基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討長春新堿治療乳腺癌的作用機制

劉遠(yuǎn)亭，韓淑萍，劉 沙，楊證玉，何俊超，張燕琴*

（1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，四川 成都 610500；2.中國人民解放軍空軍第986醫(yī)院，陜西 西安 710054）

目前，乳腺癌不僅是最常見的惡性腫瘤之一，也是引起女性死亡的第二大癌癥[1-2]，嚴(yán)重威脅女性的身心健康，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。據(jù)我國流行病學(xué)資料顯示：我國的女性惡性腫瘤中，乳腺癌早期患者的生存率顯著高于晚期患者[3]，乳腺癌早期癥狀不明顯，確診后多數(shù)患者已處于疾病晚期[3-4]。因此治療乳腺癌的核心是早診斷和早治療。研究表明從雙子葉綱、龍膽目、夾竹桃科長春花中提取的雙吲哚型生物堿──長春新堿[5]（圖1），為應(yīng)用最廣的天然植物抗癌藥物，具有治療乳腺癌、惡性淋巴瘤和小細(xì)胞肺癌等疾病的作用[6]。乳腺癌發(fā)病機制繁瑣且復(fù)雜。本研究以乳腺癌為研究對象，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，選用生物信息學(xué)結(jié)合蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鍪侄危A(yù)測長春新堿治療乳腺癌的關(guān)鍵作用靶點，研究其可能的作用機制，為長春新堿治療乳腺癌提供理論基礎(chǔ)。研究流程見圖2。

圖1 長春新堿結(jié)構(gòu)

圖2 長春新堿治療乳腺癌作用機制的研究流程

1 儀器與材料

1.1 儀器

電泳儀（美國BIO RAD）；凝膠成像儀（美國BIO RAD）；酶標(biāo)儀（中國成都錦世昌祥科技有限公司）；生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific）；臺式冷凍離心機（德國Eppendorf）；移液器（德國Eppendorf）。

1.2 細(xì)胞和試藥

MCF-7乳腺癌細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；長春新堿（成都藝萌科技有限公司）。

1.3 軟件

Image JV1.8.0（正式版）軟件；Grapd Prism 8.3。

2 方法

2.1 長春新堿相應(yīng)靶點基因的收集與整理

查詢藥物長春新堿英文名稱，登錄pubchem服務(wù)器（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），查詢并下載藥物的2D分子結(jié)構(gòu)式（圖1），并儲存為“.sdf”格式，然后將sdf文件上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行分子與靶蛋白對接。利用uniport數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）將uniport ID轉(zhuǎn)化成Gene symbol，收集并整理長春新堿所有的靶點基因，刪除重復(fù)值。上傳靶點基因于STRING 11.0網(wǎng)站，將系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置為最低相互作用評分>0.4[7]，去除無關(guān)聯(lián)靶點且選擇物種為人，獲得蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖，并導(dǎo)出靶點蛋白互作關(guān)系表。

2.2 長春新堿-蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

利用網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.7.2繪制長春新堿-蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖[8]。其中長春新堿與靶蛋白用“節(jié)點”表示，而長春新堿與靶點之間的關(guān)系、靶點與靶點之間的關(guān)系用“邊”表示。

2.3 乳腺癌已知靶點的檢索及疾病蛋白PPI的繪制

本研究對乳腺癌靶點的檢索采用的是疾病數(shù)據(jù)庫──OMIM數(shù)據(jù)庫，查詢到疾病乳腺癌的準(zhǔn)確英文名稱為“Breast Carcinoma”，并將其作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以獲得疾病靶點，去重后保留剩余靶點。將靶點蛋白上傳于STRING 11.0網(wǎng)站[7]，設(shè)置最低相互作用評分>0.4，去除無關(guān)聯(lián)靶點且選擇物種為人，得到PPI圖，導(dǎo)出靶點蛋白互作關(guān)系表。

2.4 藥物-疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制和藥物-疾病關(guān)鍵靶點篩選

藥物-疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制主要采用Cytoscape軟件中的BisoGenet插件，將1.1項下獲得的長春新堿作用靶點和1.3項下獲得的乳腺癌已知靶點在BisoGenet插件中分別繪制出各自的PPI圖，并合并二者PPI圖，獲得長春新堿-乳腺癌的交集網(wǎng)絡(luò)。利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA篩選出長春新堿-乳腺癌交集網(wǎng)絡(luò)中網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)（Degree）大于中位數(shù)2倍的節(jié)點[9]，得到交集網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，再通過篩選以下幾個指標(biāo)如中介中心性（Betweenness），接近中心性（Closeness），特征向量（Eigenvector），網(wǎng)絡(luò)（Network）及局部邊連通性（Local average connectivity，LAC），最終得到其關(guān)鍵基因[10]。獲得的關(guān)鍵基因可能解釋長春新堿治療乳腺癌的直接或間接作用機制。

2.5 關(guān)鍵基因靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING 11.0網(wǎng)絡(luò)平臺，將2.4項下篩選的關(guān)鍵靶點蛋白進(jìn)行PPI圖的構(gòu)建，設(shè)置最低相互作用評分>0.4，去除無關(guān)聯(lián)靶點且選擇物種為人，得到靶點蛋白互作關(guān)系，運用 Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行繪圖和分析，網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)（Degree）大小可通過設(shè)置節(jié)點的顏色和大小來反映，連接評分（Combine score）的大小可通過設(shè)置邊的顏色和大小來反映，獲得最終的PPI圖，合理布局并調(diào)整獲得的PPI圖像。

2.6 功能富集分析和通路富集分析

利用軟件Cytoscape中的ClueGO分析插件[11]，將2.4項下篩選的關(guān)鍵靶點蛋白分別進(jìn)行功能富集及通路富集分析，并根據(jù)其重要程度繪制出占比餅狀圖和簇狀條形圖；其中富集分析的結(jié)果可通過節(jié)點的形式在ClueGO插件中展現(xiàn)，充分發(fā)揮其圖像化功能。同時采用同一種顏色的節(jié)點來表示同一類型的功能蛋白，而基因功能的顯著性通過節(jié)點大小來體現(xiàn)，若該基因功能上的節(jié)點越大，表明基因功能的顯著性越高，重要性也越強。

2.7 細(xì)胞培養(yǎng)及Western blot分析

凍存的MCF-7細(xì)胞37 ℃水浴解凍。細(xì)胞1000 r/min離心5 min后培養(yǎng)于含10 %小牛血清和1 %雙抗的高糖培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液一次，細(xì)胞密度達(dá)80 %左右開展實驗。采用不同濃度（50，100，200 nmol/L）的長春新堿處理細(xì)胞[12]，給藥1 d后提取細(xì)胞蛋白，常規(guī)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h后使用凝膠成像儀檢測灰度值，并利用Image JV1.8.0（正式版）軟件統(tǒng)計分析長春新堿對核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin-1，NPM1），DHX9，真核翻譯延伸因子 1（EEF1A）及HSP90表達(dá)的影響。

2.8 統(tǒng)計分析

用Grapd Prism 8.3軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并做柱狀圖。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表明具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 長春新堿的靶點

通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫獲得107個與長春新堿相關(guān)的預(yù)測靶點，見圖3，其中G蛋白偶聯(lián)受體（Family A G protein-coupled receptor）、蛋白酶（protease）、細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）等占比較大。

圖3 目標(biāo)蛋白概率圖

3.2 長春新堿-蛋白靶點-蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制和分析

結(jié)果見圖4。由圖4可見，互作網(wǎng)絡(luò)圖共存在108個節(jié)點和801個關(guān)系。通過對應(yīng)關(guān)系的數(shù)目和復(fù)雜程度，體現(xiàn)了長春新堿具有多靶點屬性，且蛋白靶點之間相關(guān)性較高。

圖4 長春新堿-蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖

3.3 乳腺癌相關(guān)基因分析和檢索

結(jié)果見圖5。由如圖5可見，使用疾病基因數(shù)據(jù)庫──OMIM最終得到506個相關(guān)靶點，表明疾病的靶點蛋白之間具有高度相關(guān)性。

圖5 乳腺癌的靶點蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 藥物-疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制及關(guān)鍵靶點的篩選

3.4.1 長春新堿治療乳腺癌的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖 長春新堿的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中有4067個靶點與長春新堿存在直接或間接作用，靶點與靶點之間存在115 447種聯(lián)系。乳腺癌的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖表明有5619個靶點與乳腺癌存在直接或間接作用，靶點與靶點的相互關(guān)系達(dá)141 283種。重合二者以上的網(wǎng)絡(luò)圖取交集網(wǎng)絡(luò)，獲得藥物-疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖6。如圖6所示，共得到3274個節(jié)點和86 930種關(guān)系。

圖6 長春新堿-乳腺癌蛋白靶點互作交集網(wǎng)絡(luò)圖

3.4.2 長春新堿-乳腺癌關(guān)鍵靶點的篩選 結(jié)果見圖7。由圖7可見，采用Cytoscape中的分析插件CytoNCA篩選出Degree大于中位數(shù)2倍的節(jié)點，即Degree>66，獲得814個節(jié)點和34 869條邊的黃色圖，再通過篩選以下幾個指標(biāo)大于中位數(shù)的節(jié)點，即Betweenness>345.76，Closeness>0.518，Degree>107，Eigenvector>0.023，Network>20.158，LAC>18.497，獲得262個節(jié)點和10 088條邊的紅色圖，再繼續(xù)篩選大于中位數(shù)的節(jié)點，即Betweenness>989.16，Closeness>0.541，Degree>174，Eigenvector>0.047，Network>29.726，LAC>39.159，獲得70個節(jié)點和1246條邊的最終關(guān)鍵靶點互作圖。

圖7 關(guān)鍵靶點篩選圖

3.5 長春新堿-乳腺癌關(guān)鍵蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制與分析

將以上篩選的70個關(guān)鍵基因?qū)隨TRING 11.0網(wǎng)絡(luò)平臺，分析后獲得關(guān)鍵基因互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。如圖8所示，關(guān)鍵蛋白利用節(jié)點表示，蛋白之間的關(guān)聯(lián)采用邊表示，其靶點蛋白Degree的值利用節(jié)點大小表示，節(jié)點越大表明該靶點蛋白的Degree值越大，體現(xiàn)該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越高。靶點蛋白之間的連接評分（combine score）值大小用邊的粗細(xì)反映，邊越粗表明靶點蛋白之間combine score值越大，蛋白間的直接相關(guān)性也越強。該網(wǎng)絡(luò)圖共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)70個，表明有70個關(guān)鍵靶點蛋白，靶點蛋白之間的相互聯(lián)系達(dá)525種，且關(guān)鍵靶蛋白之間有強烈的相關(guān)性。關(guān)鍵靶點基因及蛋白見表1。

圖8 關(guān)鍵基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

3.6 藥物-疾病關(guān)鍵靶點富集分析

3.6.1 功能富集分析 對以上70個靶點蛋白進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果見圖9、圖10。由圖9、圖10可見，生物過程中富集較為集中的為：白介素7（IL-7）介導(dǎo)的信號通路、mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物、蛋白質(zhì)定位于線粒體的正向調(diào)控等；分子功能富集較為集中的為：泛素蛋白連接酶、細(xì)胞對淀粉樣蛋白的反應(yīng)等，而對于細(xì)胞組分無關(guān)鍵特征功能。

圖9 GO富集分析圖

圖10 Cluego-GO富集網(wǎng)絡(luò)圖

3.6.2 通路富集分析 利用Cytoscape中的ClueGO 插件將70個關(guān)鍵靶點進(jìn)行通路富集分析。其中P<0.05的生物通路共有13條，通路富集分析的結(jié)果在ClueGO插件中以節(jié)點的形式展現(xiàn)，節(jié)點大小顯示信號通路的顯著性，節(jié)點越大，該通路的重要性越高，見圖11、圖12。由圖11、圖12可見，長春新堿治療乳腺癌的機制主要與癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)，細(xì)胞周期，抗原處理和遞呈，軍團菌病，泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用，剪切體，DNA復(fù)制等信號通路有關(guān)，表明長春新堿具有作用途徑廣的特點。

圖11 KEGG富集分析圖

圖12 ClueGO-KEGG富集簇狀圖

3.7 長春新堿下調(diào)NPM1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達(dá)

結(jié)果見圖13。由圖13 可見，與正常組比較，用200 nmol/L濃度的長春新堿處理細(xì)胞后，NMP1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達(dá)均下調(diào)（P<0.05），100 nmol/L濃度長春新堿處理組僅NMP1及DHX9蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05），50 nmol/L長春新堿處理細(xì)胞后NMP1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達(dá)無明顯變化（P>0.05）。

圖13 長春新堿對乳腺癌細(xì)胞MCF-7中NPM1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達(dá)的影響

4 討論

長春新堿通過干擾細(xì)胞微管蛋白代謝達(dá)到抗腫瘤作用。研究顯示，乳腺癌的增殖分化過程與多種因素相關(guān)，包括基因突變、基因表達(dá)及蛋白豐度的變化[12-14]。乳腺癌發(fā)病機制繁瑣且復(fù)雜，對其系統(tǒng)性的分析不足。長春新堿雖已報道可用于乳腺癌的治療，但針對長春新堿治療乳腺癌的具體靶點研究較少。因此本研究以長春新堿和乳腺癌為研究對象，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測長春新堿治療乳腺癌的關(guān)鍵作用靶點。

首先針對長春新堿繪制長春新堿-蛋白靶點的互作網(wǎng)絡(luò)圖及蛋白與蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)圖，共獲得108個相關(guān)靶點與801個互作關(guān)系。以上結(jié)果表明，長春新堿具有多靶點效應(yīng)且靶點之間存在協(xié)同互作關(guān)系，對于乳腺癌的病理進(jìn)程可能發(fā)揮著不同作用，合并網(wǎng)絡(luò)圖后證明長春新堿確實具有治療乳腺癌的潛力。

其次從功能富集結(jié)果分析可知，IL-7在結(jié)果中占比較高。IL-7主要由樹突狀細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和皮膚角化細(xì)胞等分泌[15-18]，參與機體多種生理及病理反應(yīng)，維持著機體正常的免疫功能。IL-7可引起惡性腫瘤的發(fā)生和增殖，通過wortmannin敏感徑路引起乳腺癌細(xì)胞的生長繁殖[19]。故通過調(diào)控IL-7介導(dǎo)的信號通路可抑制乳腺癌的生命活動。mRNA也在結(jié)果中占據(jù)較高比例，可通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)運及翻譯等過程，參與到腫瘤的病理進(jìn)程中，從而影響乳腺癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成[20]。組織相容性復(fù)合物II（major histocompatibility complex class II，MHC II）類分子的主要作用是協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的關(guān)系，長春新堿可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的MHC II類分子，從而調(diào)節(jié)機體免疫功能以增強對乳腺癌的免疫效應(yīng)[21]。

且從通路富集結(jié)果分析可知，首先影響乳腺癌生命活動的信號通路為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)通路，此過程導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)錄發(fā)生時間無法控制，引起癌細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生異常。長春新堿主要通過作用在轉(zhuǎn)錄失調(diào)的靶點，以緩解異常基因的表達(dá)，從而影響乳腺癌異常的生命活動[22]。其次是癌細(xì)胞細(xì)胞周期的失控，細(xì)胞增殖失控是惡性腫瘤最重要的特征之一[23]，維持細(xì)胞周期的正常次序及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定可防止惡性腫瘤形成[24]。再者乳腺癌易發(fā)生肺、骨和腦轉(zhuǎn)移[25-26]，且惡性腫瘤更易借助淋巴系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)移[27]，故可通過增強抗原遞呈細(xì)胞的調(diào)控來加快乳腺癌細(xì)胞的滅活。泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解對癌細(xì)胞的生長進(jìn)程調(diào)控也具有重要影響，泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解中的去泛素化生理過程，對癌癥治療有一定積極作用[28-29]。去泛素化是通過多步反應(yīng)后將泛素小分子從目的蛋白上剝離，可通過去泛素化來抑制降解目標(biāo)蛋白質(zhì)，從而影響乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[30]。剪切體雖不會翻譯出任何蛋白，但其特異性表達(dá)的可變剪接產(chǎn)物，可通過參與乳腺癌的發(fā)生、激活侵襲和轉(zhuǎn)移等生理進(jìn)程，對乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生積極作用[31-32]。

長春新堿也具有通過調(diào)控DNA復(fù)制來影響乳腺癌細(xì)胞增殖和分化的作用。為進(jìn)一步探討長春新堿治療乳腺癌的作用機制，采用不同濃度的長春新堿處理MCF-7后，檢測MCF-7中NPM1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達(dá)，均下調(diào)。NPM是一類穿梭于核仁、核質(zhì)和胞質(zhì)的細(xì)胞磷酸化蛋白，參與核糖體的合成、染色體的復(fù)制及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，與細(xì)胞的生長、增殖密切相關(guān)，且與乳腺癌的發(fā)生有重要關(guān)系[33]。DHX9參與了多個細(xì)胞進(jìn)程,調(diào)節(jié)細(xì)胞不同階段的基因表達(dá),提高DNA復(fù)制的保真性和效率,以此維持基因的穩(wěn)定[34-35]，因此DHX9蛋白功能異常可能導(dǎo)致疾病、腫瘤的發(fā)生。乳腺癌1號基因 （breast cancer 1，BRCA1）可抑制乳腺癌的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)DHX9可與BRCA1結(jié)合，當(dāng)DHX9過表達(dá)時，內(nèi)源性BRCA1的正常功能被抑制，從而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[36]，相同的，DHX9也能與乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer-1，DBC1）相結(jié)合，該基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，與DHX9結(jié)合后，表達(dá)降低[37]，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。EEF1A與翻譯機制密切相關(guān)，且在乳腺癌等多種腫瘤中顯著上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[38-39]。HSP90參與癌癥信號的傳導(dǎo)，且具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞分裂和促進(jìn)血管生成等作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[40]。研究發(fā)現(xiàn)，對比健康人群，乳腺癌患者血漿中的HSP-90α高表達(dá)[41]。實驗結(jié)果顯示，長春新堿處理MCF-7后NPM1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示長春新堿可能通過調(diào)節(jié)這幾個蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生對乳腺癌的抑制生長或促進(jìn)凋亡作用。

綜上，乳腺癌細(xì)胞的代謝方式和途徑存在相互作用和相互聯(lián)系，長春新堿可通過影響乳腺癌細(xì)胞的生物過程，包括IL-7介導(dǎo)的信號通路、mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體等，也能作用于分子功能如蛋白質(zhì)泛素化、細(xì)胞對淀粉樣蛋白的反應(yīng)等，且通過對癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)，細(xì)胞周期，抗原處理和遞呈，軍團菌病，泛素介導(dǎo)蛋白水解，剪切體，DNA復(fù)制等相關(guān)通路的調(diào)控影響癌細(xì)胞生命活動。故此在治療乳腺癌上應(yīng)針對疾病病因、機體內(nèi)環(huán)境、代謝方式等，進(jìn)行多方位、多靶點、多通路干預(yù)。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，為后續(xù)進(jìn)一步的機制探討奠定了重要的理論基礎(chǔ)，使實驗研究更加具備合理性。