高效液相色譜法測定保心寧膠囊中7個指標性成分的含量

鞏長芹，卞常芝，毛傳偉，孫永喜

（1.臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 276001；2.臨沂天源中藥飲片有限公司，山東 臨沂 276000；3.翔宇藥業(yè)股份有限公司，山東 臨沂 276023）

保心寧膠囊是由丹參干浸膏、當歸干浸膏、枳殼干浸膏及三七藥材粉末加入生姜水煎濃縮液組成的中藥復方膠囊劑，具有活血化瘀，行氣止痛之功效，用于心絞痛，心律失常，改善冠心病癥狀等[1]。其標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十一冊，僅有性狀、紫外光譜鑒別、化學反應鑒別和檢查項，無含量測定項，不能有效控制該產(chǎn)品的內(nèi)在質量。通過檢索文獻，發(fā)現(xiàn)目前已有對本制劑中的某些成分進行含量測定的報道[2-4]，但不能全面監(jiān)測本制劑的質量。本文以丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B和丹參酮IIA7個指標性成分為檢測目標，進行含量測定，為本制劑的內(nèi)在質量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（配備Agilent 1260四元泵，Agilent 1260 DAD檢測器，Agilent四元在線脫氣機，Agilent Chemstation工作站），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（美國安捷倫科技公司）；XS 205DU電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（默克公司）。

1.2 藥品與試劑

保心寧膠囊（翔宇藥業(yè)股份有限公司，批號：200201，201001，210301，210302，210303，210901，210902，210903，220101）。丹參素鈉對照品（批號：110855-201915，含量以97.8 %計），柚皮苷對照品（批號：110722-202116，含量以93.5%計），橙皮苷對照品（批號：110721-202019，含量以95.3%計），新橙皮苷對照品（批號：111857-201804，含量以99.4 %計），迷迭香酸對照品（批號：111871-202007，含量以98.1%計）、丹酚酸B對照品（批號：111562-201917，含量以96.6 %計），丹參酮IIA對照品（批號：110766-202022，含量以98.9 %計）等均購自中國食品藥品檢定研究院，均為供含量測定用；甲醇、乙腈均為色譜純（默克公司），磷酸為色譜純[阿拉丁試劑（上海）有限公司]，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAXSB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表1）；流速；1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：283 nm（0～50 min，檢測丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B），270 nm（50～70 min，檢測丹參酮IIA）；進樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取丹參素鈉對照品19.12 mg、柚皮苷對照品38.40 mg、橙皮苷對照品10.75 mg、新橙皮苷對照品28.53 mg、迷迭香酸對照品11.19 mg、丹酚酸B對照品29.08 mg、丹參酮IIA對照品11.30 mg，分別置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，均作為各自的對照品儲備液。

分別精密量取丹參素鈉對照品儲備液5 ml、橙皮苷對照品儲備液5 ml、迷迭香酸對照品儲備液5 ml、丹參酮IIA對照品儲備液5 ml、柚皮苷對照品儲備液10 ml、丹酚酸B對照品儲備液10 ml、新橙皮苷對照品儲備液10 ml，置同一50 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取保心寧膠囊10粒，精密稱定內(nèi)容物重量，混勻，研細，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的配制 按保心寧膠囊的處方和工藝要求，分別制備缺少丹參和枳殼的陰性樣品，按2.2.2項下方法制成陰性溶液。

2.3 干擾試驗

分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析。結果在供試品色譜圖中，呈現(xiàn)與混合對照品保留時間一致的特征峰，陰性溶液未呈現(xiàn)與對照品保留時間一致的特征峰，說明陰性樣品對所測組分沒有干擾，理論塔板數(shù)均大于10 000；7種成分的分離度均大于2.0。色譜圖見圖1。

圖1 干擾試驗HPLC圖譜

2.4 線性關系

取混合對照品溶液0.2，0.5，1.0，2.5，4.0，5.0 ml，分別置5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列標準溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，計算回歸方程。結果見表2。

表2 回歸方程及其范圍

2.5 精密度

取2.2項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，進樣量為10 μl，記錄峰面積。結果丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA峰面積平均值分別為107.6，1030，152.9，922.7，64.37，363.6，215.6，RSD分別為0.73 %，0.59 %，0.71 %，0.47 %，0.88 %，1.19 %，1.03 %，表明儀器精密度較好。

2.6 重復性

分別精密稱取同一樣品6份（批號：210901），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，進樣量為10 μl。結果丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA峰面積平均值分別為106.3，1926，189.1，1830，64.81，636.5，294.3，平均含量分別為1.491，12.035，1.136，10.081，0.991，8.814，1.367 mg/粒；RSD分別為0.57 %，0.68 %，0.56 %，0.86 %，1.13 %，1.07 %，1.23 %，表明方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性

取同一樣品（批號：210901）溶液，置室溫中，分別在配制后0，2，4，6，8，10，12，24 h，進樣分析，進樣量為10 μl，記錄峰面積。結果丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA峰面積的平均值分別為105.9，1913，187.6，1807，65.67，621.7，289.8，RSD分別為0.27 %，0.49 %，0.57 %，0.90 %，0.94 %，1.67 %，1.09 %，表明供試品溶液24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗

取已知含量的同一樣品6份（批號：210901），精密稱取0.1 g，置具塞錐形瓶中，每份分別精密加入各對照品儲備液，分別為丹參素1 ml、柚皮苷3.5 ml、橙皮苷1 ml、新橙皮苷4 ml、迷迭香酸1 ml、丹酚酸B 3.5 ml、丹參酮IIA1.5 ml，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，進樣量為10 μl。結果見表3。結果顯示，方法準確度良好。

表3 加樣回收試驗結果（n=6）

2.9 含量測定

取9 批次保心寧膠囊（批號：200201，201001，210301，210302，210303，210901，210902，210903，220101），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，進樣量為10 μl，記錄各峰面積，按外標法計算含量，結果見表4。

表4 含量測定結果（n=2）

3 討論

3.1 波長的選擇

對丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA7種成分在190～400 nm進行DAD全波長掃描，得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種成分在283 nm、丹參素在280 nm、迷迭香酸和丹酚酸B在286 nm、丹參酮IIA在270 nm處各有最大吸收，但丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B 6種成分的最大吸收波長相差無幾，在283 nm處均有明顯吸收，因此選擇283 nm作為此6種成分的測定波長，選擇270 nm作為丹參酮IIA測定波長。

3.2 流動相的選擇

參考《中國藥典》和相關文獻[5-15]，確定采用梯度洗脫模式，并對流動相進行篩選，包括乙腈-0.1 %磷酸溶液、乙腈-0.4 %磷酸溶液、乙腈-0.2 %磷酸溶液、乙腈-20 %乙腈溶液（溶劑為含0.08 %十二烷基硫酸鈉的2.4 %冰醋酸）、甲醇-0.2 %甲酸溶液，結果以乙腈-0.1 %磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，7種成分峰形好，各峰分離度高，陰性樣品沒有干擾。

3.3 提取條件的選擇

參考相關文獻[2-21]，考察了50 %甲醇、70 %甲醇、甲醇、50 %乙醇、乙醇作為提取溶劑，以及提取溶劑的不同用量（20，25，50，100 ml）對提取效果的影響，結果用50 ml甲醇作為提取溶劑，提取率最高；考察了超聲時間（20，30，45，60 min）對提取率的影響，結果發(fā)現(xiàn)加入50 ml甲醇超聲處理30 min之后，測得的結果相差很小，故選擇加入50 ml甲醇超聲處理30 min提取樣品。