血清miR-375、miR-155與原發性肝癌臨床分期及預后的關系

王根柱 王亦茹 常學忠

作者單位：450000 河南省鄭州市第三人民醫

原發性肝癌是起源于肝臟上皮或間葉組織的惡性腫瘤,是我國發病率排名第四、死亡率排名第二的癌癥類型,其發病受環境、飲食、病毒感染等多種因素影響,有起病隱匿、惡化速度快等特點,患者發病早期多無特異性表現,隨癌細胞增殖可逐漸表現肝區疼痛、腹痛、黃疸、發熱等癥狀,此時就診患者多為中晚期,存在較高預后不良的可能[1]。臨床分期是指導原發性肝癌治療方法選擇的重要參考,根據《原發性肝癌診療規范(2017年版)》指示,我國原發性肝癌分期主要依據全身狀況、肝功能、肝外轉移、血管侵犯、腫瘤數目、腫瘤大小6個方面分為Ⅰa-Ⅳ期,其中以存在肝外轉移的Ⅲb期以后不建議進行手術治療,因此術前明確患者病理分期具有重要意義[2]。臨床原發性肺癌診斷常見甲胎蛋白、超聲檢查、磁共振成像等檢查,雖然臨床研究顯示存在較高診斷效能,但對疑似患者仍需要經穿刺活檢證實或采取,可對患者造成一定創傷。微小RNA(MicroRNA,mi-RNA)是一類由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,近年隨基因組學發展,越來越多研究人員發現mi-RNA與腫瘤增殖、侵襲能力的關聯,同時有報道稱mi-RNA在肝硬化發展為肝癌過程中發揮重要作用,提醒其可作為診斷、治療原發性肝癌患者的生物標志物[3-4]。基于此本研究探討原發性肝癌患者血清miR-375、miR-155與臨床分期及預后的關系,旨在為臨床診療積累經驗。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧我院2016年7月至2021年7月間收治的86例原發性肝癌患者資料,其中男性55例,女性31例;年齡45～76歲,平均(55.12±3.48)歲;肝炎病史25例,肝硬化病史17例;平均甲胎蛋白(874.38±29.76)ng/mL;體力活動狀態(performance status,PS)評分:0分13例,1分34例,2分28例,3分10例,4分1例;Child-Pugh肝功能分級:A級34例,B級50例,C級2例;腫瘤數量:單發20例,多發66例;臨床分期(china liver cancer staging,CNLC):Ⅰa期5例,Ⅰb期18例,Ⅱa期13例,Ⅱb期15例,Ⅲa期15例,Ⅲb期7例,Ⅳ期13例;所有患者肺癌類型均為肝細胞癌。兩組均對研究知情同意。

納入標準:①年齡>18歲;②符合《原發性肝癌診療規范(2017年版)》中診斷標準[2],經病理學檢查確診;③首次確診;④臨床資料完整。排除標準:①活動性肝炎;②合并其他器官系統惡性腫瘤;③入院前接受相關治療。

1.2 檢測方法

入院時取患者外周靜脈血5 mL,常溫靜置30 min,以3000 rpm轉速離心10 min分離血清保存至-80 ℃冰箱備用。取500 μL血清利用TRIzol RNA試劑盒提取總RNA,應用分光光度計檢測RNA濃度、純度,結果A260/A280在1.8～2.0判定RNA正常。使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA并取2 μg進行實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)擴增,反應參數:94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30s,循環40次,結果利用2-ΔΔCt法計算血清miR-375、miR-155表達量。

1.3 評價指標

①將患者依據《原發性肝癌診療規范(2017年版)》中診斷流程臨床分期(Ⅰ～Ⅳ期),統計各分期患者血清miR-375、miR-155表達水平,應用Spearman相關系數做臨床分期與血清miR-375、miR-155表達水平相關性分析。②將患者依據是否存在肝外轉移分為轉移組(臨床分期Ⅰa～Ⅲa期)、非轉移組(臨床分期Ⅲb～Ⅳ期),比較兩組患者血清miR-375、miR-155表達水平,應用受試者曲線(ROC)分析診斷臨床分期的效能。③將患者依據ROC曲線所得截斷值,將患者分為miR-375高表達、低表達,miR-155高表達、低表達,比較不同表達水平患者預后(平均生存時間),采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。④應用COX比例風險模型分析影響患者預后獨立影響因素。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 不同臨床分期患者血清miR-375、miR-155表達水平比較

不同臨床分期患者血清miR-375、miR-155表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 不同臨床分期患者血清miR-375、miR-155表達水平比較

2.2 血清miR-375、miR-155表達水平與臨床分期的相關性分析

血清miR-375表達水平與臨床分期呈負相關(P<0.05),miR-155表達水平與臨床分期呈正相關(P<0.05),見表2、圖1、2。

圖1 血清miR-375表達水平與臨床分期的相關性

圖2 血清miR-155表達水平與臨床分期的相關性

表2 血清miR-375、miR-155表達水平與臨床分期的相關性參數

2.3 血清miR-375、miR-155表達水平診斷腫瘤轉移的ROC曲線

轉移組血清miR-375表達水平低于非轉移組,miR-155表達水平高于非轉移組,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。血清miR-375、miR-155表達水平及聯合診斷腫瘤轉移的AUC分為0.898、0.847、0.941,見表4、圖3。

圖3 血清miR-375、miR-155診斷腫瘤轉移的ROC曲線

表3 轉移組與非轉移組患者血清miR-375、miR-155表達水平比較

表4 血清miR-375、miR-155診斷腫瘤轉移的ROC參數

2.4 不同血清miR-375、miR-155表達水平患者預后比較

以ROC曲線所得截斷值劃分患者血清miR-375、miR-155表達水平高低,其中miR-375高表達49例,低表達37例,miR-155高表達41例,低表達45例。miR-375高表達患者平均生存時間均長于miR-375低表達患者,miR-155高表達患者平均生存時間均短于miR-155低表達患者,差異有統計學意義(P<0.05),見表5,圖4、5。

圖4 不同血清miR-375表達水平患者的生存曲線

圖5 不同血清miR-155表達水平患者的生存曲線

表5 不同血清miR-375、miR-155表達水平患者預后比較

2.5 患者預后影響因素分析

血清miR-375、miR-155表達水平是患者預后獨立影響因素(P<0.05),其中miR-375表達水平為獨立保護因素,miR-155表達水平為獨立危險因素,見表6。

表6 患者預后影響因素分析

3 討論

原發性肝癌高發病率、高死亡率、預后差的特點是對居民健康的巨大威脅,盡早診治、及時治療是挽救患者生命的關鍵環節。基于生命科學的蓬勃發展,從基因層面診療肝癌逐步應用開來,其中mi-RNA近年來受到臨床廣泛關注。mi-RNA是廣泛存在于動植物體內的進化上高度保守且具有良好穩定性的內源性非編碼小分子單鏈RNA,其不僅能參與人體生長發育、調節生命活動,而且有多項報道說明其在惡性腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用[5],更有學者認為其可能成為改善腫瘤耐藥的新靶點[6]。本研究以原發性肝癌患者為對象探究血清miR-375、miR-155與臨床分期,發現二者表達水平與患者臨床分期存在關聯,提醒miR-375、miR-155參與原發性肝癌疾病發展過程。

miR-375是人染色體2q35區上cryba2和Cadc108基因區域間的片段,有多位學者發現其可在胃癌、食管癌等多種惡性腫瘤中異常表達。在本研究中可見隨患者臨床分期升高miR-375表達水平逐漸下降,推測其與抑制癌細胞生長相關,次結論在He等[7]動物模型中已有證實,其研究團隊將miR-375模擬物結合到肝癌小鼠模型的AEG-1位點發現可抑制腫瘤生長。臨床有研究生物信息學篩選出多種參與肝細胞癌進展的核心基因,其中非染色體結構維護凝縮蛋白Ⅰ復合體G亞基(NCAPG)被認為在肝癌細胞中異常高表達,與不良預后直接相關[8],而在Dai等[9]研究中發現miR-375與NCAPG2存在靶向關系,補充miR-375可下調NCAPG2表達水平從而抑制肝癌細胞增殖和遷移且誘導其細胞凋亡。本研究以肝外轉移為依據將患者分組比較miR-375表達表達水平,發現二組存在顯著差異,證明術前利用血清miR-375檢查診斷原發性肝癌患者肝外轉移的可能性,據臨床診療指南建議,肝外轉移Ⅲb期以上患者不建議行手術治療,因此術前檢查血清miR-375有助于治療選擇,避免患者額外損傷。此外經生存分析可見,血清miR-375低表達患者平均生存期更短,是患者預后不良的獨立影響因素,再次提醒原發性肺癌患者診療過程中血清miR-375的應用前景。

本研究結果中顯示原發性肝癌患者血清miR-155表達水平與臨床分期正相關,考慮其在肝癌細胞增殖遷移中發揮推動作用。miR-155促腫瘤發展最初見于淋巴瘤研究中,發現其過量表達可使外周血CD8+T細胞減少并抑制T細胞受體信號傳導,從而推動淋巴瘤進展[10]。在肝臟相關活動中,Wang等[11]研究發現HBeAg可通過誘導巨噬細胞過量表達miR-155,利用其促進炎性細胞因子的產生的機制來加速肝損傷。而乙肝病毒感染引起的免疫反應、慢性炎癥正是誘發原發性肝癌的重要危險因素[12],可見miR-155高表達參與的炎癥可能推動癌變進程。此外,Xin等[13]研究人員發現miR-155通過抑制肝癌細胞中的H3F3A促進CDK2的磷酸化修飾進而競爭性抑制P21WAF1/CIP1的轉錄和翻譯,達到促腫瘤發生的作用,值得一提的該研究團隊發現過量的P21WAF1/CIP1可抵消miR-155的癌變功能,可能成為未來治療肝癌的方向。本研究結果顯示血清miR-155檢測存在較高診斷肝外轉移的效能,特異度可達95.00%且與miR-375聯合診斷可明顯提高敏感度至86.36%。而經生存分析顯示,血清miR-155高表達是原發性肝癌患者預后不良的危險因素,表達水平更高的患者存在更短的平均生存時間,考慮與miR-155參與腫瘤細胞化療藥物耐藥機制相關。雖然miR-155表達與肝癌患者化療耐藥關聯的報道較少,但其在其他癌癥耐藥中的作用報道逐漸增多,胡波等[14]研究顯示吉非替尼獲得性耐藥非小細胞肺癌患者中miR-155表達異常高表達,可能與預后相關。而黃惠敏等[15]發現在急性淋巴細胞白血病患兒中過量的miR-155可通過激活Wnt/β-Catenin信號通路,促進腫瘤細胞增殖,從而抑制凋亡,導致化療耐藥。

綜上所述,原發性肝癌患者體內存在miR-375、miR-155異常表達,二者水平與臨床分期、預后存在明顯關聯,可作為治療前分期診斷生物指標,對后續治療方法選擇存在一定指導意義,疾病管理中監測二者表達水平有助于預后判斷。