葡萄風信子MaMYB114 基因克隆及功能研究

史程程,陳 鵬,焦清正,劉藝平,劉紅利

(河南農業大學 風景園林與藝術學院,鄭州 450000)

花色是觀賞植物的重要性狀之一,影響著園林植物的觀賞價值和經濟價值,而類黃酮物質中花青素苷(anthocyanin)是影響大多數觀賞植物呈色的主要原因之一[1]。近年來社會各界采用各種方法改變花色達到創造新奇色彩、擴充稀缺花色資源的目的,其中最有效的是基于花青素苷呈色機理分子育種手段[2-4]。花青素是一種多酚類水溶性色素,廣泛存在于不同植物的各個植物組織中,從而使其呈現出紅、藍、紫等不同顏色[5-7]。植物形成豐富色彩表型的原因是多樣的,植物體內花青素代謝途徑不同、花青素的含量不同以及環境影響等因素共同作用使植物展現不同的顏色[8-9]。

目前花青素生物合成途徑已清晰明了,其合成過程主要受兩類基因的調控:一類是編碼花青素生物合成各種酶的結構基因,一類是起轉錄調控作用的調節基因,其主要通過MYB-bHLH-WD40(MBW)三元復合物的形式發揮作用[10-12]。

MYB轉錄因子在植物生長發育過程中廣泛參與植物色素合成、細胞分化與發育、信號轉導以及抗病抗逆等次生代謝過程[13-17]。MYB 轉錄因子在N端含有高度保守的DNA 結合域,即MYB 結構域,每個結構域含有50～53 個氨基酸殘基,根據含有MYB結構域的數量可將其分為4個亞家族,分別是1R(R1/2/3-MYB)、2R(R2R3-MYB)、3R(R1R2R3-MYB)和4R(含有4個R1/R2重復基序)[18-19]。其中R2R3-MYB在植物中的研究最為廣泛,發揮著各種各樣的功能,尤其是在調控花青素生物合成方面表現出較高的特異性,其活性通常決定了特定細胞花青素的含量、花色強度和模式[20-21]。它們能夠與結構基因啟動子結合,從而促進或抑制結構基因表達,發揮調控花青素生物合成的功能。如蘋果(Malus×domestica)中MdMYB306-like直接抑制結構基因MdDFR的表達,負調控蘋果表皮花青素的合成[22];菊花(Chrysanthemummorifolium)CmMYB21在植物褪色過程中表達水平增高,抑制CmDFR啟動子活性,是調控花青苷代謝的轉錄抑制因子[23];水仙(Narcissustazetta)中NtMYB12直接與NtFLS、Nt-LAR、NtDFR啟動子結合,激活NtFLS和NtLAR表達,抑制NtDFR表達,導致中國水仙(原)花青素含量低,類黃酮含量高[24];牡丹(Paeoniasuffruticosa)PsMYB30激活PsANS的表達[25],PsMYB12通過調節PsCHS表達[26],都能促進花瓣色斑形成。因此,研究觀賞植物花青素生物合成相關的R2R3-MYB基因對實現花色定向改良十分重要。

葡萄風信子(Muscariarmeniacum)是從歐洲引進的多年生單子葉球根花卉,花序似成串的葡萄,花姿秀麗,具有較高的觀賞價值。因其罕有的藍色花色及簡單的花色遺傳背景深受大眾和科研工作者的青睞,是研究藍色花形成機制的理想植物材料[27-29]。本研究以葡萄風信子亞美尼亞(M.armeniacum)為試驗材料,基于課題組前期獲得的葡萄風信子M.armeniacum轉錄組數據庫,利用RT-PCR 法克隆獲得1條R2R3-MYB 序列,命名為MaMYB114。對基因序列進行生物信息學分析、亞細胞定位、轉錄自激活活性分析、時空表達模式分析及異源過表達煙草,以明確該基因的功能,為分子育種定向改良花色提供基因資源,進一步為探究葡萄風信子藍色花色形成機理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

葡萄風信子‘亞美尼亞’(M.armeniacum)植株栽植于河南農業大學第三試驗田。花發育階段定義如下:S1(Stage1),未著色的花蕾;S2(Stage2),開始著色的花蕾;S3(Stage3),完全著色但未開放的花蕾;S4(Stage4),花完全著色且完全開放;S5(Stage5),衰敗但未萎蔫的花。根據葡萄風信子生長時期采集植株的根、鱗莖、葉片及5個發育時期的花(圖1),樣品用液氮冷凍后存放于-80 ℃冰箱用于后續的試驗分析。

圖1 葡萄風信子全株、花序及5個花發育時期的花S1-S5,Stage1-5;Bar,1 cm.Fig.1 Total plant,inflorescence and tepals at five developmental stages of M.armeniacum

本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子保存于實驗室。種子播種在基質中,在光照培養箱中培養,光周期為14 h/10 h 晝/夜,待植株長至4～6片真葉后用于下一步試驗。煙草(N.tabacum‘SR’)種子經消毒后播種于MS培養基上,放置在培養室,光照周期為晝夜14 h/10 h,溫度25 ℃。植株生長至4～6片葉時用于遺傳轉化實驗。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

將葡萄風信子(M.armeniacum)的根、鱗莖和葉片及5 個時期的花經液氮研磨后,根據Omega Plant RNA kit(美國Omega公司)試劑盒說明書方法提取各組織樣品中的總RNA,RNA 質量經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據Primer Script Rt reagent Kit with gDNA Eraser(南京諾維贊生物科技有限公司)說明書方法獲得相應組織的cDNA,-20 ℃保存。

1.3 MaMYB114 基因克隆

以葡萄風信子(M.armeniacum)花5 個時期的cDNA 等量混合物為模板,利用 Premier 5.0設計基因克隆引物(表1),引物及測序都由上海生物工程有限公司完成。按照KOD-Plus高保真酶(東洋紡生物科技有限公司,上海)說明書方法擴增,獲得PCR 產物膠回收后連接pMD-18T 載體,轉化大腸桿菌感受態(Top10),挑取單克隆菌斑在LB(Luria-Bertani)液體培養基、37 ℃搖床培養8 h,經菌液PCR 檢測送陽性克隆測序。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.4 生物信息學分析

利用ExPASy在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對目的基因編碼蛋白的理化性質進行預測和分析;分別用SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swiss-model.expasy.org/)進行蛋白二級結構和三級結構預測;通過Expasy Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)進行親疏水性分析;利用DANMAN9.0軟件進行多重序列比對并分析其中的保守結構域。采用MEGA7.0 軟件中鄰近法(neighbor joining,NJ)構建系統進化樹。利用PSORT (https://www.genscript.com/tools/psort),Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)和TargetP 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0)在線工具進行亞細胞定位預測。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

實時定量PCR 以葡萄風信子‘亞美尼亞’(M.armeniacum)的根、鱗莖和葉片及5個時期花的cDNA為模板,反應體系和反應程序按AceQ? Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾維贊生物科技有限公司)說明書設置,使用2-ΔΔCT 法計算目的基因的相對表達量[30]。每個樣本3 個生物學重復,MaActin作為葡萄風信子的內參基因[29],基因定量引物及內參基因引物見表1。

1.6 亞細胞定位

采用同源重組的方式將MaMYB114基因開封閱讀框(open reading frame,ORF)(去除終止密碼子)連接到植物表達載體pC2300 的2 個酶切位點KpnⅠ和SalⅠ之間,獲得融合GFP的植物表達載體pC2300-MaMYB114-GFP(MaMYB114:GFP),所用引物見表1。參照盧瑤等的方法進行亞細胞定位觀察[31]。

1.7 轉錄激活活性試驗

采用同源重組的方法將MaMYB114基因的ORF序列構建到酵母表達載體pGBKT7的2個酶切位點NdeⅠ和BamHⅠ之間,獲得酵母表達載體pGBKT7/MaMYB114,所用引物見表1。參照Li等的方法[32]進行酵母轉化和陽性菌株的篩選。轉化的質粒分別為目的質粒(pGBKT7/MaMYB114)、陽性對照(pGBKT7-53+pGBKT7-T)以及陰性對照(pGBKT7-blam+pGBKT7-T)。觀察轉化菌斑在SD/-Trp/-Leu、含40 mg/mL X-a-gal的SD/-Trp/-Leu 培養基以及含40 mg/mL X-a-gal 的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養基上的生長情況。

1.8 煙草遺傳轉化

將植物過表達載體pC2300-MaMYB114-GFP和pC2300-GFP 利用葉盤法[27]轉化煙草(Nicotianatabacum‘SR’)。將篩選得到的不定芽切下放置于生根培養基上生長,待根生長至2 cm 左右時,對組培苗進行煉苗,然后移至無菌基質中,在溫室中進行培養。收集陽性苗種子,使用T1代株系進行基因功能分析。

1.9 花青苷的提取和含量測定

植物材料稱量后經液氮充分研磨,用花青苷提取液浸提。花青苷提取液為1%的鹽酸甲醇溶液[33]。在4 ℃冰箱中避光靜置,每6 h振蕩混勻1次,24 h后取上清液,使用酶標儀測量在530 nm 和657 nm 處的吸光度。花青苷含量計算公式:QAnthocyanins=(A530-0.25×A657)×mDW。葡萄風信子所有樣品總花青苷的相對含量分別采用單位干重表示。每個試驗3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 基因克隆及生物學信息學分析

2.1.1 MaMYB114 基因克隆

通過PCR擴增,從葡萄風信子花瓣中克隆獲得到1條714 bp左右的的基因序列(圖2),ORF編碼237個氨基酸(圖3),命名為MaMYB114,將得到的MaMYB114序列提交到GenBank,登錄號為OQ615377。

圖2 葡萄風信子MaMYB114 基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳M.DL2000 DNA marker;A.The amplification of full-length cDNA of MaMYB114.Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of MaMYB114 from M.armeniacum

圖3 葡萄風信子MaMYB114 基因序列全長及其推導氨基酸序列The amino acid sequences marked by black underlinei ndicated the conserved MYB domain (i.e.R2R3 repeats).Fig.3 The full length of cDNA and deduced amino acid sequences of MaMYB114 from M.armeniacum

2.1.2理化性質分析與結構預測

葡萄風信子MaMYB114由237個氨基酸殘基組成,在組成該蛋白的氨基酸中,甘氨酸(Leu)所占比例最高,為9.7%,而半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr)所占比例最低,為1.3%。負電荷殘基(Asp+Glu)33 個,正電荷殘基(Arg+Lys)37個。

MaMYB114的分子式為C1192H1869N353O349S6,理論等電點(pI)為8.87,不穩定指數為41.86,這表明該蛋白為不穩定蛋白。Expasy Protscale顯示蛋白總親水性平均系數(GRAVY)為-0.775,這說明該蛋白是親水性蛋白(圖4)。通過在線軟件對MaMYB114蛋白的二、三級結構進行預測,結果(圖5)表 明,MaMYB114 蛋白由38.40%的α-螺旋、11.39%的延伸鏈和50.21%的無規卷曲構成,而三級結構較為簡單。

圖4 MaMYB114蛋白親水/疏水性預測分析Fig.4 Prediction of hydrophilic/hydrophobicity for MaMYB114 protein

圖5 MaMYB114蛋白二、三級結構預測A.Secondary structure,Blue.Alpha helix,Purple.Random coil.Red.Extended strand;B.Tertiary structure.Fig.5 Secondary and tertiary structure prediction of the MaMYB114 protein

2.1.3MaMYB114序列比對及聚類分析

從NCBI數據庫下載擬南芥、矮牽牛和金魚草等花青素生物合成相關的R2R3-MYB氨基酸序列,使用DANMAN9.0 軟件將MaMYB114 與其進行多重序列比對。

結果(圖6)顯示,葡萄風信子MaMYB114蛋白在N 端高度保守,與其他物種R2R3-MYB 同源蛋白一樣含有R2和R3 結構域,而在C 端的同源性低,屬于R2R3-MYB家族的轉錄因子。MaMYB114的N 端保守結構域內存在3個雙子葉植物花青苷相關R2R3-MYB的保守氨基酸,在圖6中用黑色實心圓點標注;在R3結構域中含有與bHLH 蛋白互作的保守基序([D/E]LX2[R/K]X3LX6X3R),在圖中用黑色矩形標注。系統進化樹(圖7)顯示,MaMYB114與洋蔥AcMYB1的同源性最高,與矮牽牛PhPAP1、擬南芥AtPAP1、PAP2 以及煙草NtAN2等參與花青苷合成調控的R2R3-MYB共同聚為AN2亞組。

圖6 葡萄風信子MaMYB114與其他物種R2R3-MYB蛋白序列比對分析The black box,bHLH interacting motif;Black solid dot,conserved amino acids [arginine (R),valine (V),alanine (A)].Fig.6 Sequence alignment analysis of MaMYB114 (M.armeniacum) with R2R3-MYB proteins from other species

圖7 葡萄風信子MaMYB114與其他參與花青苷合成相關R2R3-MYB的系統進化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of MaMYB114 from M.armeniacum with other R2R3-MYBs involved in the anthocyanin biosynthesis

2.1.4亞細胞定位

網頁預測MaMYB114蛋白在細胞中定位于細胞核,為驗證預測結果,在本氏煙草中瞬時過表達pC2300-MaMYB114-GFP,以pC2300-GFP 為對照使用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白亞細胞定位情況。結果(圖8)表明,對照pC2300-GFP在整個細胞中表達,而融合蛋白MaMYB114-GFP于本氏煙草葉片的細胞核中發出綠色熒光,與DAPI(標示細胞核)的藍色熒光重合,表明MaMYB114蛋白定位于細胞核。

圖8 MaMYB114蛋白亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of MaMYB114

2.1.5MaMYB114轉錄激活活性試驗

在酵母中檢驗MaMYB114 的轉錄自激活活性。圖9顯示,pGBKT7/MaMYB114和pGBKT7-53/pGBKT7-53(陽性對照)能在添加40 mg/mL Xa-gal 的SD/-Trp/-Leu培養基以及含40mg/mL Xa-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養基上生長,菌斑呈現藍色,而pGBKT7-blam/pGBKT7-T(陰性對照)在SD/-Trp/-Leu/X-a-gal培養基上生長但不變藍,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal上不生長,這些結果說明MaMYB114具有轉錄激活活性。

圖9 葡萄風信子MaMYB114轉錄激活活性分析Positive control.pGBKT7-53 plus pGADT7-T;Negative control.pGBKT7-blam plus pGADT7-T.Fig.9 The transcription activation ability of MaMYB114 from M.armeniacum

2.1.6葡萄風信子總花青苷相對含量測定和MaMYB114轉錄表達分析

為了探究MaMYB114轉錄表達與花青苷積累的關系,檢測了葡萄風信子根、鱗莖、葉、花中的總花青苷含量(圖10,A)及MaMYB114的表達水平(圖10,B)。結果表明,花青苷主要在葡萄風信子的花中積累,在5個花發育時期總花青苷含量呈現出先增高后降低的趨勢,在未著色的S1時期花青苷的積累極少,隨著花發育進程,花青素從開始著色的S2時期開始增加,在完全著色的S3和S4時期高表達,在開始衰敗的 S5 時期降低(圖10,A)。MaMYB114在葡萄風信子花的5個發育時期的基因表達水平顯著高于根、鱗莖和葉片,表達水平具有組織特異性。MaMYB114基因表達水平在花5個發育時期的表達量總體上呈現出先增高后降低的趨勢,在S1時期低表達,隨著花開始著色,花青苷含量增加,在S2時期快速升高,特別是在S3時期達到最大值,S4和S5時期降低(圖10,B),與花青苷積累的趨勢相似,呈現極顯著的正相關(Pearson相關系數,r=0.793)。

圖10 葡萄風信子不同組織器官中總花青素相對含量及MaMYB114 轉錄表達分析A.The total anthocyanins content of roots,bulbs,and flowers at the five flower developmental stages (S1-S5);B.The expression profiles of MaMYB114 in roots,bulbs,leaves,and five flowers developmental stages of M.armeniacum.MaActin was the reference gene.Each column represents the means±SD from three technical replicates.Fig.10 The total anthocyanins content in roots,bulbs,and flowers of M.armeniacum and the expression profiles of MaMYB114 in these tissues

2.2 MaMYB114在煙草中異源過表達

為了進一步確定葡萄風信子花色相關R2R3-MYB轉錄因子基因MaMYB114在花青苷合成中的作用,我們將植物過表達載體pC2300-MaMYB114-GFP和空載體pC2300-GFP通過農桿菌介導法轉化煙草‘SR’葉盤,以轉化空載體(CT)為對照。過量表達MaMYB114(OE-MaMYB14)使煙草(圖11)的營養器官和生殖器官積累大量花青苷。過表達MaMYB114的煙草葉片相比轉化空載體煙草葉片顏色加深(圖11,D);對照組煙草(CT)花冠顏色為粉色,而OE-MaMYB14煙草花冠及花冠筒變為深紫紅色(圖11,C);此外,種皮、花萼、花藥和花絲也呈現出強烈的深紫紅色(圖11,A,B)。這些結果證明,MaMYB114具有正調控花青苷的功能。

圖11 過表達MaMYB114 和空載體基因的煙草表型分析OE-MaMYB114,MaMYB114 overexpress tobacco lines;CT.Transgenic tobacco lines transformed with the empty vector (control).A.Seed;B.Sepal,anther,filament,ovary;C.Petal;D.Whole plant.Fig.11 Tobacco phenotypic analysis of overexpressing MaMYB114 and empty vector genes

3 討論

MYB轉錄因子是植物中的轉錄因子家族之一,其中R2R3-MYB轉錄因子廣泛參與多種植物響應生物及非生物脅迫、生長發育及花青苷合成調控等過程,它們通常在其N 端都具有1個高度保守的DNA 結合區域(即R2R3 repeats),而在其C 端具有1個可變區域[14]。本研究從單子葉植物葡萄風信子的花中克隆獲得1個花色相關的R2R3-MYB轉錄因子基因MaMYB114,它編碼的氨基酸序列中含有2個SANT 結構,屬于典型的R2R3-MYB。在馬鈴薯(Solanumtuberosum)中,MYB 轉錄因子StAN1含有bHLH 互作區,在煙草葉片中瞬時共表達StbHLH1和StAN1時,能夠使煙草葉片積累花青素[34];同理,蘋果(Malus×domestica)MdbHLH3和MdbHLH3與MdMYB10相互作用參與花青素生物合成的調節[35]。MaMYB114在R3結構域中存在與bHLH 蛋白互作的結合位點,推測其能通過與bHLH形成復合物參與花青苷合成調控。

根據序列同源性可將與花青素合成相關的R2R3-MYB分為AN2亞組和C1亞組,分別對應擬南芥R2R3-MYB的25個亞組中的第6亞組和第5亞組[36]。參與單子葉植物花青苷調控的主要聚為C1亞組,而參與雙子葉植物花青苷調控的以AN2亞組為主。也存在屬于AN2亞組的調控單子葉植物花青苷的R2R3-MYB,如百合LhMYB6[37],小蒼蘭FhPAP1[38]以及葡萄風信子MaAN2和MaMybA[27]。基于序列分析和聚類分析結果,初步推測MaMYB114具有調控花青苷合成的能力。

亞細胞定位(圖8)及轉錄激活活性(圖9)分析結果表明MaMYB114定位于細胞核且具有轉錄自激活活性,符合轉錄因子一般特征。MaMYB114在葡萄風信子的花中優勢表達,具組織特異性,且隨著花發育進程呈現出先增高后降低的趨勢,在S3時期達到極值,在S4時期降低,與花青苷積累的趨勢相似,呈現極顯著的正相關(Pearson 關系數r=0.793)。這進一步表明在葡萄風信子花發育過程中,MaMYB114可能參與花青苷的合成調控,且在花發育的早期(S2-S3時期)起主要調控作用。

在模式植物中異源過表達目的基因能為基因功能鑒定提供依據,荔枝LcMYB1[38]、楊梅MrMYB1[39]、小蒼蘭FhMYB5[40]以及百合LhMYB12-Lat[41]在煙草中過表達都能夠使花青苷在煙草花瓣、萼片、花絲等部位大量積累從而發生顏色變化。本研究中,在煙草‘SR’中過表達MaMYB114使煙草葉片、花冠、花冠筒、花藥、花絲、花萼和種皮均呈現出深紫紅色(圖11),進一步證明MaMYB114促進花青素的積累。

綜上所述,葡萄風信子MaMYB114基因屬于調控花青苷合成相關的R2R3-MYB 亞家族中的AN2亞組。在煙草中異源過表達MaMYB114的結果證實其確實具有促進花青苷積累的功能,但具體調控機制需要進一步驗證。