NAC類轉錄因子在‘碭山酥梨’黃化葉復綠過程中的表達分析

郭國凌 ,余 桃 ,湯小美 ,劉 倫 ,葉振風 ,賈 兵*

(1 安徽農業大學 園藝學院園藝作物品質生物學安徽省重點實驗室,合肥 230036;2 貴陽市農業試驗中心,貴陽 550018)

中國梨樹栽培面積和總產量分別約為98.64萬hm2和1 923萬t,分別占世界梨栽培總面積和總產量的69.32%和71.45%(https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL,FAQ,2021)。黃河故道地區是中國梨主產區之一,主栽品種為‘碭山酥梨’,近年來,由于肥水管理不當,造成當地土壤堿化嚴重,導致并加劇了梨葉黃化現象的發生,且已逐漸發展為其主要的生理性病害之一,嚴重威脅產業發展[1]。

鐵是梨樹生長發育過程中必不可少的微量元素之一,參與植物葉綠素合成在內的多種生物過程[2]。雖然土壤中鐵較為豐富,但多以植物難吸收的Fe3+形式存在,易造成植物缺鐵[3]。缺鐵會導致葉綠體瓦解而抑制葉綠素合成,并擾亂一系列生化反應,表現為幼葉失綠[4]。為獲取足量鐵以供自身所需,植物形成了以擬南芥、玉米為代表的鐵還原策略Ⅰ和以煙草、水稻為代表的鐵螯合策略Ⅱ 2種鐵吸收系統[5]。而梨屬于鐵吸收機制Ⅰ,其鐵吸收能力主要取決于根系酸化基因AHA2(PM H+-ATPases2)、鐵離子螯合還原酶基因FRO2(ferric-chelate reductase oxidase2)和鐵轉運蛋白基因IRT1(iron regulated transporter)的表達[6],而該基因表達受多種轉錄因子的調控,其中bHLH(basic-helix-loop-helix)是目前研究最為廣泛,且與植物缺鐵黃化密切相關的關鍵調控因子[7]。研究表明,Ⅰb 和Ⅳc類bHLH 可直接或間接促進AHA2、FRO2和IRT1的表達,增強植物抗缺鐵能力[8-10];但Ⅳa和Ⅳb類bHLH 因子則功能相反,其可抑制Ⅰb 和Ⅳc 類bHLH基因的表達或影響其蛋白穩定性,進而抑制植物缺鐵響應[11-13]。

作為另一種廣泛分布于植物內,且與低/高溫[14-15]、干旱[16-17]和鹽害[17-18]等多種非生物脅迫響應相關的轉錄因子,NAC(NAM、ATAF1/2 和CUC2)對于維持植物內鐵穩態平衡也具有重要意義。研究發現,蘋果中受缺鐵脅迫顯著誘導的Md-NAC1可通過促進AHA2/12和FRO2等基因的表達,增強根系酸化能力,促進植株對鐵的吸收[19];受缺鐵脅迫顯著誘導的AtNAC5則可以FIT(ferlike iron deficiency-induced transcription factor)和PYE(POPEYE)非依賴性途徑正向調控擬南芥的缺鐵脅迫應答[20];水稻中NAC 轉錄因子IDEF2則可直接增強水稻中促鐵吸收基因IDE2(iron deficiency-responsive cis-acting elements 2)的表達,促進鐵充足條件下的水稻葉片和根中的鐵積累[21]。

前期研究結果表明:‘碭山酥梨’黃化葉內Fe2+含量顯著低于正常葉,而以0.2% FeSO4溶液噴施生長期梨樹的黃化葉,可誘導其復綠,并促進其葉內Fe2+的積累[22]。前轉錄組數據顯示,梨葉黃化伴隨著多個NAC 轉錄因子的差異表達[1]。因此,試驗推測NAC類轉錄因子的表達可能與梨樹缺鐵黃化葉的復綠相關。目前關于PbrNAC在梨葉缺鐵脅迫應答和黃化葉復綠中的研究鮮見報道。試驗以生長期‘碭山酥梨’正常葉和黃化葉為試材,于黃化葉葉面噴施0.2%FeSO4溶液,驗證FeSO4處理對黃化葉內Fe2+含量的影響;基于前轉錄組數據,鑒定在梨正常葉和黃化葉內顯著差異表達的PbrNAC基因;采用生物信息學方法分析相關PbrNAC 蛋白的基本結構和理化性質等,結合qRT-PCR 技術分析其組織特異性表達模式和在梨缺鐵黃化葉復綠過程中的表達規律。以Pearson相關性分析,探討該過程中PbrNAC表達量與葉內Fe2+積累的關系;最后再以qRT-PCR,探討與葉內Fe2+積累相關的PbrNAC在地上部葉片和地下部根中的協同表達特性,以期為分析和豐富梨缺鐵黃化調控網絡奠定了基礎,為缺鐵脅迫敏感梨品種的分子改良提供方向。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2020年5月在安徽省碭山縣園藝場二分場開展,所用試材為場內呈開心形的15年生‘碭山酥梨’缺鐵黃化梨樹(C)和正常梨樹(N),其栽植密度適中,立地條件和栽培管理水平一致。于梨樹生長期以0.2% FeSO4溶液全面噴施梨樹缺鐵黃化葉葉面,施用量為10 L/株,并以等量清水處理后的梨樹正常葉(CN)和黃化葉(CC)作為對照。單次試驗處理含3個生物學重復,每次重復設3棵梨樹,共計9棵。于FeSO4處理后的第0天收集對照組葉片,并分別于處理后的第3,6,9,12天(T3、T6、T9和T12)收集葉樣保存于-80 ℃待用。Fe2+含量測定采用稀鹽酸-鄰菲啰啉比色法[23]。

為分析PbrNAC基因的組織表達特異性,收集該場區‘碭山酥梨’嫁接砧木‘杜梨’的幼嫩根毛、距離地面30 cm 以上的地上部莖段、正常梨樹新葉、盛花期花瓣和盛花后75 d的果實這5種組織,均保存于-80 ℃待用。

1.2 PbrNAC 基因篩選與鑒定

基于華大基因交互式報告平臺(https://report.bgi.com/ps/login/login.html)所提供的RNA-seq數據中N 和C 內各基因的注釋信息和FPKM 值(基因表達水平)[1],以P＜0.05、|log2αFC|≥1為標準(αFC,差異表達倍數值,即各基因的FPKMN與FPKMC的比值),篩選N 和C 內顯著差異表達的PbrNAC基因,并將其作為參與梨樹缺鐵黃化葉復綠的候選基因。候選PbrNAC基因和蛋白序列均下載自南京農業大學梨基因組數據庫(http://peargenome.njau.edu.cn/);同時為分析其在正常和黃化梨樹根系(杜梨)中的表達,參考在線平臺GDR(https://www.rosaceae.org/species/pyrus/all)所提供的杜梨基因組數據,以Bioedit(Version 7.0.9)軟件進行Blast 序列查詢和分析,獲取PbrNAC在‘杜梨’中的同源PbeNAC基因序列,并以DNAMAN(Version 9.0)進行序列比對分析和驗證。

分析候選PbrNAC在CC、CN以及T3、T6、T9和T12中的表達趨勢,以期分析其與梨樹缺鐵黃化葉復綠的關系,篩選出核心候選基因,基因命名參照Gong等的研究進行[24]。

1.3 候選PbrNAC 基因的生物信息學分析

使用在線工具Pfam(http://pfam.xfam.org/)和CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)對獲取的梨PbrNAC候選基因進行蛋白質結構域的驗證;參照NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)梨基因組注釋文件,以TB tools(Version 1.119)進行候選PbrNACs基因結構的可視化;使用在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對其蛋白的理化性質進行分析,主要包括其氨基酸數、分子量、等電位點、脂肪族氨基酸數和蛋白質疏水性等;于在線網站MEME(http://meme-suite.org/)進行motif基序分析,并以TB tools軟件進行可視化;以在線工具WoLF Psorf(https://www.genscript.com/wolf-psort.html/)開展亞細胞定位預測;以MEGA7.0軟件構建擬南芥AtNAC 蛋白與梨候選PbrNAC蛋白的系統進化樹,并以Clustal W 進行蛋白的多序列比對,進化樹構建方法為鄰接法,其中自展值的初始值設置為1 000次,其他參數均設置為默認值。系統進化樹的可視化和美化均于EvolView (https://www.evolgenius.info/evolview-v2/)進行。擬南芥AtNAC 蛋白序列均下載自TAIR(https://www.arabidopsis.org/)擬南芥數據庫,分類標準以Zhang等的研究[25]為參照。

1.4 RNA提取與實時熒光定量PCR分析

各樣本總RNA 的提取參照植物多糖多酚RNA 快速提取試劑盒(RN53-EASYspin Plus,北京艾德萊生物科技有限公司)操作方法;cDNA 第一鏈的合成參照其反轉錄試劑盒PC54-TRUEscript RT kit(+gDNA Eraser)說明進行。基于查詢得到的候選PbrNAC基因序列,使用Premier 5.0軟件設計其實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)引物(表1),擴增反應于ABI STEP-ONE(Thermal)熒光定量PCR 儀上進行。反應總體積為20 μL。其體系為Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix with No Rox(11201ES08,翌圣生物科技上海股份有限公司)10 μL,模板cDNA 2 μL、正向和反向引物各0.8 μL、DEPC 水 6.4 μL。PCR 反應程序為:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共計40個循環,每個樣品3次重復。以梨Actin基因作為內參,使用2-ΔΔCT 法計算PbrNAC基因的相對表達水平[26],在各組織中的表達水平以最大-最小歸一化處理后的數據展示。

表1 實時熒光PCR 引物序列Table 1 The primer pairs used for qRT-PCR

1.5 數據分析

數據運用Graphprism7 以單因素方差分析(ANOVA)法和Duncan多重極差法檢驗各處理的平均值,運用SPSS 23軟件在P＜0.05水平上,以最小顯著性差異法(least-significant difference,LSD)進行各樣本間的差異顯著性比較;相關性分析于Origin 2023上進行,采用Pearson相關系數法和雙變量分析方法,對組間均值和標準差進行雙側檢驗(P＜0.05),并以熱圖形式呈現。

2 結果與分析

2.1 梨候選PbrNAC 的篩選與序列分析

試驗于N 和C中共鑒定出136個PbrNAC基因,且以P＜0.05、|log2αFC|≥1的標準,篩選得到21個在N和C內顯著差異表達的PbrNAC(表2)。通過對這些基因的理化性質進行分析,發現其蛋白序列差異較大,所編碼的氨基酸數從167(Pbr004500.1)～829(Pbr038615.1)不等,相對分子量介于19 091.99(Pbr004500.1)～91 841.88 D(Pbr021393.1)之間,差異明顯;其等電點位于4.74～9.34之間,其中10個候選PbrNAC成員屬于堿性蛋白(pI≥7),11個成員為酸性蛋白(pI＜7)(表2)。在這21 個候選PbrNAC蛋白中,蛋白不穩定系數低于40的蛋白占比僅為4.21%,說明大多數屬于不穩定蛋白,且親水性分析結果表明,所有候選PbrNAC 蛋白的親水性值均為負值,表明其均為親水性蛋白;亞細胞定位預測結果顯示,除Pbr004500.1、Pbr029956.1、Pbr040028.1 這3 個PbrNAC 預測定位于細胞質外,其他候選基因均被預測定位于細胞核(表2)。

表2 梨候選PbrNAC 基因家族成員理化性質信息Table 2 The basic information of the candidate NAC genes of pear (Pyrus bretschneideri Rehd.)

2.2 梨候選PbrNAC 基因的保守結構域和保守基序分析

為驗證上述篩選結果的準確性,試驗分析了該候選基因的結構域和基序(motif)。結果顯示,該21個候選PbrNAC基因均含有1個高度保守的NAM結構域,且結構類似,均位于該基因的N 端(圖1,A)。說明篩選得到的PbNAC基因均屬于NAC轉錄因子。Motif 分析結果表明,該21 個候選PbrNAC基因所持有的motif數從4～9不等,其中Pbr026635.1基因上的motif數最多,為9 個,而Pbr032231.1基因的motif種類最為豐富,為8種。在所有motif中,motif 2,3,4普遍存在于各個基因(Pbr019212.1除外)(圖1,B),且80%以上的PbrNAC基因均含有motif 1和motif 5(圖1,B)。該21個PbrNAC的基因結構分析結果顯示,其內含子數總體較少,結構相對類似。其中11個基因的內含子數為2個,而Pbr004500.1、Pbr029956.1、Pbr019663.1、Pbr026635.1這4 個基因和Pbr002372.1、Pbr019212.1、Pbr032231.1、Pbr040028.1這4個基因的內含子數則分別為3個和5個,且Pbr004500.1和Pbr032231.1的內含子跨度較大(圖1,C)。除此之外,Pbr020079.1和Pbr038615.1結構相對復雜,各包含了6個和7個內含子(圖1,C)。

圖1 梨候選PbrNAC 的保守結構域(A)、保守基序(B)和基因結構(C)Fig.1 Conserved domain (A),motif (B) and gene structure (C) of PbrNAC members in pear

2.3 梨候選PbrNAC 基因的結構和系統進化樹分析

為進一步了解候選PbrNAC功能,試驗分析了其與擬南芥AtNAC成員之間的進化關系,發現該21 個PbrNAC成員主要分布于NAC2、TIP、ONAC022、NAM、ATAF、AtNAC3、NAP和SEU5這8個亞族,其中ONAC022和SEU5亞族中該成員最多,為3個;而NAP 和ANAC 亞族中最少,僅為1個(圖2)。除此之外,梨PbrNAC成員還存在3個獨立分支,包括Pbr020079.1、Pbr019663.1、Pbr019210.3和Pbr032231.1(圖2)。

圖2 梨候選PbrNAC 和擬南芥AtNAC成員間的系統進化分析The candidate PbrNAC and AtNAC members involved in abiotic stresses are marked with cyan stars and red rectangles,respectively.The outer ring lines and the letters above represent the gene members and names of the corresponding subfamily,respectively.Fig.2 Phylogenetic analysis of candidate PbrNACs in pear and AtNACs in Arabidopsis

2.4 梨候選PbrNAC 基因的組織表達特異性分析

試驗分析了PbrNAC基因在梨根、莖、葉、花和果實這5 種組織中的表達,結果表明:大多數PbrNAC基因在不同組織中均有所表達(圖3)。但各基因在不同組織中的表達也存在明顯差異。整體而言,各基因在果實中的表達量較低,而在根中的表達量偏高(圖3)。

圖3 梨候選PbrNAC 基因在不同組織中的表達量熱圖 最大-最小歸一化Values in the boxes indicate the max-min normalized relative expressions of genes,and ‘×’ in the boxes imply that the expressions of the genes are not detected in this tissue.Blue indicates a low gene expression,while red indicates a high gene expression.Fig.3 Heatmap of the expressions for the candidate PbrNAC genes in different tissues of pear (max-min normalized values)

2.5 梨候選PbrNAC 基因在梨缺鐵黃化葉復綠過程中的表達分析

為驗證FeSO4對C 內Fe2+含量的影響,以外源0.2% FeSO4對其進行處理,發現CN內Fe2+含量顯著高于CC,而T3、T6、T9和T12內Fe2+含量均較CC顯著升高,達到與CN無顯著差異水平(圖4)。

圖4 不同處理梨葉內Fe2+含量CN,Cc.Normal and chlorotic leavesi n control group treated with distilled water,respectively,T3,T6,T9,and T12.Chlorotic leaves at 3rd,6th,9th and 12th days after 0.2%FeSO4 application,respectively.Different lowercases above the column indicate a significant difference at the level of P＜0.05.The same as below.Fig.4 Fe2+ content in pear leaves with different treatments

為探究NAC轉錄因子在該復綠過程中的功能,分析了該21個候選PbrNAC基因在CN、CC、T3、T6、T9和T12葉內的相對表達量。結果表明,CC內Pbr022332.1、Pbr026949.2、Pbr007284.1、Pbr041562.1、Pbr004500.1、Pbr016205.1、Pbr016932.1、Pbr027956.1、Pbr029956.1、Pbr019663.1、Pbr040028.1、Pbr020079.1、Pbr007673.1、Pbr020642.1這14個基因的相對表達量顯著高于CN,且 除Pbr022332.1、Pbr007284.1、Pbr019663.1這3個基因在T12的表達量與CC無顯著差異外,其他各基因在T3、T6、T9和T12的表達量和這3個基因在T3、T6和T9的表達量均較CC顯著下降(圖5,A、B);而與之完全相反,Pbr032231.1、Pbr021393.1、Pbr026635.1、Pbr038615.1、Pbr019210.3、Pbr019212.1、Pbr002372.1這7個基因在CC中的表達量則顯著低于CN,而FeSO4處理可顯著誘導該基因的表達并使其水平顯著高于CC。其中,Pbr032231.1、Pbr026635.1、Pbr038615.1、Pbr019210.3、Pbr019212.1這5個基因在T9或T12的表達量與CN無顯著差異(圖5,C)。

圖5 不同處理梨葉內候選PbrNAC 基因的表達量Fig.5 Expression pattern of the candidate PbrNAC in pear leaves with different treatments

結合系統進化關系可知,同處于SEU5亞族的Pbr026949.2、Pbr041562.1、Pbr004500.1這3個基因在復綠過程中的表達趨勢基本一致,與之趨勢類似的還包括ONAC022 亞族的Pbr021393.1、Pbr026635.1和Pbr002372.1(圖5,A、B)。但同處于TIP亞族的Pbr040028.1和Pbr038615.1以及同處于NAC2亞族的Pbr019212.1和Pbr029956.1在響應該復綠過程中,表達模式則截然相反(圖5)。

2.6 梨候選PbrNAC 基因與復綠過程中Fe2+積累的相關性分析

為進一步探討PbrNAC與梨缺鐵黃化葉復綠的關系,試驗分析不同處理條件下的各葉樣內Fe2+含量與候選PbrNAC基因表達量之間的的相關性,并根據最終分析結果,將這21個候選PbrNAC基因劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三大類(圖6)。其中僅有第Ⅰ類中的Pbr007284.1、Pbr016205.1和Pbr007673.1這3個基因的表達量與各葉樣內Fe2+含量呈顯著負相關(圖6)。

圖6 不同處理梨葉內候選PbrNAC 基因表達量與Fe2+含量的相關性分析A.The numbers in the box mean the correlation coefficient between the two elements,green and red means a negative and positive correlation,respectively,and ‘*’ indicates a significant differences at the level of P＜0.05;B.Boxes in yellow(Ⅰ) and green background (Ⅱ) indicate gene sets that are significantly negatively and positively correlated with the previous clustered gene sets,respectively.and boxes in gray background (Ⅲ) only represent gene sets that are significantly correlated with the previous clustered gene sets,the same gene is highlighted in the same color.Fig.6 Correlation analysis between the expression of the candidate PbrNAC genes and Fe2+ content in pear with different treatments

雖然第Ⅱ、Ⅲ類中各PbrNAC基因的表達與各葉樣內Fe2+積累無顯著關聯(圖6),但第Ⅱ類中各基因的表達均與第Ⅰ類中3個基因的表達顯著相關,如Pbr016932.1、Pbr027956.1、Pbr029956.1等;而第Ⅲ類中各基因的表達量又均與第Ⅱ類中多個基因的表達量存在顯著關聯性,如Pbr020642.1、Pbr022332.1等(圖6)。

2.7 梨關鍵PbrNAC 基因在正常梨樹根系和黃化梨樹根系中的表達分析

為進一步分析PbrNAC與梨樹黃化復綠的關系,探討PbrNAC在梨地上部與地下部的表達是否存在一定關聯,試驗選擇10個與梨葉內Fe2+積累相關的基因,并鑒定出其在嫁接砧木——‘杜梨’中的同源基因,進而分析其在正常梨樹根系(NR)和黃化梨樹根系中(CR)的表達,結果顯示:杜梨內,3個與葉內Fe2+積累顯著負相關的Pbr007284.1、Pbr016205.1和Pbr007673.1的同源基因在CR的表達量顯著高于NR(圖7),且CC葉內顯著高表達的Pbr027956.1和Pbr029956.1的同源基因在CR內的表達量也較NR 顯著升高;而CC葉內顯著低表達的Pbr026635.1同源基因在CR 內的表達量則較NR 顯著降低(圖7)。但CC葉內顯著高表達的Pbr004500.1和Pbr020079.1的同源基因在杜梨CR 和NR 內的表達量并無顯著變化(圖7)。

圖7 正常與黃化梨樹根系內PbeNAC 基因相對表達量NR.Roots of normal pear trees,CR.Roots of Fe-deficiency chlorotic pear trees.The genes in the figures are associated with the accession numbers of ‘Duli’ and ‘Dangshansuli’,respectively.‘*’ indicates a significant difference at the level of P＜0.05.Fig.7 The relative expression levels of PbeNAC genes in normal and chlorotic pear root

3 討論

NAC基因作為植物中存在最廣泛的重要轉錄因子之一,參與植物生長發育,病原菌抵御以及干旱、高鹽和冷脅迫等在內的非生物脅迫等多種生物過程[27-29]。雖然近年來已逐漸在擬南芥[20]、水稻[21]和蘋果[19]中初步研究了NAC在其缺鐵脅迫中的作用,但其在梨樹缺鐵脅迫中的功能鮮見報道。該試驗共鑒定到21個在梨正常葉和黃化葉內顯著差異表達的PbrNAC基因,共涉及8個亞族,其中TIP、ATAF、AtNAC3、NAP這4個亞族中分布著多個已被報道的與植物非生物脅迫響應相關的AtNAC成員[30-32],而基因聚類分析是了解未知功能基因的重要途徑和依據[33],其中同處一分支的基因可能參與調控相同的生物過程,如番茄中bHLH Ⅰb類缺鐵脅迫正調控因子SlbHLH068[34]和蘋果中bHLH Ⅳc類抗缺鐵因子MdbHLH104[35]。因此,PbrNAC基因可能與梨樹非生物脅迫響應相關,如缺鐵脅迫等。而與之相符,多數PbrNAC基因也均響應了FeSO4處理所誘導的缺鐵黃化葉復綠,并呈現一定的變化規律,說明該基因可能與蘋果MdNAC1[19]、擬南芥AtNAC5[20]、和水稻IDEF2[21]功能類似,參與調控了梨缺鐵脅迫應答。植物葉片黃化是其質外體高pH 所引起的鐵分布不均和其內低三價鐵還原酶活所致[36]。因此,雖然本研究未分析該復綠過程中葉內總鐵含量的變化,但鑒于已有研究[36],以及Fe-SO4處理后黃化葉內顯著提升的Fe2+水平,推測PbrNAC可能與葉內三價鐵的還原和再分配相關。

研究表明,該21個候選PbrNAC基因中的多個基因的內含子數整體偏少,而內含子的剪切、修飾需要的時間往往大于其轉錄時間,相對而言,基因的內含子數量越多,其同一時間內轉錄生成蛋白質的量就越少,發揮的功能也就越弱[37]。因此,這些內含子相對較少的PbrNAC基因可能在梨樹遭遇缺鐵脅迫在內的非生物脅迫時被快速、強烈地誘導或抑制,從而迫使梨樹更迅速做出反應;同時,試驗也發現多個內含子存在于Pbr020079.1和Pbr038615.1基因中,而多個內含子的存在會增大可變剪接和外顯子重排的發生頻率,從而塑造基因的多種形式,豐度其功能[37]。因此,相較其他PbrNAC基因而言,Pbr020079.1和Pbr038615.1的功能可能更加多樣化。本試驗發現同處SEU5和ONAC022亞族的PbrNAC基因在FeSO4處理前后的表達模式類似,而同處TIP和NAC2亞族的PbrNAC基因表達模式相反,說明同一亞族的PbrNAC基因具有功能多樣性,其可能協同或拮抗調控著同一生物反應,如缺鐵黃化葉的復綠。與之相符,試驗還發現部分同處一個亞族的PbrNAC基因在地下部根系的表達和地上部葉內的表達模式相一致或相反,再次說明了PbrNAC基因的功能冗雜性和多樣性。

NAC因子可直接作用于下游基因,或以同源二聚體的形式參與由另一NAC 因子所介導的生物功能[38]。如水稻中ONAC020和ONAC023可通過與ONAC60因子互作而影響ONAC60 活性,從而參與調控水稻的種子發育[39];與此同時,該蛋白互作也可能會造成NAC 蛋白定位的改變,從而影響其活性。如非生物活性的細胞質定位PYE 因子可在bHLH104/105/115等因子的作用下而向細胞核移動,從而使其轉變成具有生物活性的核定位PYE因子[13]。因此,NAC-NAC 復合物的形成也是NAC因子行使調控功能的重要途徑。本試驗相關性分析結果表明,Pbr007284.1、Pbr016205.1和Pbr007673.1這3個基因在調控‘碭山酥梨’缺鐵黃化葉內Fe2+積累中可能直接起負調控作用,其高表達可能直接抑制梨樹鐵代謝相關生物過程中的基因表達,從而造成葉片缺鐵黃化,而外源FeSO4處理則可能以解除該抑制作用的方式,從而造成葉內Fe2+的積累;另一方面,雖然多數PbrNAC基因在不同處理條件下葉內的表達與黃化復綠葉內的Fe2+積累無顯著關聯,但其與這3個與黃化復綠葉內的Fe2+積累顯著相關的PbrNAC基因的表達呈顯著相關,說明該類PbrNAC成員可能以Pbr007284.1、Pbr016205.1和Pbr007673.1所調控的途徑間接參與了梨樹缺鐵黃化葉的復綠,如通過與這3位成員的互作造成后者轉錄活性抑制/促進,從而間接參與黃化葉復綠過程的調控;同時,這種互作可能會造成各自在細胞核-細胞質等組織中的移動,從而影響其活性,間接影響著黃化葉片的復綠。除此之外,試驗還利用qRT-PCR 分析了21 個PbrNAC基因在‘碭山酥梨’不同組織(根、莖、葉、花、盛花后75 d的果實)的表達模式,發現在各組織中均可不同程度地檢測到絕大多數PbrNAC的表達,但存在一定差異,說明該成員不同程度地參與梨樹的營養生長和生殖生長,且多數PbrNAC具有根表達的傾向性。根系是植物最先感知缺鐵等非生物脅迫的重要組織,可通過分泌相關化學物質應對缺鐵等不良環境,并可向上傳遞脅迫信號,使植株于第一時間做出反應來適應環境改變[40]。因此,PbrNAC也可能通過調控梨樹的根系生理狀態影響其化學物質的分泌以及信號分子的傳遞等,從而參與缺鐵等非生物脅迫應答。

4 結論

研究共得到21個可響應‘碭山酥梨’缺鐵黃化的PbrNAC基因,說明其與葉內Fe2+積累的關系,并初步明確了Pbr007284.1、Pbr016205.1和Pbr007673.1這3個基因和其他PbrNAC基因在該過程的負調控和間接調控作用,但其功能及具體作用機制仍有待進一步研究。