鹽脅迫下歐李葉片葉綠體結構及功能與超微弱發光激發的關系

孫 聰,朱 成,李東方,張 潔,郭金麗

(內蒙古農業大學 園藝與植保學院,呼和浩特 010010)

超微弱發光(ultraweak luminescence,UWL)普遍存在于生命體中,是一種自然發光現象,因其輻射強度極低[1～103hv/(s·cm2)]而得名[1]。UWL與生物體生理反應以及生化過程有著緊密聯系[2],是植物生命過程的一個極其靈敏的指示器[3],有望成為破譯植物生命活動真實信息和揭示生理代謝客觀規律的新途徑。但是,有關UWL 與植物生長發育關系的研究剛剛起步,尚無法將UWL 現象與植物的某一特定生理過程或化學反應聯系起來,有待于更多的試驗研究驗證,以便于UWL 更好地為農業服務。

葉綠體是一種獨特的植物細胞器,作為高效且自給自足的代謝工廠,它們可通過葉綠素和光系統進行光合作用,并將光能轉換為可供植物利用的化學能[4]。葉綠素作為葉綠體光合作用中的聚光色素和反應中心色素,承擔著光能的吸收和傳遞作用,開啟了光合作用的第一步[5]。

反應中心色素分子通過光化學反應將光能轉變為電能后,產生的電子通過一系列電子傳遞體的傳遞,同時偶聯光合磷酸化形成ATP,將電能轉化為活躍的化學能[6]。光系統(photosystem,PS)是進行以上電子傳遞與光合磷酸化偶聯將電能轉化為活躍化學能的光合機構[7-8]。葉綠素、PS均定位于葉綠體類囊體膜上,是葉綠體進行光合作用和能量轉換的主要光合色素和光合機構,葉綠素代謝情況和PS活性決定了葉綠體功能及其進行光合作用和能量轉換的效率[9-11]。

從葉綠體承擔的作用與功能來看,它應與植物中UWL的產生來源有關,或起關鍵作用。那么,葉綠體是否與植物中UWL產生來源有關? 葉綠體功能的發揮與UWL有何聯系? 這些問題的研究鮮見報道。

歐李(Cerasushumilis)屬薔薇科櫻桃屬矮生灌木,具有耐鹽堿的特點[12],是進行鹽調控試驗的理想材料。但有關歐李與UWL的關系及其產生來源鮮見報道。本試驗針對以上問題,以歐李為材料,以葉綠體及其功能應與UWL來源有關作為主要切入點,通過研究葉綠素代謝、PSⅡ活性、光合性能及能量水平等葉綠體功能與UWL 的關系,揭示葉綠體及其功能與UWL激發的聯系,以期為研究UWL與植物的關系及機制提供理論基礎和新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采用內蒙古農業大學歐李科研基地的2 年生‘蒙原’歐李盆栽苗為試驗材料。

1.2 試驗方法

選擇長勢基本一致、無病蟲害的歐李盆栽苗于溫室內進行試驗。根據預實驗結果,NaCl脅迫處理設定400,800 mmol/L 2個濃度水平,分別記為S1、S2,每盆歐李苗一次性澆400 mL設計濃度鹽溶液,以澆等量清水的盆栽苗為對照,記為CK。各處理完全隨機排列,共5次重復,每重復各10盆。在試驗期間進行正常澆水及田間管理。從鹽脅迫第0天開始,每2 d進行1次UWL 強度及其他各項指標測定,處理時間共計12 d(取樣時間以0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d表示)。取樣時,選取基部往上10～20片之間的成熟葉片,用蒸餾水洗凈擦干去主葉脈,按照不同方法稱取質量后用液氮速凍,帶回實驗室進行相關指標測定。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1超微弱發光強度

使用超微弱發光測試系統(BPCL-2-SH,北京)進行測定。開機后調制高壓1 100 V,預熱30 min,用打孔器(10 mm)對所取歐李葉片進行打孔,迅速將打孔部分葉片平鋪于測量杯中,打開光窗立即測定。每處理每次取5片葉,每片葉取樣3次。以15次減去本底值最大值的平均值表示UWL強度。

1.3.2葉綠素代謝物質含量

δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、Mg-原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)含量分別參照金鑫[13]、Liu等[14]的方法進行測定。葉綠素酶(Chlase)活性采用購自睿信生物科技有限公司(泉州市)的Elisa試劑盒測定,具體方法按操作說明進行。葉綠素含量參照李合生[15]的方法測定并計算。

1.3.3光系統Ⅱ活性

利用M-PEA 連續激發式熒光儀(Hansatech,英國)測定葉綠素熒光參數Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS、RC/CSm、φE0和ΨE0等指標,以反映PSⅡ活性。選取各處理歐李盆栽苗從基部往上第10～20片中朝向基本一致的功能葉,進行擦拭并標記,以便以后測量。測定前用儀器配備的暗適應夾對葉片進行暗適應30 min,然后進行正式測定,夾暗適應夾時應盡量避開主葉脈,每處理測定5次生物重復。

1.3.4光合性能指標

利用CIRAS-3(Hansatech,英國)便攜式光合儀進行Pn、Tr、Ci和Gs等光合性能指標測定。測量時間為上午9:00-11:00,選取各處理歐李盆栽苗枝條基部往上10～20片葉中的朝向基本一致的功能葉,將葉片擦拭干凈后進行測量,在測量時盡量避開主葉脈。每處理測定5次生物重復。

1.3.5核苷酸含量

ATP、ADP、AMP含量使用高效液相色譜儀(島津LC-20AT)測定。高效液相色譜儀基本配置:SPD-20A紫外檢測器,SIL-20A自動進樣器;液相色譜柱Wonda-Sil-C18(4.6 mm×250 mm,0.45 μm);流動相為35 mmol/L NaH2PO4緩沖液(pH 6.8),流速為0.8 mL/min,紫外檢測波長為259 nm;自動進樣器進樣量為20 μL。核苷酸標準品(5′-ATP 鈉鹽、5′-ADP鈉鹽、5′-AMP鈉鹽)均購于Sigma公司[16]。試驗用水為超純水。

式中:E為能荷(EC);n為濃度;nATP為ATP濃度;nADP為ADP濃度;nAMP為AMP濃度。

1.3.6葉綠體超微結構

取植株自上向下第5～10片新鮮葉片,切成大小約為2 mm×2 mm 的組織塊,用2.5%戊二醛和1%鋨酸固定,乙醇逐級脫水后進行環氧樹脂包埋,超薄切片機(Leica UC7)切片,醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,在透射電鏡(HT7800/HT7700)下進行觀察,每個樣品不同倍數取5個視野。取樣時間為處理的第0天、第6天和第12天。

1.4 數據處理

采用Excel軟件處理數據,Origin 軟件作圖,SPSS軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對歐李葉片超微弱發光強度的影響

圖1顯示,隨著鹽脅迫時間的延長,歐李葉片的UWL強度在CK中基本保持不變(圖1,A),在S1處理下較緩慢下降(圖1,B),在S2處理前8 d快速下降,之后基本不變(圖1,C)。同時,在整個鹽脅迫期間,S1和S2處理的歐李葉片UWL強度均始終明顯低于CK,而S2處理又明顯低于S1處理,且差異大多達到顯著水平(圖1,D)。以上結果說明400,800 mmol/L NaCl脅迫會導致歐李葉片UWL強度顯著下降,且鹽濃度越大、脅迫時間越長,UWL強度下降幅度越大。

圖1 鹽脅迫下歐李葉片超微弱發光強度的變化A.CK;B.S1;C.S2;CK,S1 and S2 stand for 0,400,800 mmol/L NaCl treatments,respectively;* and **i ndicate significant differences between S1 (S2) treatment and CK at the 0.05 and 0.01 levels during the same period,respectively.The same below.Fig.1 The changes of ultraweak luminescence intensities in leaves of C.humilis under salt stress

2.2 鹽脅迫對歐李葉片葉綠體結構和功能的影響

2.2.1葉綠體超微結構

葉綠體是植物進行光合作用的主要場所,也是植物能量的主要來源,為明確鹽脅迫對歐李葉片葉綠體功能的影響,應首先分析各處理條件下葉綠體超微結構的變化。如圖2所示,CK 歐李葉片的葉綠體緊密排列在細胞壁周圍,形態細長,具有典型的磷脂雙層膜結構,基粒垛疊緊密,類囊體清晰可見,具有較少的淀粉粒和嗜鋨顆粒;與CK 相比,S1處理增加了歐李葉片單個細胞內的淀粉粒數量,同時淀粉粒增大,基粒彌散,嗜鋨顆粒增多;S2處理歐李葉片細胞葉綠體內部結構被嚴重破壞,葉綠體膜溶解,嗜鋨顆粒和淀粉粒減少,基粒片層排列紊亂,基質片層斷裂,類囊體破裂。

圖2 鹽脅迫下歐李葉片葉綠體超微結構的變化A,B and C mean 3 000 times,8 000 times and 15 000 times the ultrastructure of chloroplasts,respectively.O.Osmophilic granules;SG.Starch granules;GL.Grana lamellae.Fig.2 Changes of the chloroplast ultrastructure in leaves of C.humilis under salt stress

2.2.2葉綠素代謝主要物質及葉綠素含量

從圖3可知,隨鹽脅迫時間的延長,各濃度鹽脅迫處理歐李葉片葉綠素合成前體物質(ALA 和Mg-ProtoⅨ)含量和光合色素(Chla、Chlb、Car、Chla+b)含量整體呈下降趨勢,而葉綠素降解酶(Chlase)活性則呈升高趨勢;在整個鹽脅迫期間,S1和S2處理的葉綠素降解酶活性大多高于同期CK,而S2處理始終高于S1處理,其余各指標均始終低于同期CK,而S2處理低于S1處理,且鹽脅迫處理與對照間大多差異顯著。說明400,800 mmol/L NaCl脅迫會顯著影響歐李葉片葉綠素代謝過程,從而導致其葉綠素含量顯著下降,且鹽濃度越大、脅迫時間越長,葉綠素含量下降幅度越大。

圖3 鹽脅迫下歐李葉片葉綠素代謝主要物質及葉綠素含量的變化Fig.3 Changes of chlorophyll metabolism main substances and chlorophyll contents in leaves of C.humilis under salt stress

2.2.3光系統Ⅱ活性

隨著鹽脅迫時間的延長,各濃度鹽脅迫處理歐李葉片光系統Ⅱ(PSⅡ)活性主要參數Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS、RC/CSm、φE0和ΨE0等均整體呈下降趨勢(圖4)。在整個鹽脅迫期間,S1和S2處理葉片的PS Ⅱ活性參數均基本低于同期CK,且S2處理又明顯低于S1處理,降幅大多達到顯著水平。以上結果說明各濃度鹽脅迫均會導致歐李葉片PS Ⅱ活性遭到明顯破壞,且鹽濃度越大、脅迫時間越長,PS Ⅱ損傷越嚴重。

圖4 鹽脅迫下歐李葉片光系統Ⅱ活性主要參數的變化Fig.4 Changes of the main parameters of the photosynthetic activity in leaves of C.humilis under salt stress

2.2.4光合性能

隨著鹽脅迫時間的延長,各鹽濃度鹽脅迫處理歐李葉片Pn、Tr和Gs均整體呈下降趨勢,而Ci則整體呈上升趨勢(圖5)。其中,在整個鹽脅迫期間,S1和S2處理葉片的Pn、Tr和Gs均始終顯著低于同期CK,且S2處理始終明顯低于同期S1處理;S1和S2處理葉片Ci始終明顯高于同期CK,而S2處理又明顯高于同期S1,且處理間差異大多達到顯著水平。以上結果說明各濃度鹽脅迫均會導致歐李葉片光合性能下降,且鹽濃度越大、脅迫時間越長,光合性能下降幅度越大。

圖5 鹽脅迫下歐李葉片光合性能的變化Fig.5 Changes of photosynthetic performance in leaves of C.humilis under salt stress

2.2.5能量水平

隨著鹽脅迫時間的延長,歐李葉片葉綠體能量水平在CK中基本保持不變,在不同鹽濃度處理下ATP含量均呈先上升后下降趨勢,ADP和AMP含量均整體呈上升趨勢,能荷(EC)水平整體呈下降趨勢;S1和S2處理ATP 含量在處理前期比CK 提高,后期值比CK顯著降低,其葉片ADP和AMP含量始終顯著高于同期CK,S2處理又始終高于同期S1處理;葉片EC水平始終顯著低于同期CK,且S2處理又始終低于同期S1處理(圖6)。S1和S2處理ATP 和EC降低的結果說明,鹽脅迫導致歐李葉片的能量水平整體下降,且鹽濃度越大、脅迫時間越長,能量水平下降幅度越大。

圖6 鹽脅迫下歐李葉片能量水平的變化Fig.6 Changes of energy level in leaves of C.humilis under salt stress

2.3 鹽脅迫下歐李葉片葉綠體功能與UWL的關系

2.3.1葉綠素代謝主要物質及葉綠素含量與UWL強度的相關性

如表1所示,在S1處理下,除Chlase與UWL呈極顯著負相關外,其余指標均與UWL 呈正相關關系,其中ALA、Mg-ProtoⅨ、Chla、Car和Chla+b與UWL的相關性為極顯著,Chlb與UWL 的相關性為顯著;在S2處理下,同樣只有Chlase與UWL呈極顯著負相關,其余指標均與UWL 為正相關關系,其中的Mg-ProtoⅨ和Car與UWL 相關性極顯著,Chla、Chlb和Chla+b與UWL 呈顯著正相關。以上結果表明鹽脅迫下歐李葉片UWL強度與葉綠素代謝顯著相關,葉綠素合成代謝加強、葉綠素含量增加時,有利于UWL 的產生,UWL 強度增加;反之,葉綠素降解代謝占優勢、葉綠素含量下降時,UWL強度下降。

表1 鹽脅迫下歐李葉片葉綠體功能對應指標與UWL強度的相關系數Table 1 Correlation coefficients between chloroplast function and corresponding indicators and UWL intensities in leaves of C.humilis under salt stress

2.3.2PSⅡ活性主要參數與UWL強度的相關性

在S1處理下,只有PIABS和RC/CSm與UWL呈顯著正相關,其余指標基本不相關;在S2處理下,PSⅡ活性主要參數均與UWL 呈顯著正相關關系,其中Fv/Fo、PIABS和RC/CSm與UWL的相關性極顯著,Fv/Fm、φE0和ΨE0與UWL 的相關性顯著。可見,在鹽脅迫條件下,歐李葉片UWL 強度隨著PSⅡ活性主要參數的下降而下降,說明UWL 與PSⅡ活性有關,PSⅡ活性較高時能夠促進UWL 的激發,UWL強度增加,而PSⅡ活性下降時不利于UWL的激發,UWL強度隨之下降(表1)。

2.3.3葉片光合性能與UWL強度的相關性

在S1 處理下,葉片光合參數Pn、Tr和Gs與UWL呈顯著正相關,Ci與UWL呈極顯著負相關;在S2處理下,Pn、Tr和Gs與UWL呈顯著正相關,其中Tr相關性極顯著,而Ci與UWL 呈極顯著負相關。可見,在鹽脅迫條件下,歐李葉片UWL強度隨Pn、Tr和Gs的下降而下降,隨Ci的升高而降低,說明UWL與光合作用有關,光合性能較高時能夠促進UWL的激發,UWL強度增加,而光合性能下降時不利于UWL的激發,UWL強度隨之下降(表1)。

2.3.4葉綠體能量水平與UWL強度的相關性

在S1處理下,葉綠體ATP 和EC 與UWL 呈極顯著正相關,AMP與UWL 呈顯著負相關;在S2處理下,葉綠體ADP和AMP含量與UWL 呈負相關,并分別達到顯著和極顯著水平,而EC 與UWL呈極顯著正相關。因此,在鹽脅迫條件下,歐李葉片UWL強度隨ATP和EC的下降而下降,隨ADP和AMP的升高而降低,說明鹽脅迫下UWL與能量有關,能量處于較高水平時促進UWL 的激發,UWL強度增加,而能量水平下降時不利于UWL的激發,UWL強度隨之下降(表1)。

3 討論

葉綠體是光合作用的主要場所,也是高等植物中最活躍的細胞器,逆境脅迫極易影響葉綠體的結構和功能。在正常條件下,葉綠體結構相對穩定,多呈橢圓形,表面光滑,有的外膜上有向外突起形成的小泡,類囊體平行排列,基質片層排列規則,葉綠體結構清晰,葉綠體膜完整[17]。然而,鹽脅迫會導致葉綠體膨脹破裂、結構松散、類囊體膜和片層逐漸解體、基粒片層數目減少[18-21]。本研究中鹽脅迫處理也導致歐李葉片葉綠體內部結構松散,類囊體降解,基粒結構遭到破壞。鹽脅迫下葉綠體結構的破壞將直接對葉綠體功能及在其內部進行的多項生理生化過程產生嚴重的影響。

葉綠素代謝分為葉綠素合成和降解兩部分,合成與降解的動態平衡決定了葉綠素的含量[13]。ALA 和Mg-ProtoⅨ是葉綠素合成過程中的主要前體,Chlase是參與葉綠素降解的主要酶。葉綠素代謝途徑的任何一步發生異常都可能會影響葉綠素的合成,導致葉綠素含量下降,進而引起光合速率降低[22]。王穎等研究發現,鹽脅迫使菠菜葉片葉綠素合成受阻,進而導致葉綠素含量降低[23]。郝樹芹等研究結果表明,西葫蘆銀葉病發病葉片和葉柄中的葉綠素合成中間產物Mg-ProtoⅨ含量下降,Chla、Chlb、Chla+b含量下降,而Chlase活性升高則進一步加劇了葉綠素的降解[24]。本試驗結果顯示,歐李葉片葉綠素含量隨著鹽脅迫時間和鹽脅迫濃度的增加而下降,這主要與葉綠素合成首要前體ALA及關鍵合成物質Mg-ProtoⅨ含量在脅迫下的降低和Chlase活性的逐漸升高有關。

UWL作為一種在自然界中普遍存在的生物發光現象,廣泛參與植物生長發育的多項進程。研究發現,UWL 的發光光譜與葉綠素的吸收光譜部分重合[25],推測植物的UWL 與葉片中葉綠素代謝有關。葉片黃色斑點和葉脈部分在UWL發光圖像中呈現暗區,而葉片綠色部分則呈現亮區,這進一步揭示了葉片色素與UWL 的關系[26]。在本研究中,對歐李葉片葉綠素代謝與UWL相關性分析的結果顯示,ALA 和Mg-ProtoⅨ含量與UWL 強度呈正相關關系,而Chlase均與UWL 強度呈顯著負相關關系,葉綠素含量與UWL 強度呈顯著正相關關系。這些結果說明,在鹽脅迫條件下,歐李葉片的UWL與其葉綠素代謝有關。郭金麗等在對德景天模擬干旱處理時發現,葉片UWL 強度與其Chla、Chlb和Chl含量呈顯著正相關[27]。此外,干旱脅迫下葡萄葉片UWL強度也與Chla和Chlb含量呈顯著正相關[28],這與本的研究結果一致。

葉綠體通過位于類囊體的PS將光能轉化為植物所能利用的化學能,所以光系統活性的變化將直接影響植物新陳代謝中能量的來源[29]。PSⅡ對逆境脅迫高度敏感,被認為是光抑制的原初位點和光損傷的主要部位[30]。鹽脅迫常導致PSⅡ整體活性和性能指數的下降[31]。在本研究中,高濃度的鹽脅迫導致歐李葉片PSⅡ活性參數Fv/Fm、PIABS以及RC/CSm下降,反映了鹽脅迫下PSⅡ最大光化學效率和PSⅡ反應中心活性的下降。同時,本研究對PSⅡ電子供體側和受體側的分析中發現,鹽脅迫導致Fv/Fo顯著下降,表明PSⅡ電子供體側OEC 活性降低,這與Singh 等的研究結果[32]一致。此外,本研究中ΨE0也隨著鹽脅迫時間延長而逐漸下降,ΨE0是對PSⅡ反應中心電子傳遞鏈性能的綜合評價指標之一,同時受PSⅡ供體側的電子供應能力和受體側(包括PSⅠ)電子接收能力的制約[33]。在對UWL的研究中發現,PSⅡ電子傳遞抑制劑DCMU可部分抑制UWL 的產生[34],并且進一步的研究表明UWL可能與PS有關[35]。在本試驗中,歐李葉片UWL 強度隨Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS、RC/CSm、φE0、ΨE0的降低而降低,且進一步分析也表明UWL強度與Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS、RC/CSm、φE0、ΨE0均呈正相關關系。以上結果說明在鹽脅迫條件下歐李葉片UWL 的發生可能與其PSⅡ活性和電子傳遞的氧化還原狀態密切相關。

光合作用是植物維持正常生命活動的重要環節,它是植物所需能量的直接提供者。葛江麗等認為光合作用速率的降低在鹽脅迫的前期以氣孔限制為主,隨著脅迫程度的加重和時間的延長,非氣孔因素則逐漸占據主導地位[36]。在本研究中,不同濃度的鹽脅迫在誘導歐李葉片Pn、Tr和Gs下降的同時,促進了其Ci的上升,說明鹽脅迫下歐李葉片光合速率的下降與非氣孔因素有關,光系統活性和葉綠體結構的破壞是鹽脅迫下歐李葉片光化學活性下降的主要原因。進一步對歐李葉片光合性能與UWL強度的相關性分析結果表明,UWL 強度與Pn、Tr、Gs呈正相關關系而與Ci呈負相關關系,即隨著Pn、Tr、Gs的降低和Ci的升高UWL 強度降低。該結果進一步證明歐李葉片UWL的發生與其光合性能有關,這與孟亞芬等的研究結果[37]一致。

綜上所述,鹽脅迫下歐李葉片UWL 和葉綠素代謝及含量、PSⅡ活性、光合性能及能量水平均有關,但不同濃度鹽脅迫下主要因素不同。S1處理下葉綠素代謝主要指標及葉綠素含量與UWL關系更為顯著,葉綠素代謝及含量可能是輕度鹽脅迫下葉綠體光合功能各過程中導致UWL強度下降的初始因子;而S2處理下,葉綠素代謝和含量以及PSⅡ活性的各指標均明顯與UWL顯著相關,表明重度鹽脅迫下,葉綠素與PSⅡ作為葉綠體光合功能中的主要光合色素和光系統,兩者協同作用,進而引起光合性能及能量水平的下降,最終導致UWL強度的下降。

4 結論

鹽脅迫導致歐李葉片葉綠體超微結構遭到破壞,進而使葉綠體功能下降,具體表現為:葉綠素合成受阻、降解加速、葉綠素含量下降,PSⅡ活性下降,光合性能降低及能量水平下降。與此同時,在鹽脅迫下,隨著葉綠體功能下降,UWL 的激發受到抑制,UWL 強度也隨之下降;進一步的相關性分析結果顯示,UWL 與葉綠素代謝、PSⅡ活性、光合性能及能量水平均高度相關。以上結果說明UWL與歐李葉片葉綠體及其功能密切相關,葉綠體應是激發UWL的細胞器之一。