超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜鑒定三七極細(xì)粉中化合物及其口服吸收代謝成分

邱 慧，徐 倩，黃 霞，汪保林

（1.南昌市洪都中醫(yī)院 制劑中心，江西 南昌 330008；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，江西 南昌 330006）

中藥三七為五加科植物三七[Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根和根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，臨床主要用于咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外傷出血，胸腹刺痛，跌撲腫痛[1]。三七在中醫(yī)藥中的臨床應(yīng)用有著十分悠久的歷史，《醫(yī)門密旨》、《跌損妙方》及《本草綱目》均有記載[2]，其根、莖、葉、花均可入藥，是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，是云南白藥、片仔癀、復(fù)方三七口服液及復(fù)方丹參滴丸等常見中成藥中的主要組成藥材。在民間用藥中，三七經(jīng)常被加工成極細(xì)粉，直接以溫水送服，用于治療中老年心腦血管疾病及跌打損傷等。目前，從三七中分離得到的化合物有百余種，主要以皂苷類成分為主，此外還有少量的黃酮、多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)及炔、醇類物質(zhì)，其中皂苷類成分和三七素為主要活性成分[3-4]。目前關(guān)于三七代謝研究僅有少量報道，且主要針對三七中的主要活性物質(zhì)人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的代謝研究[5-7]，迄今未見有關(guān)三七極細(xì)粉成分與人體口服吸收代謝的研究報道。本研究基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q Exactive HRMS）定性分析技術(shù)，對三七極細(xì)粉乙醇提取物、三七極細(xì)粉口服吸收入血成分及尿液成分進(jìn)行定性分析，并初步探討其口服吸收代謝特征。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜儀（美國Dionex公司）；Q-Exactive型四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XS105DU和ME204E電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Vortex-Genie2型渦旋混勻器（德國IKA公司）。

1.2 材料

人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-202034），人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-202129），三七皂苷R1對照品（批號：110745-201921），人參皂苷Re對照品（批號：110754-202129）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸（HPLC級，阿拉丁）；甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck公司）；純凈水（廣州屈臣氏）；其他試劑均為分析純。實(shí)驗用藥材三七購自樟樹市慶仁中藥飲片有限公司（批號：20200609，產(chǎn)地：云南），經(jīng)本院制劑中心制成極細(xì)粉（批號：20210527）。

1.3 研究對象

健康男性受試者3名，年齡：30～40歲，體重：50～68 kg，空腹給藥，采集樣本后進(jìn)食。受試者經(jīng)病史詢問，并經(jīng)肝腎功能、尿常規(guī)和心電圖檢查證實(shí)無異常，無吸煙及嗜酒史，在兩周內(nèi)未服用其他藥物，且每位受試者在實(shí)驗前被告知試驗內(nèi)容，并經(jīng)同意后簽署知情同意書。

2 方法

2.1 UHPLC Q-Exactive HRMS條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：0.1 %甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，5 %B；3 min，19 %B；20 min，19 %B；60 min，40 %B；75 min，95 %B；82 min，95 %B；84 min，5 %B；90 min，5 %B）；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：2 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 加熱電噴霧離子源（HESI），負(fù)離子模式，噴霧電壓：3.0 kV（-），離子傳輸管溫度：320 ℃，S-Lens出口透鏡電壓：60 V；霧化氣流量：30 μl/min，輔助氣：溫度300 ℃，流量10 μl/min。掃描方式選擇全掃/二級質(zhì)譜掃描模式，F(xiàn)ull MS中，分辨率為70 000半峰全寬（FWHM），自動增益控制目標(biāo)離子數(shù)（AGC target）為3×106，允許最大離子注入時間（Maximum IT）為100 ms，離子掃描范圍：m/z150～1500；ddMS2中，分辨率為17 500 FWHM，AGC target為1×105，Maximum IT為50 ms，離子掃描范圍：m/z200～1500。

2.2 三七極細(xì)粉供試品溶液的制備

稱取三七極細(xì)粉適量，置于錐形瓶中，稱定重量，加入10倍量95 %乙醇，加熱回流提取30 min，冷卻至室溫，稱定重量，用95 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，高速離心（12 000 r/min，10 min），上清用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Re對照品各約5 mg，精密稱定，分別置于50 ml量瓶中，加95 %乙醇定容至刻度，得對照品儲備溶液；精密移取各對照品儲備溶液100 μl，置于同一10 ml量瓶中，加95 %乙醇定容至刻度，即得混合對照品溶液（終濃度約為1 μg/ml）。

2.4 生物樣本采集與前處理

2.4.1 血漿、尿液樣本采集 給藥前，采集空白血漿與尿液。受試者空腹口服三七極細(xì)粉2 g，適量溫水送服，分別于0.5，1，1.5，2，4，6，12 h使用采血管于手靜脈處采血2 ml，取血后4000 r/min、4 ℃下離心5 min，取上層血漿。此外，給藥后收集1～4 h、4～8 h、8～12 h尿液，均保存于-80 ℃冰箱中備用。

2.4.2 生物樣本前處理 血漿樣本：取2.4.1項下空白血漿及各時間點(diǎn)含藥血漿各100 μl，加300 μl甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，14 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上層清液，常溫氮?dú)獯蹈?，?0 %甲醇100 μl復(fù)溶，渦旋混勻1 min，14 000 r/min、4 ℃下再次離心10 min，取上清，進(jìn)樣測定。尿液樣本：取2.4.1項下空白尿液及給藥后各時間段尿液各100 μl，加甲醇300 μl，渦旋2 min，14 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上層清液進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 UHPLC Q-Exactive HRMS色譜特征分析

三七極細(xì)粉主要包含皂苷類成分，此外，尚含少量的黃酮苷類成分，為鑒定其詳細(xì)的化學(xué)成分及其經(jīng)人體口服給藥后血液和尿液中吸收的成分及代謝產(chǎn)物，本研究將三七極細(xì)粉的提取物、給藥后的血液與尿液3種樣本經(jīng)前處理后進(jìn)樣于UHPLC Q-Exactive HRMS系統(tǒng)，按2.1.2項下條件采集數(shù)據(jù)，最終得到不同樣本的基峰強(qiáng)度（BPI）色譜圖（見圖1）。

圖2 負(fù)離子模式下不同雙糖鏈的裂解特征

3.2 三七極細(xì)粉提取物成分鑒定

基于UHPLC Q-Exactive HRMS準(zhǔn)分子離子和加荷離子等信息，運(yùn)用Xcalibur定性分析軟件獲得目標(biāo)化合物的保留時間（tR）、精確相對分子質(zhì)量及二級裂解碎片等質(zhì)譜信息，對各色譜峰進(jìn)行初步推測，并對比已知對照品質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，最終確定各色譜峰化合物結(jié)構(gòu)。共鑒定出41各化合物，其中皂苷類成分38個，黃酮苷類成分3個?；衔锛皻w屬信息詳見表1。

表1 三七極細(xì)粉醇提物化學(xué)成分鑒定結(jié)果

質(zhì)譜分析中，關(guān)于糖鏈部分，2個六碳醛糖（如2個葡萄糖）或六碳醛糖與甲基五碳醛糖（如葡萄糖與鼠李糖）或六碳醛糖與五碳醛糖（如葡萄糖與阿拉伯糖或木糖）相連可在負(fù)離子模式下相應(yīng)出現(xiàn)m/z221.07，205.07和191.06的離子峰；此外，葡萄糖主要裂解為m/z161.04，113.02，101.02，179.05等碎片離子。關(guān)于苷元部分，由于皂苷類成分的苷元四元環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易裂解產(chǎn)生二級碎片離子，然其C-17支鏈在強(qiáng)電壓下可進(jìn)行一定程度的裂解形成相應(yīng)的碎片離子，可進(jìn)一步確定化合物的結(jié)構(gòu)。關(guān)于黃酮苷類成分，由于苷元具有逆迪爾斯-阿爾德（RDA）裂解特點(diǎn)，易于解析。本研究主要根據(jù)苷元結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行初步分類，分別解析各色譜峰對應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)。

峰1：UHPLC Q-Exactive HRMS數(shù)據(jù)顯示其保留時間為6.28 min，一級準(zhǔn)分子離子為m/z625.1412，提示分子式為C27H30O17（[C27H30O17]-：計算值為625.1410）。準(zhǔn)分子離子m/z625.1412中性丟失糖基（C12H22O10）產(chǎn)生碎片離子m/z300.0277，提示為二葡萄糖取代。其余碎片離子m/z271.0250，255.0299，243.0298和151.0022與槲皮素裂解碎片一致[8]。因此，推測峰1的結(jié)構(gòu)為槲皮素-3-O-槐糖苷。此外，根據(jù)峰2的一級與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，同樣推測出峰2的結(jié)構(gòu)為山奈酚-3-O-β-D-半乳糖（6→1）β-D-葡萄糖苷。

峰3：在二級質(zhì)譜圖中，觀察到甲基取代信號，其他碎片離子與槲皮素裂解碎片一致，再結(jié)合mzCloud數(shù)據(jù)庫，推測出峰3的結(jié)構(gòu)為7-甲基槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2→1）β-D-木糖苷。

峰7～9：高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示其一級準(zhǔn)分子離子[M+HCOOH-H]-分別為m/z977.5331，845.4910和991.5501，其二級碎片中均可觀察到中性丟失m/z46.01（HCOOH）的碎片離子，提示為母離子與甲酸的加和離子，因此其對應(yīng)分子式分別為C47H80O18、C42H72O14和C48H82O18。在二級碎片離子中，均可觀察到苷元離子m/z475.3787及其C-17支鏈斷裂后形成的碎片離子m/z391.2861，提示均為原人參三醇型三萜皂苷。根據(jù)糖苷鍵連接位置不同及不同糖分子量差異等信息推測峰7～9的結(jié)構(gòu)分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re。峰7～9的保留時間、一級及二級質(zhì)譜碎片離子與對照物質(zhì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re相一致，進(jìn)一步確證了峰7～9的結(jié)構(gòu)。峰4～6、峰10～16、峰19及峰27的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)中均存在苷元離子m/z475.38及其C-17支鏈斷裂后形成的碎片離子m/z391.29，表明其苷元均為原人參三醇型三萜皂苷。根據(jù)糖苷鍵的裂解信息及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[8]，推測峰4～6、峰10～16、峰19及峰27的結(jié)構(gòu)見表1。

峰20：在二級質(zhì)譜圖中，觀察到m/z459.3873和失去C-17支鏈的m/z375.2899碎片離子，提示為原人參二醇型皂苷，其保留時間、一級及二級碎片信息與人參皂苷Rb1對照品一致，因此推測峰20為人參皂苷Rb1。同樣，峰17、18、峰21～24、峰26、峰28～34及峰38～40中均含m/z459.39和375.29的碎片離子，提示可能為原人參二醇型皂苷。再根據(jù)糖鏈斷裂所產(chǎn)生的碎片離子并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[8]，分別推測上述不同色譜峰的結(jié)構(gòu)，見表1。

峰25、峰35～37及峰41，首先根據(jù)一級質(zhì)譜中的離子信息推測該分子的元素組成，得分子式，然后以分子式在PubChem網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中查詢可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)最終確定對應(yīng)化合物的結(jié)構(gòu)，具體結(jié)果見表1。

3.3 生物樣本原型及代謝物成分鑒定

通過與空白血漿、尿液進(jìn)行比對，給藥后在血漿和尿液樣本中均未檢測出各化學(xué)成分的原型及代謝產(chǎn)物。

4 結(jié)論

本研究通過采用UHPLC Q-Exactive HRMS技術(shù)對三七極細(xì)粉醇提物中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，共鑒定了41個化合物，其中3個為黃酮苷，另38個為皂苷類成分。健康男性口服正常劑量后，在不同時間點(diǎn)或時間段內(nèi)的尿液中均未檢出原型及代謝物。究其原因，可能與以下三點(diǎn)因素有關(guān)：首先，可能由于人體常規(guī)口服劑量，吸收入血后不足以被檢測到；其次，由于三七極細(xì)粉中的成分主要為皂苷類成分，在腸道上皮細(xì)胞及腸道菌群中被水解為極性較低的苷元，然后在肝臟中直接或代謝后經(jīng)膽汁排出；此外，由于這些代謝后的苷元類成分極性較低，在血液中不能以游離形式存在，可能主要分布于相關(guān)組織或臟器之中。以上觀點(diǎn)，后續(xù)需開展糞便成分檢測、動物水平的膽汁排放實(shí)驗或組織分布實(shí)驗加以驗證。

綜上，本試驗對三七極細(xì)粉醇提物中的化學(xué)成分進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的質(zhì)譜定性分析，同時對其人體口服吸收入血及尿液排泄情況進(jìn)行了初步研究，可為后續(xù)全面的活性物質(zhì)分析及定量指標(biāo)控制研究奠定基礎(chǔ)。