桑葉藥材蘆丁含量及其質量評價研究

鄧李紅，吳曉英，汪 梅，林偉雄，羅 毓，鄧 韜，孫冬梅*，陳仕妍

（1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；2.廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

桑葉為桑科植物桑（MorusalbaL.）的干燥葉，是我國首批認定的藥食同源中藥材品種[1]，最早記載于《神農本草經》，被列為中品，藥用始載于《五十二病方》[2]，性味甘、苦、寒，歸肺、肝經，具有疏散風熱，清肺潤燥，清肝明目的功效，多用于風熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花等癥[3]。桑葉資源豐富，在我國東北、西南、西北各省區均有栽培，中亞各國、歐洲、印度等地亦有栽培[1,4]。現代文獻研究表明，桑葉中主要含黃酮類、酚酸類、生物堿類、香豆素類、氨基酸類、多糖類等多種化學成分，其中黃酮類、生物堿類、多糖類化合物為桑葉的主要藥效成分[1,5-8]，具有降血糖、調血脂、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理作用[9-14]。《中國藥典》2020年版桑葉含量測定項下僅規定了單指標成分蘆丁的含量限度要求[3]，但桑葉作為多個化學成分的復合體，其多種成分都有明確的藥理活性報道[1]。高效液相（HPLC）指紋或特征圖譜則能較全面系統地反映桑葉整體化學成分的特征信息，因此采用含量測定和特征圖譜相結合的綜合評價方法更能體現桑葉藥材的內在質量。故本研究在測定蘆丁含量的基礎上，建立桑葉藥材HPLC特征圖譜，通過化學計量學分析方法、AHP層次分析法、CRITIC客觀權重賦值法及AHP-CRITIC復合加權法對特征圖譜多指標變量進行統計分析，結合Person相關系數法分析蘆丁含量與桑葉藥材色度值的相關關系，綜合評價34批桑葉藥材質量，以期為桑葉的質量控制提供新的參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ARC型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ-500DE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E型萬分之一天平，XP26百萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MiliQ Direct 8型超純水機（德國Merck）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 材料

新綠原酸對照品（質量分數99.58 %，批號：DSTDX001503），隱綠原酸對照品（質量分數99.30 %，批號：DST220104-035），蘆丁對照品（質量分數99.19 %，批號：DST210520-017），均購自成都樂美天醫藥科技有限公司；液相用甲醇，磷酸為色譜級，其他試劑為分析純，水為超純水。34批桑葉藥材（編號：S1～S34）經廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥葉，來源信息詳見表1。

表1 34批桑葉藥材來源信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇（A）-0.1 %磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，15 %A；5～20 min，15 %A～30 %A；20～40 min，30 %A～60 %A；40～42 min，60 %A～15 %A；42～47 min，15 %A）；柱溫30 ℃；檢測波長358 nm；體積流量1.0 ml/min；進樣體積10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

取新綠原酸、隱綠原酸和蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含新綠原酸39.04 μg/ml、隱綠原酸24.83 μg/ml和蘆丁22.42 μg/ml的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇10 ml，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，取出放冷，再稱定重量，用50 %甲醇補足減失重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取桑葉供試品溶液，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，以6號蘆丁峰為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.00 %～0.09 %，0.21 %～1.39 %，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取桑葉供試品粉末適量，按2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以6號蘆丁峰為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.00 %～0.11 %，0.27 %～1.09 %，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取桑葉供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，以6號蘆丁峰為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.00 %～0.17 %，0.27 %～2.99 %，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 HPLC特征圖譜的建立及相似度評價

取34批桑葉樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件對色譜圖進行匹配，以S1圖譜作為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1 min，通過多點校正、全譜峰匹配生成34批桑葉的共有特征圖譜，同時采用中位數法生成對照特征圖譜，34批桑葉共有特征圖譜中共標定了7個共有峰，桑葉共有特征圖譜及對照特征圖譜（R）詳見圖1。計算34批次桑葉HPLC特征圖譜與生成的共有對照特征圖譜的相似度，均大于0.90，見表2，表明不同批次桑葉樣品間質量一致性較好。通過將對照特征圖譜與對照品圖譜比對，確定1號峰為新綠原酸，3號峰為隱綠原酸，6號峰為蘆丁，見圖2。

圖1 34批桑葉共有特征圖譜及對照特征圖譜

圖2 混合對照品色譜圖

2.6 聚類分析

聚類分析是一種無監督模式識別方法，將34批桑葉特征圖譜中7個共有特征峰單位峰面積輸入SIMCA（14.0）軟件中進行聚類分析，見圖3。結果顯示，聚類分析將34批桑葉樣品分成了3大類，其中S1～S3、S6～S10、S12、S16～S18、S22～S24號樣品聚為第1類，S4～S5、S14、S19～S21、S28、S31、S33號樣品聚為第2類，S11、S13、S15、S25～S27、S29～S30、S32、S34號樣品聚為第3類。該分類結果可初步確定34批桑葉樣品成分組成具有一定的差異，相同產地的藥材不一定能聚為一類。

圖3 34批桑葉樣品聚類分析樹狀圖

2.7 主成分分析（PCA）與正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

在聚類分析的基礎上，進一步采用PCA對34批桑葉樣品進行比較，以特征值>1為標準，提取出2個主成分，可用于反映34批桑葉樣品HPLC特征圖譜77.54 %以上信息，其中PC1貢獻率為55.27 %，貢獻率最大，PC2貢獻率為22.27 %，詳見表3。由前2個主成分建立坐標系，得到34批桑葉樣品的PCA得分圖（詳見圖4），由圖4可見，34批桑葉樣品可較分散地聚為3類，與聚類分析結果一致，同樣表明不同產地不同批次的桑葉樣品間化學成分均具有一定差異。根據桑葉共有峰成分矩陣，主成分1的信息來自峰2～7，其中3號峰為隱綠原酸、6號峰為蘆丁；主成分2的信息來自峰1，其中1號峰為新綠原酸，詳見表4。

圖4 34批桑葉樣品的PCA得分圖

表3 特征值和累積方差貢獻率

表4 桑葉藥材成分矩陣

為進一步明確上述3類桑葉樣品之間產生差異的主要標志物，基于PCA結果，采用監督模式識別法進行桑葉樣品間OPLS-DA分析，繪制OPLS-DA模型得分圖，詳見圖5。OPLS-DA模型的擬合參數R2X=0.775，R2Y=0.694，預測參數（Q2）=0.624，均大于0.5，表明所建模型穩定且預測能力較強。以模型變量投影（VIP）值>1為標準，得到色譜峰3（隱綠原酸）、峰5、峰1（新綠原酸）、峰7的VIP值分別為1.13，1.10，1.05，1.03，可作為區分桑葉質量差異的標志物，詳見圖6。

圖5 34批桑葉樣品的OPLS-DA得分圖

圖6 34批桑葉樣品7個共有峰的VIP值

2.8 AHP-CRITIC法分析

2.8.1 AHP法計算權重系數 桑葉主要成分為黃酮類、生物堿類及多糖類，藥理活性研究表明這些成分具有降血糖、調血脂、抗動脈粥樣硬化和抗病毒作用[1,7]，但不同成分的藥理作用強弱存在差異，將桑葉特征圖譜的7個共有峰的單位峰面積予以量化，分成3個層次，確定各指標的優先順序為藥典指標成分[3]峰6（蘆丁）優于已知峰1，3（新綠原酸、隱綠原酸），優于未知峰2，4，5，7，依次構建成對比較的判斷優先矩陣，并分別賦予各項指標相對評分為1，2，3分，見表5。

表5 指標成對比較判斷優先矩陣

采用和法求解[15]峰6（蘆丁）、峰1（新綠原酸）、峰3（隱綠原酸）、峰2、4、5、7的權重系數分別為0.2935，0.1730，0.1730，0.0901，0.0901，0.0901，0.0901。計算權重，結果見表6。

2.8.2 CRITIC法計算權重系數 CRITIC法[16]是一種以評價指標間的對比強度及沖突性作為基礎綜合衡量的客觀權重計算方法。計算權重，結果見表6。

2.8.3 AHP-CRITIC復合加權法計算權重系數 AHP法主觀評價了指標兩兩比較判斷的優先信息，而CRITIC法利用樣本數據的客觀性評價了相應指標的權重系數，再對兩組權重數據進行組合，計算混合權重水平，結果見表6。

分別用AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC混合加權法計算得到的權重系數，對試驗結果進行綜合評分比較。相關系數分析結果顯示，AHP法和CRITIC法的相關系數為0.984，AHP法和復合加權法的相關系數為0.999，CRITIC法和復合加權法的相關系數為0.988，三者相關性有統計學意義（P＜0.01），表明3種方法的評分結果具有一致性。結合聚類分析和PCA結果知，分為第1類的桑葉樣品，三者的評分結果均低于42分，分為第2、3類的桑葉樣品，三者的評分結果數值有部分交叉，但均高于42分，且從聚類分析結果看第2、3類的桑葉樣品仍可聚為一大類，推測第2、3類的桑葉樣品品質優于第1類的桑葉樣品，可為桑葉藥材的質量評分提供參考。

3 含量方法與結果

3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）柱，以甲醇為流動相A，0.5 %磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，30 %A；5～10 min，30 %A～35 %A；10～15 min，35 %A～40 %A；15～18 min，40 %A～50 %A；18～19 min，50 %A～30 %A；19～30 min，30 %A）；檢測波長為358 nm。

3.2 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇50 ml，稱定重量，加熱回流1.0 h，取出放冷，再稱定重量，用70 %甲醇補足減失重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

3.4 線性關系考察

精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1 ml含199.54 μg的對照品儲備液，分別取0.2，0.4，1，2，5，10 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，得系列對照品溶液，按3.1項下色譜條件進樣分析。以進樣質量濃度X（μg/ml）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y=23 125.78X+23 301.15，相關系數（R2）為0.9992，表明在3.99～199.54 μg/ml范圍內線性關系良好。

3.5 精密度試驗

精密稱取桑葉樣品，按3.3項下方法制備供試品溶液，按3.1項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果，蘆丁峰面積的RSD為0.99 %（n=6），表明儀器精密度良好。

3.6 重復性試驗

精密稱取桑葉樣品6份，按3.3項下方法制備供試品溶液，按3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，蘆丁含量的RSD為0.64 %（n=6），表明該方法重復性良好。

3.7 穩定性試驗

精密稱取桑葉樣品，按3.3項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，8，12，24 h，按3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，蘆丁峰面積的RSD為0.20 %（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

3.8 加樣回收試驗

精密稱取含量已知的桑葉樣品0.25 g，置具塞錐形瓶中，按樣品中蘆丁含量的50 %，100 %和150 %分別加入相應對照品，設計3組實驗，每組平行3份。按3.3項下方法制備供試溶液，按3.1項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表7。

表7 蘆丁的加樣回收試驗結果（n=9）

3.9 樣品測定

取34批桑葉樣品，按3.3項下方法制備供試品溶液，再按3.1項色譜條件進樣測定，計算各成分含量，結果見表8。

表8 34批桑葉蘆丁含量和色度值結果

3.10 桑葉蘆丁含量與色度值相關性分析

取34批桑葉粉末適量，壓制于分光測色儀載玻片上，壓制厚度約為1 mm。采用光源D65，設置標準觀察角10°，照明口徑50 mm，掃描速度600 nm/min，狹縫寬度1 nm，經標準白板校正后，平行測定3次取平均值，記錄色度值L（表示明度）、a（紅-綠軸）、b（黃-藍軸），計算樣品總色值E=（L2+a2+b2）/2，見表8。

采用SPSS 20.0軟件對34批桑葉的色度值L、a、b、E與蘆丁含量進行Person相關性分析，結果顯示蘆丁含量與L、a、b、E的相關性分別為0.360（P<0.05），-0.234，0.396（P<0.05），-0.297，即蘆丁含量與桑葉色度值L、b值有顯著正相關關系，其中L值越大，表示越亮，反之越暗，b值越大，黃色越明顯，反之藍色越明顯，表明偏亮黃色的桑葉蘆丁含量較高。

4 討論

本研究考察了提取溶劑（甲醇、70 %甲醇、50 %甲醇、30 %甲醇、50 %乙醇、70 %乙醇），提取方式（超聲，回流），提取溶劑用量（25，50，100 ml），提取時間（0.5，1.0，2.0 h）等供試品制備條件對指標成分蘆丁含量測定的影響，最終選擇了加入70 %甲醇50 ml，回流提取1.0 h作為蘆丁含量測定的供試品溶液制備方法，可確保蘆丁成分最大程度地被提取測定，且檢測出的蘆丁峰形較好，分離度較高。另考察了提取溶劑，提取方式，提取溶劑用量，提取時間等供試品制備條件對特征圖譜各指標測定的影響，優選了加入50 %甲醇10 ml，超聲提取45 min的特征圖譜供試品制備條件，得到的特征圖譜各色譜峰能滿足分析要求。

本研究將34批桑葉樣品特征圖譜的7個共有特征峰進行無監督模式聚類分析和PCA分析，其分析結果均將34批桑葉樣品大致區分為三大類，且相同產地的桑葉藥材不一定能聚為一類，進一步通過監督模式識別法進行OPLS-DA分析，篩選得到4個引起桑葉樣品間成分差異的主要標志性成分，表明不同產地或相同產地的桑葉藥材質量差異是多種成分共同作用的結果。分別用AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC混合加權法計算得到34批桑葉的7個共有特征峰的權重系數，對試驗結果進行綜合評分比較得知，聚類分析歸為第1類的樣品綜合評分全低于42分，而綜合評分高于42分的樣品則全為聚類分析納為第2、3類的樣品，其蘆丁含量也均高于0.25 %，且從聚類分析結果看第2、3類的桑葉樣品仍可聚為一大類，推測第2、3類的桑葉樣品品質優于第1類的桑葉樣品，可為桑葉藥材的質量評分提供參考。由桑葉蘆丁含量與色度值的相關性結果知，蘆丁含量與色度值L、b值有顯著正相關關系，表明偏亮黃色的桑葉蘆丁含量較高，可能桑葉不同生育周期下對次生代謝產物蘆丁的積累產生影響，從而導致桑葉藥材蘆丁含量的差異，也可能與桑葉地理環境、氣候條件、采收時間和干燥方式等有關[17]。

本研究通過測定桑葉特征圖譜、蘆丁含量和色度值，結合化學計量學分析方法、AHP層次分析法、CRITIC客觀權重賦值法及AHP-CRITIC復合加權法對桑葉藥材進行定量和一致性評價研究，直觀評價桑葉藥材品質的一致性和化學成分的差異性，可為桑葉藥材的質量控制和相關產品開發提供科學參考。