梭梭qRT-PCR 內參基因的篩選及穩定性分析

張玲玲 ,王淑冉 ,張 勝,2*

(1 西北農林科技大學 林學院,陜西楊凌 712100;2 新疆大學 生命科學與技術學院,烏魯木齊 830046)

實時定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)是一種利用熒光信號積累,通過內參法或外參法分析樣品中mRNA 轉錄水平的分子技術。qRT-PCR 具有特異性高、重復性好、靈敏度高等優點,彌補了傳統PCR 技術的一些局限性,在生命科學研究中被廣泛應用[1-3]。但qRT-PCR 結果受樣本所處環境或不同生長發育階段以及RNA 質量濃度和酶誘導反應效率影響,使qRT-PCR 的準確性出現偏差,導致結果不可靠[4]。在試驗中加入適當的內參基因為對照,使基因的表達水平標準化,可最大程度避免誤差[5-6]。

理想狀態下,內參基因不受各種條件的限制,表達水平較為穩定[7]。在植物學研究中,常采用在組織中較穩定的基因作為內參使用,如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)[8-9]、18S 核糖體RNA(18S rRNA)[10]、泛素結合酶(UBC)[11]、β-微管蛋白(TUB)[9,11]、肌動蛋白(ACT)[10]、α-微管蛋白(TUA)[9]、蛋白磷酸酶2調節亞基A(PP2A)[12]、延伸因子-1α(EF-1α)[11,13]、多泛素(UBQ)[14]和TIP41樣蛋白基因(TIP41)[12]。然而,某種內參基因并不完全適用于多種環境條件或發育階段。同一內參基因在不同物種和不同處理中的表達量也不盡相同。如在桃的研究中,翻譯優化因子2(TEF2)、泛素10(UBQ10)和RNA 聚合酶Ⅱ(RPⅡ)是最適合的內參基因[9];而在番茄的研究中,GAPDH或PGK和EF1分別是氮脅迫和晝夜節律下最適合的內參基因[15]。因此,針對不同物種,不同的生長階段或環境條件下選擇相對穩定的內參基因是準確分析目標基因表達譜的關鍵[11]。

梭梭(Haloxylonammodendron)生長在荒漠環境,其葉片組織退化成鱗片狀,依靠同化枝(assimilating shoots)進行光合作用,對干旱、鹽堿等脅迫有較強的適應性[16-18]。作為重要的鄉土防風固沙植物,梭梭在中國寧夏、甘肅、青海、新疆等地荒漠化防治和植被恢復中發揮著重要作用,它也是研究沙漠地區植物抗性和高光效機理的重要材料。目前梭梭分子生物學研究基礎薄弱,篩選和驗證梭梭穩定的qRT-PCR 內參基因對梭梭后續相關研究具有重要的基礎性作用。研究一共篩選14個內參基因進行穩定性評價,包括2種類型的微管蛋白(TUA和TUB),參與糖酵解反應關鍵酶GAPDH,主要參與蛋白合成的EF-1α,廣泛參與植物生長發育相關過程的泛素結合酶E2(UBC)以及核糖體蛋白L32(RPL32)、清蛋白(ALB)、50S 核糖體蛋白(50S-1721、50S-1063)、RNA 聚合酶Ⅱ(RPⅡ)、組蛋白(H3)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、鐵超氧化物歧化酶(SOD)、熱激蛋白70(HSC70)等常見的看家基因。利 用geNorm、BestKeeper、NormFinder 和Ref-Finder軟件對梭梭內參基因的穩定性進行綜合評價,分析這些基因在ABA、NaCl、熱脅迫、干旱和晝夜節律條件下的穩定表達水平。此外,為了評估選用不同內參基因對研究結果的影響,在NaCl脅迫處理下使用2種不同內參檢測了梭梭C4光合循環途徑關鍵酶——磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的表達水平。研究旨在為梭梭qRT-PCR 提供合適的內參基因,并為進一步研究梭梭等荒漠植物的非生物抗性機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

從新疆古爾班通古特沙漠南緣極端鹽堿半荒漠區采集梭梭成熟種子,人工氣候箱25 ℃催芽后,栽種于直徑9 cm,高12 cm 花盆中(基質:河沙土),幼苗轉移至自然光溫室[白天溫度(32±3) ℃,相對濕度55%]生長8周后進行處理取樣。共設5個試驗組:熱脅迫處理組在人工氣候箱(泰斯特,中國)38℃培養2 h,取0 h、1 h、2 h的成熟同化枝;干旱處理組取自然光溫室自然干旱0 d[(70±5)%相對含水量]、1 d、3 d 的成熟同化枝;鹽處理組使用200 mmol/L NaCl溶液澆灌至飽和含水,取0 h、2 h、8 h的成熟同化枝;ABA 處理組,使用濃度為100 μmol/L ABA,噴施于葉片表面,直至葉片滴液,處理后采集0 h、2 h、6 h的成熟同化枝;晝夜節律處理組采集12:00、下午18:00以及凌晨24:00的成熟同化枝。以上每個處理設置3個生物學重復,每個重復至少包含3株獨立處理幼苗。收集所有材料,液氮速凍后,-80 ℃保存備用。

1.2 RNA提取和cDNA合成

取梭梭同化枝樣本0.5 g,加液氮充分研磨。使用Omega total RNA Extraction Kit (Omega Bio-Tek,China)提取樣品總RNA,使用超微量分光光度計(Gene,China)測定RNA 樣品的質量和濃度,260 nm/280 nm 的吸光度范圍為1.8～2.2,質量較高,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。使用EasyScript?first-strand cDNA Synthesis Super-Mix(TransGen Biotech,China),將提取的RNA 反向轉錄為第一鏈cDNA,將cDNA 稀釋10倍,保存于-80 ℃備用。

1.3 qRT-PCR引物設計

根據轉錄組數據篩選內參基因。所有候選內參基因均采用Primer 5.0軟件[11]進行引物設計。引物由上海生工生物技術公司合成,引物稀釋后4 ℃保存備用。

1.4 擴增效率檢測及內參基因選擇

共選取14個基因(GAPDH、EF-1α、UBC、RPL32、ALB、50S-1721、50S-1063、RPⅡ、H3、PP2A、SOD、HSC70、TUA、TUB)作為候選內參基因進行表達穩定性分析。qRT-PCR 擴增時,將擴增產物用原液稀釋10倍、102倍、103倍,生成標準曲線,計算引物的擴增效率(E,%)及斜率(S)。

引物擴增效率和R2由原始CT值計算,公式為:E=(10-1/S-1)×100[19],其中斜率用Excel線性回歸方程計算[9]。候選內參基因引物序列見表1。

表1 梭梭內參基因、引物序列及PCR 擴增特性分析Table 1 Analysis of H.ammodendron internal reference gene,primer sequence and PCR amplification characteristics

1.5 qRT-PCR分析

qRT-PCR 按照2×SYBR Green qPCR Master mix試劑(Aidlab,China)使用要求進行。使用Roche公司的LightCycler?96熒光定量儀進行反應,反應體系為25 μL,包括2×SYBR qPCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA 模板1 μL,每個樣品進行3次生物重復。擴增程序:在94 ℃下預變性30 s、94 ℃變性20 s、60℃退火,并在72 ℃下延長30 s,40個循環周期。

1.6 候選基因穩定性評價

采用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對qRT-PCR 得到的所有CT值進行穩定性評價[20-22]。結合上述分析結果,利用RefFinder軟件[23],根據相對表達量(Q)計算公式Q=2-ΔCT(樣本ΔCT=CT,max-CT,min)計算不同處理下候選內參基因的綜合排序。輸入數據后,geNorm 軟件通過分析Q值計算表達穩定性。M值＜1.5是穩定范圍值,隨著M值減小,穩定性升高;相反,隨著M值增加,基因穩定性降低。NormFinder 程序分析的原理與geNorm 類似,計算采用Q值,隨著該值降低,內參基因的相對表達也變得更加穩定。在NormFinder中,通過結合樣本集中的組內和組間變異計算候選內參基因的表達穩定性。為了得到均值和標準差,直接使用原始數據CT值進行最佳候選基因分析,最后通過RefFinder網站對上述數據進行比較分析,獲得最合適、最穩定的內參基因。

1.7 選擇不同內參對試驗結果的影響

為了分析所選內參基因對試驗結果的影響,選擇梭梭C4光合碳代謝途徑關鍵基因PEPC(ON640822.1)作為目標基因,驗證內參基因的適用性,選擇2 h、4 h、8 h、24 h、2 d和4 d的鹽脅迫樣品進行qRT-PCR 實驗,采用2-ΔΔCT 法[24]計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 引物特異性和擴增效率

用OD260/280值和1%凝膠電泳對RNA 進行濃度測定及質量分析。凝膠結果顯示出2條完整清晰的RNA 條帶(28S/18S),表明RNA 提取成功,OD260/280值在2.0～2.2之間,滿足后續試驗要求。篩選出14 個基因(GAPDH、EF-1α、UBC、RPL32、ALB、50S-1721、50S-1063、RPⅡ、H3、PP2A、SOD、HSC70、TUA和TUB)作為候選基因進行穩定性表達分析。

表1展示了上述基因及其qRT-PCR 引物序列和擴增效率。PCR 產物經瓊脂糖凝膠(1%)電泳分析,并利用溶解曲線觀察、驗證引物的特異性。所有合格的引物經凝膠電泳均呈現出預期大小的單條帶(圖1,A),通過溶解曲線分析,每個基因產物均呈現出單峰(圖1,B)。標準曲線的擴增效率范圍為80%～110%,相關系數(R2)在0.98～1之間,均在合理范圍內(表1)。

2.2 候選基因在不同脅迫處理下的相對表達量

計算每個候選內參基因的CT值,CT值與表達豐度成反比。候選內參基因在不同樣本中的表達水平不同。結果(圖2)顯示,所有樣本的CT值都在15～32之間,多數內參基因的CT值為25左右。采集凌晨24:00時的同化枝樣HSC70表達最高,CT值為15.99,干旱脅迫下第3 天CT值最高,為31.7,相應基因豐度水平最低。14個候選基因的平均CT值在20～28之間,而RPⅡ的CT值最高,為27.44,表明與其他內參基因相比,其表達水平最低。HSC70的平均CT值最低,僅為20.19,說明與其他內參基因相比,HSC70的表達量最高。在不同的脅迫處理下,不同內參基因的表達沒有明顯的規律性,需使用穩定性分析軟件進一步評價分析。

圖2 內參基因的平均CT 值A line across the box is depicted as the median.The box indicates the 25th and 75th percentiles.Whiskers represent the maximum and minimum values in all samples.Fig.2 Average CT value of each reference gene

2.3 候選基因穩定性評價

2.3.1geNorm 分析

geNorm 軟件可以將熒光qRT-PCR 得到的CT值轉化為相對定量數據,并逐漸剔除最不穩定表達的內參基因,直到保留穩定性最高的基因。這一過程由每一步各內參基因的平均表達穩定性值M決定。M的穩定表達閾值為1.5,M值越小,基因表達越穩定。ABA 處理中,PP2A和SOD是最穩定的內參基因,M值為0.05,而TUA最不穩定,M值為2.08。干旱處理組最穩定的候選內參基因為RPⅡ和TUB,M值為0.08;最不穩定的內參基因為ALB,M值為0.98;UBC和TUB的穩定性最高(M=0.13),EF-1α穩定性最差(M=0.93)。熱處理條件下,最穩定的基因為50S-1063和H3(M=0.02),而最不穩定的基因為ALB(M=1.38)。在晝夜節律處理中,RPL32和ALB(M=0.36)是最穩定的基因,TUA(M=2.26)是最不穩定的基因。總體而言,RPL32和SOD(M=0.43)是所有處理中最穩定的基因,而TUA(M=2.21)表達最不穩定(圖3)。

圖3 geNorm 軟件分析14個內參基因表達穩定性值(M)Fig.3 Expression stability values (M) of 14 internal reference genes analyzed by geNorm software

為確定試驗標準化所需的最佳內參基因數量,采用geNorm 軟件對最佳配對變異值(Vn/Vn+1)[23]進行分析。該計算方法基于Vn/Vn+1值(＜0.15)來衡量n為最合適的內參基因數量。如果該值大于0.15,則n+1為最合適的內參基因數。最佳配對變異值顯示在ABA、NaCl、干旱、熱脅迫處理組中V2/V3值均小于0.15,說明使用2個內參基因能夠達到對目的基因較好的校正效果(圖4)。

圖4 geNorm 分析14個內參基因在不同處理條件下V 值和6個樣本亞群14個候選內參基因的成對變異(Vn/Vn+1)分析Fig.4 geNorm analysis of the V values for the 14 reference genes under various conditions,pairwise variation(Vn/Vn+1) analysis of 14 candidate reference genes analyzed in six sample subsets

2.3.2NormFinder分析

NormFinder軟件是一種能夠有效識別候選內參基因的基本可視化應用工具,通過估計組內變異和組間變異[25],分析基因相對表達的穩定性值,并對候選基因進行排序。穩定表達值越低,表明基因表達越穩定[26]。候選內參基因在各處理中的穩定值見表2。

表2 基于NormFinder分析14個內參基因不同脅迫處理下的表達穩定性Table 2 Expression stability of 14 reference genes under various treatments based on the NormFinder analysis

分析結果表明,葉面噴施ABA 處理中,ALB和RPⅡ是最穩定的內參基因,TUA是最不穩定的內參基因。在干旱處理中,RPⅡ和TUB是最穩定的基因,ALB是最不穩定的內參基因,這與geNorm 的數據項一致。RPⅡ和TUB也是鹽脅迫下最穩定的內參基因,EF-1α是鹽脅迫下最不穩定的內參基因。熱處理時,H3和50S-1063是最穩定的內參基因,ALB是最不穩定的內參基因。ALB和RPL32是晝夜節律中最穩定的內參基因,TUA是最不穩定的內參基因。所有樣品的穩定性排名為:RPL32＞50S-1721＞PP2A＞SOD＞50S-1063＞UBC＞RPⅡ＞EF-1α＞TUB＞HSC70＞H3＞ALB＞GAPDH＞TUA。

2.3.3Bestkeeper分析

通過qRT-PCR 直接獲得所有樣本的原始CT值,計算BestKeeper分析中內參基因的穩定性,得到每個內參基因的變異系數(CV)和標準偏差(SD),篩選出最穩定的基因表達[27]。最小的SD 值具有最穩定的基因表達水平。根據處理樣品穩定性分析值(表3),得出ABA 處理中基因相對表達穩定性排序為HSC70＞RPL32＞SOD＞PP2A＞TUB＞RPⅡ＞ALB＞50S-1721＞50S-1063＞TUA＞UBC＞H3＞EF-1α＞GAPDH,HSC70是最穩定的內參基因,GAPDH是最不穩定的內參基因。干旱脅迫下基因表達穩定性排序為SOD＞RPL32＞H3＞UBC＞TUB＞50S-1721＞RPⅡ＞50S-1063＞PP2A＞GAPDH＞HSC70＞EF-1α＞TUA＞ALB。鹽處理組基因表達穩定性排序為PP2A＞HSC70＞UBC＞SOD＞TUB＞RPL32＞H3＞RPⅡ＞ALB＞EF-1α＞GAPDH＞50S-1721＞50S-1063＞TUA。熱處理組基因表達穩定性排序為50S-1721＞RPL32＞SOD＞50S-1063＞H3＞ALB＞TUB＞RPⅡ＞GAPDH＞UBC＞PP2A＞TUA＞HSC70＞EF-1α。

表3 利用BestKeeper算法計算梭梭非生物脅迫下候選內參基因表達穩定性Table 3 The BestKeeper algorithm was used to calculate the expression stability of candidate reference genes of H.ammodendron under abiotic stress

晝夜節律組內參基因表達穩定性排序為UBC＞SOD＞PP2A＞ALB＞RPL32＞EF-1α＞H3＞50S-1721＞50S-1063＞HSC70＞TUB＞RPⅡ＞GAPDH＞TUA。在所有樣本中,基因表達穩定性綜合順序為RPL32＞SOD＞PP2A＞50S-1721＞TUB＞UBC＞50S-1063＞H3＞RPⅡ＞HSC70＞ALB＞GAPDH＞EF-1α＞TUA。總體而言,RPL32是相較穩定的內參基因,而TUA是較為不穩定的內參基因(表3)。

2.3.4RefFinder分析

使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3個軟件分析了不同非生物脅迫處理下最合適的內參基因,3個軟件分析的結果稍有不同。為了得到更綜合的分析結果,利用RefFinder網站對數據進行綜合比較分析,并通過綜合分析對內參基因的穩定性進行排序。

結果表明,在ABA 和晝夜節律條件下,ALB(2.43和1.41)是最穩定的內參基因。而其他樣品中,所有處理中最穩定的內參組分別是干旱處理下的RPⅡ(2.30)、鹽脅迫下的TUB(2.11)、熱處理下的H3(1.97)和RPL32(1.00)基因(圖5)。

圖5 RefFinder程序綜合分析候選基因在不同非生物脅迫下組織表達穩定性排序A.ABA-treated group;B.Drought-treated group;C.NaCl-treated group;D.Heat-treated group;E.Circadian rhythm sampling group;F.All samples.Fig.5 Comprehensive analyses of the tissue expression stability ordering of candidate genes under different abiotic stresses by the RefFinder program

2.4 不同內參基因對試驗結果的影響分析

為驗證候選內參基因的有效性,研究測定不同時間NaCl處理后梭梭PEPC基因在葉片組織中的表達情況。PEPC是C4光合代謝循環核心基因,是研究植物高光效調控關鍵基因[28]。選擇了表達最穩定的基因(SOD)和最不穩定的基因(TUA)作為內參來分析PEPC在不同處理下的表達量。使用SOD作為參考基因,PEPC在NaCl處理后的相對表達在4 h,8 h和24 h為對照的1.9,0.7,2.7倍,PEPC表達量最低水平在NaCl處理4 d后。當使用最不穩定基因TUA作為內參時,PEPC在NaCl處理4 h的表達量為對照的6.7倍,隨著鹽處理時間延長,表達量逐漸下降,表達趨勢變化和SOD作為內參呈現出不同的變化趨勢(圖6)。該研究結果證實,使用不同的內參基因進行目的基因的相對定量會產生較大的差異。

圖6 使用不同的候選內參基因歸一化計算梭梭PEPC 的相對表達量Fig.6 Relative expression levels of PEPC normalized by different candidate reference genes

3 討論

qRT-PCR 是用來檢測不同類型樣本中基因表達水平的最有力工具之一,在生命科學及農業科學研究領域有著廣泛的應用。但內參基因的表達水平和穩定性會影響目的基因定量分析的準確性[29-30]。研究表明,特定內參基因的適宜性取決于試驗條件,不穩定表達的內參基因使用可能產生假陽性和偏倚結果[31-32]。因此,為了減少qRT-PCR 結果的偏差,尋找合適的內參基因校正目標基因表達水平是非常必要的。目前已對很多植物如蘋果[33]、楊樹[10]、人參[34]、柴胡[35]、牡丹[36]、秋石斛[37]等進行了不同組織或組織生長發育階段內參基因篩選。本研究在查閱其他植物中常用的內參基因結合課題組梭梭轉錄組數據庫比較和綜合評價后,篩選出了14個內參候選基因,并通過不同非生物脅迫處理比較分析備選內參基因表達穩定性。14個內參基因包括常作為內參使用的GAPDH[38]、TUB[39]、EF-1α[40]等。

最合適的內參基因表達水平應受環境因素、生理和發育階段的影響較小,在不同組織樣品中均能穩定表達[41]。有研究表明,用未經驗證的內參基因定量靶基因相較使用穩定表達的內參基因其表達量差異達100倍[42]。本研究也發現了類似的現象,使用穩定內參基因SOD和不穩定內參基因TUA分別校正梭梭PEPC表達,PEPC基因出現不同的表達趨勢。因此,在試驗中加入合適的內參基因校正目標基因是非常重要和必要的。此外在qRT-PCR實驗中,一些研究選擇1個內參基因來校正目的基因表達,但在某些特定試驗條件下,為了防止單個基因產生的定量誤差,可使用多個內參基因,這樣避免不同條件對同一基因表達水平的影響[43-45]。因而,可使用2個或2個以上的內參基因同時對靶基因進行校正,能獲得更準確的試驗結果[46]。

此外,內參基因在不同處理條件和不同植物或組織中并不是完全穩定的,有些內參基因只有在特定條件下才能穩定表達。在藜科鹽角草的研究中發現,不同氮脅迫下,TUA是組織最穩定的內參基因[47]。但在本研究中,TUA基因在所有處理樣本中的表達穩定性均較差。另外,ALB很少作為植物內參基因使用,但在本研究中發現ABA 處理和晝夜節律下,ALB是最穩定的內參基因,且有研究表明在油茶果實發育中ALB可作為穩定的內參基因使用[48]。

在另一項研究中,在干旱條件下,UBQ和EF-1α是馬鈴薯[49]和小花南芥[50]中最穩定的內參基因,RPⅡ是檉柳最穩定的內參基因,研究結果發現干旱脅迫下,宜采用TUB和RPⅡ進行靶基因校正。在熱脅迫研究中,H3常作為穩定的內參使用,本研究得到類似的結論,而Liu等[51]對黑豆熱脅迫處理后分析認為HIS3和eIF4A是最適用的內參基因。在不同鹽濃度處理中,PP2A和TUA5被認為是在不同組織和鹽處理中最穩定的內參基因[42]。本研究中發現TUB和RPⅡ基因是鹽脅迫反應中最合適的內參基因。以上研究表明植物受到生物脅迫、非生物脅迫和激素處理等會對基因的表達穩定性產生重大的影響。因此,在不同的試驗條件下選擇最合適的內參基因至關重要。目前,NormFinder、BestKeeper geNorm 和RefFinder是研究人員開發用于篩選樣本中穩定內參基因的分析工具。但由于計算方法不同,分析結果也會有所不同[24,52]。因此,在選擇不同處理、不同組織、不同發育階段的樣品內參基因時,通常會結合幾種軟件綜合進行分析。此外,為了更好地校正靶基因,針對一些非模式植物,新內參基因的挖掘也十分重要。

近年來,新一代高通量測序技術逐步完善,使用轉錄組為篩選新的內參基因提供了極大便利,間接為闡明目標物種的生物學問題及相關分子機制提供了有利的參考。梭梭是中國西部荒漠區重要的木本C4植物,也是荒漠區重要的造林樹種,梭梭極強的干旱抗性及荒漠適應性受到了極大的關注[53],梭梭抗性機制的分子研究也逐漸開展[54]。基于此,本研究以開發梭梭穩定內參為研究目的,通過梭梭轉錄組篩選14個潛在內參基因,經過不同逆境脅迫處理篩選得到相應處理下穩定的內參,為荒漠植物梭梭qRT-PCR 研究提供了標準化參考,也為今后開展梭梭分子生物學相關研究奠定基礎。

4 結論

研究分析和篩選了不同脅迫處理下梭梭穩定內參基因,結果表明:

(1)ALB是晝夜節律和ABA 處理下最穩定的內參基因。

(2)在干旱脅迫和鹽脅迫下,應采用TUB和RPⅡ進行靶基因校正。

(3)H3基因是熱脅迫處理下最為穩定的內參基因。

(4)對各內參基因的綜合穩定性排序,計算幾何平均值結果表明ALB和RPL32是所有樣本中最穩定的內參基因,SOD和RPL32是綜合最穩定的內參基因。