流式細胞分析儀在細胞因子檢驗中的應用價值

董一波，沈煜軒，姚沈明

江蘇盛澤醫院檢驗科，江蘇 盛澤 215228

流式細胞分析儀在細胞因子檢驗中具有重要的應用價值。細胞因子是一類分泌性蛋白質，在免疫系統中扮演著關鍵的角色，調控細胞間的相互作用和信號傳導，影響著炎癥、免疫反應和細胞生長等生理過程[1-2]。對于了解炎癥、免疫反應、感染、自身免疫性疾病等生理和病理過程，以及指導相應的診斷和治療，細胞因子的檢測顯得至關重要。過去幾十年中，流式細胞分析儀已經成為在細胞因子檢驗中廣泛應用的工具之一，其應用價值愈加凸顯。因此，研究和監測細胞因子的表達水平對于了解免疫系統的功能、疾病診斷和治療等領域具有重要意義[3-4]。傳統的細胞因子檢驗方法包括酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和免疫印跡等，這些方法通常需要較多的樣本量，耗時且復雜，不適用于大規模樣本的高通量分析[5-6]。流式細胞分析儀的出現革命性地改變了細胞因子檢驗的方式，本研究將2023年2—5月在江蘇盛澤醫院接受健康體檢和門急診住院的112 例患者作為研究對象，探討流式細胞分析儀在細胞因子檢驗中應用的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院接受健康體檢者和門急診住院患者（共112 例）的血漿標本，確保標本無溶血、血脂及血凝塊現象。采用BD FACS Canto Ⅱ流式細胞分析儀（生產廠家：青島瑞斯凱爾生物科技有限公司）的8 項細胞因子檢測試劑盒進行檢驗。

1.2 方法

檢測項目：用8 項細胞因子檢測試劑盒對標本的白細胞介素（interleukin, IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、干擾素γ（interferon-γ, IFNγ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNFα）的濃度及分布。

檢測原理：試劑盒在免疫學分析法基礎上運用直接夾心法的原理進行分析，與常規“三明治”免疫分析方法相同，采用熒光發光微球做免疫反應的固相，隨后采用免疫學分析法將其與流式細胞分析儀相結合，檢測血漿標本中細胞因子的濃度水平。

技術原理：采用熒光發光微球耦聯的細胞因子抗體與生物素所標記的循細胞因子配對抗體、標本以及校準品中的細胞因子相結合，從而形成“三明治”復合物，隨后與加入標記有藻紅蛋白的SA-PE反應進行分析。具體熒光發光強度采用流式細胞分析儀進行檢測，得到標本中含有的細胞因子濃度，從而加以分析。

預處理方法：在驗證其性能前就需要校對儀器的標準性，檢測質量控制的有效性，保障儀器的標準性和檢測質量在可控范圍內方可開展檢測工作。

檢測方法：首先將實驗用試劑恢復到與室內溫度相同的標準，在凍干粉基質當中添加5 mL 實驗緩沖液，將其靜置15 min，等到凍干粉溶解后采用渦旋旋轉方式將其進行充分攪勻，剩余的基質分裝到EP 管當中，將其儲存到-20℃的環境下維持1 個月。在校準品凍干粉當中添加250 L 實驗緩沖液，將凍干粉完全溶解后在常溫室內靜止10 min，濃度為1 000.00 pg/mL，將其標注為A7。準備6 支空管，將其分別標記為A1、A2、A3、A4、A5、A6，并在每支空管中放置75 L 實驗緩沖液，并進行倍比稀釋，在A7 中取25 L 溶液放置到A6 當中并充分混合，采用同樣的方法依次進行稀釋，分別得到A1、A2、A3、A4、A5 的校準品。此外，再選取1 支空管，只加入實驗緩沖液，將其標注為A0。A0～A7 校準品終濃度為：A0 0.00 pg/mL，A1 2.44 pg/mL，A2 9.77 pg/mL，A3 39.06 pg/mL，A4 156.25 pg/mL，A5 625.00 pg/mL，A6 2500.00 pg/mL，A7 1000.00 pg/mL。標本根據實際情況使用實驗緩沖液，并進行稀釋，在校準管中分別添加25 L 的基質與校準品，在標本館中分別添加25 L 的試驗緩沖液和稀釋樣品，再在所有管中添加25 L 捕獲微球抗體，振蕩均勻1 min 后再加入25 L 檢測抗體，將試管用錫箔紙包住，在室內溫度為25℃左右的環境下避光震蕩2 h。隨后添加25 L SA-PE，用錫箔紙包住后在室內溫度為25℃左右的環境下避光震蕩30 min，2 500 r/min，離心處理5 min，除去上清液后添加200 L 10×洗滌緩沖液，采用旋渦將微球重懸30 s，1 600 r/min離心處理5 min后去除上清液，結合流式細胞分析儀上樣的需求在每個試管內添加150～300 L 洗滌緩沖液，經渦旋微球重懸后上機進行檢測。

1.3 觀察指標

①分析8 項細胞因子的精密度，連續5 d 做精密度校準檢測，每天對同一濃度的精密度具有溯源性的校準品，檢測5 次，每個標本獲取25 組數據。經結果的統計與分析，計算變異系數（CV 值）。精密度范圍CV≤15%。

②分析8 項細胞因子的準確度，連續5 d 做準確度檢測，每天對統一濃度的準確度校準品做3 次測定，每個標本獲取15 組數據，對結果進行記錄并加以分析，相對偏差≤±15%則準確度可靠。

③分析8 項細胞因子線性范圍驗證實驗結果，首先采用Grubbs 法剔除離群值，運用Excel 做回歸方程的現行分析，判斷是否為非線性，按照濃度血清的配置稀釋關系計算各實驗樣品內含有的分析物濃度，獲取系列樣品的理論值。根據系列濃度血清進行反復測定，計算均值，每份均值與理論值做相關分析，偏離＜10%，計算方法：Y=bX+a。

1.4 統計方法

用SPSS25.0 統計學軟件和Microsoft Excel 2013軟件處理并分析數據，計算CV 值和相對偏差值。采用Pearson 相關分析對線性驗證中各濃度理論值和實測值的關系進行分析，計數資料用例數（n）和率（%）表示，進行χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 8 項細胞因子精密度分析

低值和高值連續5 d 檢測結果CV 值均≤15%，見表1。

表1 8 項細胞因子精密度分析（%）

2.2 8 項細胞因子準確度分析

低值和高值連續5 d 檢測結果準確度均符合（偏差≤±15%）范圍，見表2。

表2 8 項細胞因子準確度分析（pg/mL）

2.3 8 項細胞因子線性規范驗證實驗結果分析

8 項細胞因子檢測試劑盒在流式細胞分析儀上檢測結果均在范圍內呈線性，各細胞因子線性理論范圍為2.44～1 000.00 pg/mL，r2≥0.98，滿足準確度標準范圍，見表3。

表3 8 項細胞因子線性規范驗證實驗結果分析（pg/mL）

3 討論

流式細胞分析儀能夠同時測量多個細胞因子的表達水平，包括細胞表面標志物和胞內細胞因子[7-8]。這種多參數分析使研究人員能夠全面了解免疫細胞群體的狀態，揭示不同細胞亞群之間的差異，為疾病診斷和治療提供更準確的信息[9-10]。流式細胞分析儀能夠檢測極低濃度的細胞因子，因此對于疾病早期診斷和監測起著至關重要的作用[11-12]。此外，它可以在短時間內分析大量樣本，適用于臨床試驗、藥物篩選和流行病學研究等需要高通量分析的場合[13]。該檢測方式還可以用于動態監測細胞因子的變化，例如，在治療過程中追蹤患者的免疫反應或觀察細胞因子的時空表達[14]。這有助于個體化治療的制定和疾病進展的監測。吳晗等[15]在研究中指出8 項細胞因子低值和高值精密度在CV≤15%范圍內，準確度在偏差≤±15%范圍內，且各項細胞因子線性理論范圍2.44～10 000.00 pg/ml，r2≥0.98，符合準確度的需求。本研究最終研究結果與該學者研究結果一致，證明本研究具有較高的可行性。

本研究中指出，8 項細胞因子的低值批間CV 值為2.58%、9.25%、1.46%、8.43%、3.29%、2.57%、5.34%、3.75%；高值批間CV 值為4.13%、6.45%、4.25%、14.13%、5.58%、4.36%、5.16%、11.15%。8 項細胞因子準確度分析，低值批間相對差分別為-2.64、2.85、-3.72、0.98、-0.79、-4.58、-1.58、-0.55；高值批間相對差分別為2.89、-3.16、2.46、-3.28、-1.19、-2.46、-8.50、-5.16。8 項細胞因子線性規范實驗結果中r2值分別為0.998 8、1.000 0、0.999 8、1.000 0、0.999 4、0.999 5、0.984 3，在r2≥0.98 標準范圍內。因此，流式細胞分析儀在細胞因子檢測中應用的精密度、準確度和現行規范結果均符合標準范圍，可在臨床檢測中提供準確且可信的數據，以供參考。

綜上所述，流式細胞分析儀在細胞因子檢驗中應用的精密度、準確度及重復性較好，可滿足臨床需求，值得在實驗室相關檢測中推廣應用。