生存率低于低表達肺腺癌患者,差異有統計學意義(P<0.05),見圖5。

圖5 BRCA1基因表達與肺腺癌預后的關系

3 討論

近年來BRCA1在臨床腫瘤中的表達及功能逐漸報道,其中在乳腺癌研究較多。多項研究表明,BRCA1是乳腺癌的潛在生物標志物及免疫治療靶點;BRCA1在乳腺癌組織中呈下調表達,BRCA1基因表達與臨床病理、復發機預后密切相關[9-10]。同時,BRCA1可對乳腺癌細胞周期調控、基因轉錄及DNA的損傷修復[11]。但有關BRCA1基因表達與LUAD患者的潛在作用及預后關系鮮少有報道。基于此本文通過分析BRCA1基因對LUAD預后及免疫微環境的關系,進一步為LUAD預后評估及免疫治療提供新策略。

我們對公共信息庫數據分析發現,BRCA1基因在LUAD組織中表達均高于正常組織;本研究qRT-PCR檢測結果分析肺腺癌組織中BRCA1 mRNA表達水平高于癌旁組織;生存分析結果顯示,BRCA1基因高表達肺腺癌患者總生存期、無病生存率短于低表達肺腺癌患者,差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明,BRCA1可影響LUAD發展,且可能為LUAD預后的生物標志物。

免疫浸潤與腫瘤微環境對不同腫瘤發生發展發揮關鍵作用,腫瘤分子特征與免疫微環境間發揮協同作用而影響不同臨床結果[12-13]。本研究發現,TIMER數據庫分析,BRCA1表達與中心粒細胞(γ=0.147,P=1.28×10-3)浸潤水平具有強相關性,但與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、及樹突狀細胞無相關性。中性粒細胞是機體外周血中豐富的白細胞,可介導吞噬作用、脫顆粒、大量分泌活性氧等預防病原體侵襲;同時中性粒細胞可形成特殊的細胞死亡程序中性粒細胞外誘補網(neutrophil extracellular traps,NETs),介導機體不同病理生理發展[14-15]。臨床報道,NETs在肺癌、胃癌等患者中呈上調表達,隨腫瘤微環境改變NETs可直接作用[16-17]。臨床還發現,NETs大量存在于乳腺癌、結直腸癌患者發生肝轉移病灶中,提升腫瘤細胞活性,使腫瘤短期中出現轉移[18]。在腫瘤微環境中,相關免疫抑性細胞如巨噬細胞、調節性T細胞等可輔助腫瘤發生免疫逃逸,如惡性腫瘤細胞產生的趨化因子可加快中性粒細胞形成NRTs,阻斷免疫細胞與鄰近靶向細胞的結合,促進腫瘤細胞受CD8+T細胞及自然殺死細胞調控的細胞毒性作用[19-20]。所以NETs可能作用腫瘤微環境輔助腫瘤細胞免疫逃逸,加快腫瘤發生進展。所以,本次研究結合數據庫分析結果與既往研究表明,BRCA1基因可能調控中性粒細胞與腫瘤細胞間的協同作用加快LUAD進展。

綜上所述,本研究結果初步表明BRCA1基因在肺腺癌組織中呈上調水平,下調BRCA1表達水平有望改善肺腺癌患者預后,BRCA1表達水平與肺腺癌中性粒細胞浸潤密切相關,表明其在肺腺癌發展過程中發揮關鍵生物學作用,且為肺腺癌治療提供新的免疫靶點。但本研究結果是基于生物學信息庫分析上,BRCA1與腫瘤微環境中的免疫浸潤及調節仍待進一步驗證,有待更詳細且具體的體內外研究。