利用熒光SSR 標記鑒定茶樹自然雜交后代遺傳背景

楊 軍,游小妹,陳常頌

(福建省農業科學院 茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心/農業部福建茶樹及烏龍茶加工科學觀測實驗站,福州 350000)

茶樹[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]屬山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.),起源于中國西南地區,至今已有3 000多年的栽培歷史,并先后傳入日本、印度、斯里蘭卡等50多個國家,目前已成為全世界三大飲料作物之一[1]。茶樹是多年生、常綠木本、異花授粉植物,在遺傳組成上高度異質雜合,在品種選育初期通過早期鑒定和準確選擇目標性狀提高育種效率尤為重要[2-3]。分子標記技術是茶樹種質資源鑒定的重要手段之一[4-5]。余繼忠等[6]比較‘福鼎大白茶’、云南大葉茶雜交后代遺傳多樣性與親緣關系,顯示以云南大葉茶為母本比以福鼎大白茶為母本遺傳多樣性更高;姜曉輝等[7]鑒定結果顯示,5個云南白鶯山茶樹種質資源亞群間存在基因交流;陳立杰等[8]分析貴陽花溪古茶樹資源,結果表明貴陽花溪古茶樹資源由喬木型向灌木型進化;安紅衛等[9]對貴州茶樹種質資源進行鑒定,貴州茶樹種質資源間親緣關系、遺傳距離與取樣的海拔高度與密切相關;毛娟等[10]認為野生大理茶居群大雪山與栽培大理茶居群香竹箐和白鶯山遺傳距離相對較大,大理茶栽培居群和阿薩姆茶通過漸滲雜交,可能造成大理茶栽培居群的遺傳背景較復雜;張明澤等[11]分析黔南野生茶樹種質資源來源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著相關性。以分子標記技術對多個茶樹自然雜交后代進行親緣關系、遺傳多樣性、親本模擬分析的相關研究較少,利用分子標記輔助多個茶樹自然雜交后代進行鑒定,對于明確茶樹自然雜交后代遺傳組成上的差異,加快茶樹品種選育進程,具有重大的意義。

親本模擬分析是了解自然雜交后代遺傳背景的重要手段之一,主要用于分析親本的遺傳方式(花粉轉播距離、自交不親性)。常用的親本模擬分析軟件有PAPA、CERVUS、FAMOZ、和COLONY,其中李博等[12]對比PAPA、CERVUS、COLONY 親本模擬鑒定的準確率,認為CERVUS 親本模擬分析的準確率最高。近些年,在不同的植物與動物研究中都有大量利用CERVUS 軟件親本模擬分析,分別確定了馬尾松25粒種子[13]、油松126粒種子[14]、桉樹7個半同胞子代[15]、油橄欖29個子代[16]、圓口銅魚297尾子一代[17]、許氏平鲉18個子代[18]、鳙42尾子代[19]、長鰭吻鮈96個子代[20]的親本。茶樹上利用CERVUS軟件對茶樹自然雜交后代進行模擬分析,并將其結果與遺傳距離、遺傳多樣性分析相結合,研究茶樹自然雜交后代遺傳背景的報道較少。試驗以福建省主要栽培品種為參照,對‘丹桂’、‘白雞冠’、‘黃觀音’自然雜交后代進行親本模擬、親緣關系、遺傳多樣性、基因流等研究,旨在對茶樹自然雜交后代進行初步鑒定,確定自然雜交后代遺傳背景,為茶樹育種、茶樹自然雜交后代篩選提供初步依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料包括福建主要栽培品種與茶樹自然雜交后代種質資源一共116個,其中‘丹桂’(母本)自然雜交后代58個,‘白雞冠’(母本)自然雜交后代15個,‘黃觀音’(母本)自然雜交后代9個,福建省主要栽培品種34個(表1)。2021年10月在福建省農業科學院茶葉研究所采集116個材料的1芽2葉嫩葉后用液氮保存帶回實驗室,保存在-70 ℃冰箱中備用。

表1 116份供試材料的名稱與來源Table 1 Name and origin of 116 materials used in this study

1.2 樣品DNA提取與SSR擴增

1.2.1基因組DNA提取與檢測

采用金基強等[21]的方法,利用CTAB法提取茶樹嫩葉的總DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行茶樹基因組分子量大小檢測,用756-MC 型紫外分光光度計測定茶樹基因組DNA 的純度(OD260/280比值)。

1.2.2引物合成

參照文獻[22]引物序列(上海Sangon 公司合成),引物信息見表2。

表2 24對 SSR 引物及其序列Table 2 Nucleotide sequences of the 24 primer pairs

1.2.3PCR擴增和產物鑒定

PCR 反應體系為:ddH2O 18.8 μL,10×Buffer 2.5 μL(Mg2+),dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,Taq 聚合酶 0.2 μL(0.5 U/μL),模板DNA 1.0 μL。PCR 反應于美國ABI-9600型擴增儀上進行,熱循環程序為:94 ℃預變性4 min,使模板DNA 充分變性,然后進入下列溫度循環:94 ℃變性45 s,不同溫度條件退火60 s,72 ℃延伸75 s,重復35 個熱循環;72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。引物統一在反向引物(R)的5′段標記熒光(FAM/TAMRA),由上海百力格生物科技有限公司合成。擴增產物0.5 μL,GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL,HiDi 9.0 μL,混勻后使用ABI公司3730XL進行毛細管電泳。

1.2.4數據處理

采用ABI公司的GeneMapper4.0軟件,選擇GeneScanTM500 ROXTM作為分子量標準,對每1個擴增出的條帶記錄大小。運用PopGen3.2軟件計算等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He),Shannon's信息指數(I)和Nei's基因多樣性指數(H);群體間遺傳分化系數(Fst)、基因流(Nm),遺傳相似度(GI)、遺傳距離(GD)。使用PIC-CALC軟件計算各引物的多態性信息含量指數(PIC)。運用NTSYSpc2.1計算材料間遺傳距離,利用MEGA7.0進行UPGMA 聚類分析,并采用網站https://itol.embl.de/進行圖片優化。

1.2.5親本模擬分析

利用CERVUS 3.0軟件對子代模擬親本鑒定。對‘丹桂’、‘白雞冠’和‘黃觀音’自然雜交后代,34個候選親本進行親子鑒定分析,分別運行Simulation 程序與Parentage Analysis程序中的paternity子程序,模擬10 000次親子鑒定,候選親本檢測率為80%,位點檢測率為90%,基因型判別錯誤率為0.01,計算候選父本基因型似然對數比(LOD)值和95%置信水平,根據LOD 值大小判定親子關系。

2 結果與分析

2.1 引物的多態性信息量

從表3看出,24對SSR 引物在供試樣品中共獲得157 個等位基因,如圖1 為毛細管電泳對引物TM352擴增片段進行分析的部分結果,其中最多的為16個,最少為3個,平均為6.542;有效等位基因數(Ne)的變化范圍是1.235～6.166,平均為2.959。本試驗中PIC值變化范圍在0.226～0.819,平均大于0.5(PIC值平均值=0.542),因此,24對引物整體多態性較高。Shannon's多樣性指數(I)變化范圍在0.398～2.073,平均值為1.182,說明供試樣品具有較高的遺傳多樣性。

圖1 引物TM352的部分毛細管電泳圖譜Fig.1 Partial capillary electrophoresis patterns of TM352

表3 24對引物多樣性信息Table 3 Diversity information of 24 SSR primers

2.2 茶樹自然雜交后代親緣關系與親子模擬分析

從遺傳距離聚類(圖2)看出,供試材料主要分布在4個群體。群體1主要為‘丹桂’及其自然雜交后代;群體2主要為‘丹桂’、‘黃觀音’自然雜交后代與福建省烏龍茶品種;群體3主要為‘白雞冠’及其自然雜交后代;群體4主要為福建省綠茶品種,‘福鼎大毫茶’、‘歌樂茶’與‘福鼎大白茶’及其雜交后代,其中‘福鼎大毫茶’、‘歌樂茶’與‘福鼎大白茶’均為福鼎市當地品種;從4個群體茶樹品種分布看出,茶樹品種自然雜交后代大多與其母本親緣關系較近,遺傳基礎受母本遺傳信息影響較大。群體1中主要為‘丹桂’及其自然雜交后代,按親緣關系分為3個亞群。將遺傳距離聚類與親子分析結果(表4)相結合可以看出,亞群a由‘丹桂’及其29個自然雜交后代與BJG5組成,親子模擬母本(‘丹桂’)與真實母本(‘丹桂’)相符合為26個,準確率為89.6%,不符合的DG26、DG34模擬父本為‘肉桂’(‘肉桂’為‘丹桂’的母本),親子模擬受祖母‘肉桂’遺傳基礎的影響;BJG5 真實母本(‘白雞冠’)與模擬母本(‘白雞冠’)相符合,模擬父本為‘丹桂’,BJG5 與‘丹桂’聚類在一起,說明BJG5遺傳基礎更偏向父本‘丹桂’;29個‘丹桂’自然雜交后代模擬父本中21個為綠茶品種,8個為烏龍茶,推測亞群a整體遺傳基礎與同母本‘丹桂’的自然雜交后代具有更多綠茶屬性。

圖2 遺傳距離聚類圖Fig.2 Cluster diagram of genetic distance

表4 82個茶樹品種親子分析結果Table 4 Parentage analysis result of the 82 tea varieties

亞群b由18個‘丹桂’自然雜交后代組成,親子模擬母本(‘丹桂’)與真實母本(‘丹桂’)相符合為14個,準確率為77.8%;18個‘丹桂’自然雜交后代模擬父本中17個為烏龍茶品種,1個為綠茶品種,推測亞群b整體遺傳基礎與同母本‘丹桂’的自然雜交后代具有更多烏龍茶屬性。亞群c由6個‘丹桂’自然雜交后代組成,親子模擬母本(‘丹桂’)與真實母本(‘丹桂’)相符合為6個,準確率為100%,6個‘丹桂’自然雜交后代4個為烏龍茶品種,2個為綠茶品種。

群體2由5個‘黃觀音’、2個‘丹桂’自然雜交后代與17個烏龍茶品種組成,按親緣關系分為2個亞群。5個‘黃觀音’自然雜交后代親子模擬母本(‘黃觀音’)與真實母本(‘黃觀音’)相符合為4個,準確率為80.0%,4個與母本‘黃觀音’親緣關系較近,HGY8與‘黃旦’(‘黃觀音’的父本)親緣關系較近。DG29、DG52與烏龍茶品種‘春蘭’親緣關系較近,未與母本‘丹桂’聚類在一起,可能遺傳基礎受父本影響較大。

群體3由12個‘白雞冠’自然雜交后代,2個烏龍茶品種,DG16、HGY7組成。12個‘白雞冠’自然雜交后代親子模擬母本(‘白雞冠’)與真實母本(‘白雞冠’)相符合為12個,準確率為100%,10個模擬父本為烏龍茶品種,且母本‘白雞冠’聚類在一起,說明‘白雞冠’自然雜交后代多具有烏龍茶品種特征,遺傳基礎主要來自于母本‘白雞冠’。DG16、HGY7模擬父本均為‘白雞冠’,與‘白雞冠’親緣關系較近,說明DG16、HGY7受模擬父本遺傳基礎影響較大。

2.3 茶樹自然雜交后代遺傳多樣性分析

Hardy-Weinberg遺傳偏離指數D與Shannon's遺傳多樣性指數是衡量群體結構的重要指標之一。從表5看出,按材料來源分析,‘丹桂’、‘白雞冠’、‘黃觀音’自然雜交后代遺傳偏離指數D值均大于0,均表現為雜合子過剩現象,屬于親本單一,基本遺傳信息主要來自與其自然雜交后代母本,‘丹桂’、‘白雞冠’、‘黃觀音’自然雜交后代間Shannon's遺傳多樣性指數相當,遺傳多樣性均低于福建參照品種群體;福建參照品種遺傳偏離指數D值小于0,存在雜合子缺失現象,材料遺傳來源復雜,Shannon's遺傳多樣性指數最較高,遺傳多樣性高。按遺傳距離聚類群體分析,8個群體(包含亞群與雜合組)遺傳偏離指數D值均大于0,說明8個群體遺傳信息較為一致;其中群體3與雜合組Shannon's遺傳多樣性指數較高,群體3主要為‘白雞冠’自然雜交后代,推測‘白雞冠’父本的遺傳多樣性強于‘丹桂’、‘黃觀音’的父本;雜合組的遺傳來源豐富,遺傳雜合度高。116個材料整體遺傳偏離指數D值小于0,Shannon's遺傳多樣性指數為1.181,說明整體遺傳多樣性豐富。

表5 4個群體遺傳多樣性對比Table 5 Contrasting the genetic diversity of 4 groups

2.4 遺傳距離與遺傳相似度分析

從表6遺傳距離看出,‘丹桂’自然雜交后代與福建主要栽培品種遺傳距離數值最小,親緣關系最近;3個自然雜交后代群體中,‘丹桂’與‘白雞冠’的遺傳距離最小,親本模擬分析結果顯示DG16的模擬父本為‘白雞冠’,BJG1、BJG9的模擬父本為‘丹桂’,‘丹桂’與‘白雞冠’自然雜交后代親緣關系較近,受互為其模擬父本的影響。

表6 4個群體間遺傳距離和遺傳相似度Table 6 Genetic distance and genetic identity among 4 groups

群體2(亞群a)、群體2(亞群b)內主要材料為福建省烏龍茶品種,群體4主要材料為福建省綠茶品種;‘丹桂’自然雜交后代分布在群體1(亞群a、b、c)內,群體1(亞群b)與群體2(亞群a)、群體2(亞群b)的遺傳相似度分別為0.899、0.822,高于群體1(亞群a)、群體1(亞群c),群體1(亞群b)優先進行烏龍茶品種篩選;群體1(亞群a)與群體4的遺傳相似度為0.805,群體1(亞群a)優先進行綠茶品種篩選。

群體3主要為‘白雞冠’自然雜交后代,除雜合組外,與其遺傳相似度最高的為群體1(亞群b),親緣關系較近(表7)。

表7 8個群體間遺傳距離和遺傳相似度Table 7 Genetic distance and genetic identity among 8 groups

2.5 遺傳分化與基因流分析

參考Wright等[23]對遺傳分化系數Fst值大小對種群的分化程度高低進行評估,‘黃觀音’自然雜交后代與‘丹桂’、‘白雞冠’自然雜交后代的Fst值分別為0.065、0.054,達到中度分化,其他組合間幾乎無分化(表8)。從表9中可以看出,群體間Fst值范圍0.043～0.144之間,群體1(亞群b)與群體2(亞群a)小于0.05,兩群體幾乎無分化外,其他群體間均達到了中度分化,因此,按遺傳距離分類群體能使群體分化更為顯著,群體代表的遺傳信息特征更為明顯。群體間的基因流大小是衡量群體間遺傳差異的重要指標,Nm＞4,說明群體間基因流充分;Nm＜1,說明群體間可能發生遺傳漂變,基因交流較少[24]。本試驗中‘丹桂’、‘白雞冠’、‘黃觀音’自然雜交后代與福建主要栽培品種的基因流分別為8.331、5.806、6.706,說明‘丹桂’自然雜交后代與福建主要栽培品種基因交流最為充分,‘白雞冠’自然雜交后代與福建主要栽培品種基因交流為最低。按遺傳距離分類8個群體,群體間Nm值為1.476～5.480,群體1(亞群c)與群體4 間基因交流值為1.476,基因流最少,按遺傳距離分類群體能使群體基因交流降低。

表8 4個群體間遺傳分化系數和基因流Table 8 Genetic differentiation index and gene flow among 4 groups

表9 8個群體間遺傳分化系數和基因流Table 9 Genetic differentiation index and gene flow among 8 groups

2.6 分子方差分析

從表10中可以看出,供試材料取樣來源與遺傳距離聚類分類的群體內遺傳變異分別為88.52%、79.53%,群體內遺傳變異主要來自于材料間個體差異。遺傳距離聚類分類與材料取樣來源分類相比,群體內個體間遺傳變異變小,群體間遺傳變異增加。說明遺傳距離聚類分類比自然雜交后代群體來源分類,在一定程度降低自然雜交后代未知父本帶來遺傳的影響,能夠更清晰、準確掌握自然雜交后代的遺傳背景。

表10 群體內和群體間AMOVA分析結果Table 10 AMOVA results for within and among population variations

3 討論

3.1 茶樹自然雜交后代遺傳背景分析

親緣關系分析是鑒定種質資源遺傳背景的重要手段之一。郭俊等[25]對32份油梨資源進行親緣關系分析,親緣關系與地理分布有一定的關系;王鑫等[26]明確了17個類群的野生鐵線蓮親緣關系,部分鐵線蓮形態上十分相似,親緣關系較遠,尤其是槭葉鐵線蓮與其他16種親緣關系較遠;王留彬等[27]鑒定表明廣西南渡鎮茶樹群體與六堡鎮茶樹群體、栽培種間親緣關系較遠,材料間親緣關系遠近與栽培種、野生種關系密切。宋艷畫等[28]分析沒有血緣記錄的黑山羊親緣關系,依據利用CERVUS 軟件以父權分為11個群體,得出整個群體的親緣關系,為群體的選育選配提供參考。試驗按照材料間遺傳距離進行分類,顯示多數自然雜交后代都與其母本親緣關系較近。‘丹桂’自然雜交后代多數與‘丹桂’聚類在群體1,‘丹桂’的自然雜交后代親緣關系都較為接近;群體1中的3個亞群,按模擬父本(父權)分類群體1亞群a的模擬父本主要為綠茶品種,可以優先進行早生、高香綠茶鑒定篩選;群體1亞群b的模擬父本主要為烏龍茶品種,可以優先進行高香烏龍茶篩選。說明同一母本遺傳背景情況下,親緣關系分析與按模擬親本(父權)分群結果具有相關性,且親本模擬分析比親緣關系分析能更深刻了解供試材料的遺傳背景,有助于利于分子標記進行輔助育種選擇。

3.2 茶樹自然雜交后代遺傳多樣性分析

Shannon's多樣性指數是衡量植物遺傳多樣性重要指標之一,在茶樹種質資源鑒定上進行大量研究。楊陽等[29]利用EST-SSR 標記研究黃金茶群體遺傳多樣性,結果顯示湖南黃金茶38 個材料的Shannon's多樣性指數為0.550;王松琳等[30]采用SSR 標記對16個白化和黃化茶樹品種遺傳多樣性分析,Shannon's信息指數0.790;楊軍等[31]對‘金牡丹’、‘悅茗香’、‘紫玫瑰’自然雜交后代進行遺傳多樣性分析,結果顯示Shannon's 信息指數分別0.899、1.041、1.010。彭靖茹等[32]分析14 份廣西德保縣和隆林縣野生古茶樹遺傳多樣性,茶樹種質資源Shannon's多樣性指數0.970;周萌等[33]對122個云南野生茶樹種質資源進行遺傳多樣性分析,Shannon's多樣性指數為0.880;姜曉輝等[34]分析廣東曲江羅坑茶與豐順馬圖茶的Shannon's多樣性指數分別為1.217與1.228;本試驗中,‘丹桂’、‘黃觀音’、‘白雞冠’3個群體的Shannon's多樣性指數分別為1.029、1.035、1.044,與前人研究相比,高于黃金茶群體、浙江白化和黃化茶、云南野生茶樹,與‘金牡丹’、‘悅茗香’、‘紫玫瑰’自然雜交后代相當,低于廣東曲江羅坑茶與豐順馬圖茶,初步說明‘丹桂’、‘黃觀音’和‘白雞冠’3個群體遺傳多樣性豐富。