miR-144-3p 通過調控ABCG2 信號通路對膀胱癌細胞的影響

孫士恒，夏似龍，張博，周大宏

黑龍江省醫院泌尿一科，黑龍江 哈爾濱 150036

膀胱癌為臨床常見惡性腫瘤，發病原因復雜，隨腫瘤細胞增殖、遷徙，會增加周圍組織腫瘤細胞浸潤損傷，威脅患者生命安全，需積極控制治療，以延長患者生存期限[1]。化療為該病重要治療環節，但治療后存在復發風險，且部分患者存在耐藥性，影響臨床對病情控制治療效果。ATP 結合轉運蛋白G 家族成員2（ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2）信號通路可依賴ATP 將藥物排到細胞外，且ABCG2 一些單核酸多態性與腫瘤細胞耐藥性存在顯著關系[2-3]。miRNA 為近年來研究較多的非編碼RNA，具有參與、調控細胞增殖、分化、凋亡、遷移等功能。有研究證實，miR-144-3p高表達，對卵巢細胞增殖及遷移具有抑制作用，提升腫瘤細胞對多西他賽敏感度[4]。但目前為止，在對膀胱癌研究中，miR-144-3p 是否可靶向調控ABCG2 信號通路影響細胞狀態研究較少。為此，本研究選取2023年5月黑龍江省醫院泌尿科實驗室1株人膀胱癌T24 細胞株為研究對象，探究miR-144-3p 對膀胱癌細胞功能影響及其與ABCG2 信號通路之間靶向關系，旨在為該病臨床治療提供參考依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

材料名稱及生產廠家信息，見表1。

表1 材料信息

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人膀胱T24 細胞株、正常膀胱上皮SV-HUC-1 細胞株，接種于DMEM 培養基（10%胎牛血清），5%CO2、37℃、濕度50%～60%環境培養，細胞融合度達到80%時，應用0.25%胰酶處理，傳代培養3 代后備用。

1.2.2 細胞轉染 將傳代培養3 代的細胞接種在6孔板中，放置在培養箱中培養（37℃, 24 h），細胞融合度達到50%時，將T24 細胞分為A 組、B 組、C 組：A 組轉染miR-144-3p 模擬物，B 組轉染miR-144-3p抑制劑，C 組轉染無意義序列；依據Lipofectamine 2000 說明進行轉染操作（培養條件為5%CO2、37℃、濕度50%～60%）；轉染操作完成后6 h，細胞接種于新鮮含血清的完全培養基中繼續培養（37℃）。

1.2.3 miR-144-3p、ABCG2 表達水平檢測 以實時定量聯合酶鏈式反應（quantification real-time polymerase chian reaction, qRT-PCR）法檢測。以Trizol 提取細胞中總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA 濃度、純度，以A260/A280=2.01 的RNA 為目標RNA，將其以逆轉錄試劑盒處理合成cDNA 后，調整逆轉錄產物濃度為50 ng/μL，β-action 為內參，對稀釋后的逆轉錄產物進行熒光定量水平檢查。PCR 條件：94℃ 2 min，94℃ 20 s，60℃ 35 s，72℃ 1 min；40 個循環，最后72℃ 10 min；反應結束后熔解曲線分析，確認無非特異性擴增后，以相對定量法（2.ΔΔCT）計算每組細胞中miR-144-3p、ABCG2 相對表達水平。

1.2.4 細胞增殖檢測 以CCK-8 法進行細胞增殖檢測。以1×104個/孔，將細胞接種于96 孔板中，培養前、培養48 h 時添加CCK-8 試劑染色后繼續孵育1 h，在490 nm 處檢測其OD 值。

1.2.5 細胞凋亡檢測 以流式細胞儀檢測細胞數量，計算細胞凋亡率。各樣本細胞離心（離心條件：轉速1 000 r/min，時間10 min），棄上清，PBS 緩沖液反復清洗后，離心（離心條件：轉速1 000 r/min，時間10 min），棄上清，細胞避光重懸，加5 μl 跨膜蛋白V，振蕩混勻室溫靜置10 min，加5 μl 7-氨基放線菌（AAD），振蕩混勻，1 h 內流式細胞儀檢查細胞數量，計算細胞凋亡率。

1.2.6 細胞遷移檢測 以Transwell 檢測細胞遷移能力。各組細胞轉染48 h 后，0.05%胰酶消化，細胞重懸后，鋪于Transwell 上室（5×103個/孔），下室添加20%胎牛血清，培養箱（37℃）中孵育1 d；取出Transwell 小室，棉簽擦去上室碎片及細胞，下室洗白以0.1%結晶紫染色，PBS 洗滌后井下觀察下室濾膜中細胞，統計遷移細胞數量。

1.2.7 靶向關系分析 應用在線數據庫TargetScan預測分析，發現ABCG2 3’-UTR 上存在miR-144-3p靶點，提示ABCG2 可能是miR-144-3p 靶基因。將ABCG2 3’-UTR 克隆、3’-UTR 結合位點突變序列與報告基因載體相連。將對數生長期的T24 細胞接種于24 孔板（2×104個/孔），培養箱（37℃）中培養，轉染前3 h，將細胞更換為RPMI-1640 培養基。

將細胞以不同轉染方法進行分組：①將預測靶基因ABCG2 的3’-UTR 報告基因質粒、miR-144-3p與ABCG2 的3’-UTR 結合位點突變報告基因質粒與miR-144-3p mimic 共同T24 細胞轉染，分別記為3’-UTR-WT NC 組、3’-UTR-Wut miR-144-3p 組；②以共同轉染mimic control 作為對照，記為3’-UTR-WT NC 組、3’-UTR-Wut NC 組；轉染48 h 后，以雙熒光素酶報告基因試劑盒檢驗，以測定的螢火蟲熒光素酶熒光強度/海腎熒光素酶熒光強度水平表示熒光素酶相對活性。

1.3 質量控制

每組細胞均進行3 個平行樣本，每個樣本細胞檢測均設置3 個復孔（每組共計12 個樣本量），每個樣本重復檢測3 次，取3 次檢測結果平均值為最終結果。

1.4 觀察指標

①比較T24 細胞、SV-HUC-1 細胞轉染前miR-144-3p、ABCG2 水平；②比較A 組、B 組、C 組轉染48 h 后miR-144-3p、ABCG2 水平，細胞增殖、凋亡、遷移能力；③比較miR-144-3p 與ABCG2 靶向結合關系。

1.5 統計方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，行t檢驗，方差齊性分析以F檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染前T24 細胞、SV-HUC-1 細胞中miR-144-3p、ABCG2 表達水平對比

轉染前，T24 細胞中miR-144-3p 表達水平較SV-HUC-1 細胞細胞種類低，ABCG2 水平較SVHUC-1 細胞組高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 轉染前T24 細胞、SV-HUC-1 細胞中miR-144-3p、ABCG2 表達水平對比(±s)

表2 轉染前T24 細胞、SV-HUC-1 細胞中miR-144-3p、ABCG2 表達水平對比(±s)

細胞種類T24 細胞（n=12）SV-HUC-1 細胞（n=12）t 值P 值miR-144-3p 0.50±0.12 1.37±0.35 8.145＜0.001 ABCG2 3.04±0.45 1.06±0.20 13.928＜0.001

2.2 轉染48 h 各組細胞中miR-144-3p、ABCG2 表達水平對比

轉染48 h 時，miR-144-3p 水平由低至高依次為B 組、C 組、A 組，差異有統計學意義（P＜0.05），ABCG2 表達水平由低至高依次為A 組、C 組、B 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 轉染48 h各組細胞中miR-144-3p、ABCG2表達水平對比(±s)

表3 轉染48 h各組細胞中miR-144-3p、ABCG2表達水平對比(±s)

組別A 組（n=12）B 組（n=12）C 組（n=12）F 值P 值miR-144-3p 2.21±0.28 0.08±0.02 1.05±0.16 392.149＜0.001 ABCG2 0.75±0.14 3.74±0.95 1.04±0.16 103.287＜0.001

2.3 轉染48 h各組細胞增殖、凋亡、遷移能力情況對比

轉染48 h 時，細胞增殖能力（A 值）由低至高依次為A 組、C 組、B 組，細胞凋亡率由低至高依次為B組、C 組、A 組，細胞遷移數由低至高依次為A 組、C組、B 組，ABCG2 表達水平由低至高依次為A 組、C組、B 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 轉染48 h 各組細胞增殖、凋亡、遷移能力情況對比(±s)

表4 轉染48 h 各組細胞增殖、凋亡、遷移能力情況對比(±s)

組別A 組（n=12）B 組（n=12）C 組（n=12）F 值P 值A 值0.40±0.07 0.95±0.15 0.68±0.10 72.802＜0.001凋亡率（%）45.70±6.95 5.50±0.93 16.53±2.77 273.249＜0.001細胞遷移（個）48.58±7.92 205.61±34.52 98.93±10.23 170.304＜0.001

2.4 雙熒光素酶檢驗結果對比

經在線數據庫TargetScan 預測，測得ABCG2 3’UTR 與miR-144-3p 存在結合靶點；共轉染48 h 時檢測，3’-UTR-WT miR-144-3p 組熒光素酶活性較3’-UTR-Wut miR-144-3p 組低，差異有統計學意義（P＜0.05）；3’-UTA-WT NC 組、3’-UTR-Mut NC 組熒光素酶活性相近，差異有統計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 雙熒光素酶檢驗結果對比(±s)

表5 雙熒光素酶檢驗結果對比(±s)

注：與3’-UTR-WT miR-144-3p 組熒光酶相對活性相比，①P＜0.05；與3’-UTA-WT NC 組熒光酶相對活性相比，②P＞0.05。

組別3’-UTR-WT miR-144-3p 組（n=12）3’-UTR-Wut miR-144-3p 組（n=12）3’-UTA-WT NC 組（n=12）3’-UTR-Mut NC 組（n=12）F 值P 值熒光酶相對活性0.52±0.07（0.87±0.10）①1.01±0.13（1.02±0.11）②59.663＜0.001

3 討論

惡性腫瘤進展過程中，腫瘤細胞增殖速度快、遷移能力強、凋亡率水平低，提示腫瘤組織惡性程度高[5-6]。在對可切除病灶手術治療中，受細胞遷移能力影響，存在術后繼發性腫瘤情況[7-8]。若腫瘤抗凋亡能力強、增殖速度快，則單純化療治療難以滿足實體腫瘤控制效果。且若腫瘤細胞對化療藥物耐藥，會進一步增加治療難度[9-10]。而在對腫瘤細胞耐藥分析中，下調ABCG2，可抑制其在細胞膜上功能，避免ATP 將藥物經通道排出體外，以提升化療藥物對腫瘤細胞DNA 破壞作用及增殖抑制作用[11-12]。

本研究結果顯示，轉染前，T24 細胞中miR-144-3p 表達水平為（0.50±0.12），較SV-HUC-1 細胞（1.37±0.35）低，ABCG2 水平為（3.04±0.45），較SVHUC-1 細胞（1.06±0.20）高（t=8.145、13.928，P＜0.05），You B 等[13]在研究中發現，miR-144-3p 在前列腺癌細胞中低表達，而上調miR-144-3p 可有效抑制細胞增殖、抑制細胞集落形成。提示miR-144-3p 表達上調，對腫瘤細胞增殖具有抑制作用，與本研究結論一致。而通過轉染上調或下調細胞中miR-144-3p 后，其ABCG2 表達水平也出現相應變化，提示miR-144-3p 與ABCG2 表達存在一定相關性。而經雙熒光素酶檢驗結果顯示，確認miR-144-3p 為ABCG2 信號通路上的一個直接靶基因。而在對上調、下調T24 細胞miR-144-3p 水平后，細胞增殖、遷移、凋亡水平均出現顯著變化，考慮原因為，ABCG2 為外源性轉運蛋白，其高表達可能會通過鐵死亡，造成氧化應激反應及線粒體損傷促進腫瘤臨床分期增加；在上調miR-144-3p 后，其靶基因ABCG2 表達下調，可維持細胞線粒體及細胞外微環境穩定，可能為抑制細胞快速增殖遷移及凋亡異常的影響因素[14-18]。

綜上所述，ABCG2 3’UTR 與miR-144-3p 存在結合靶點，miR-144-3p 表達上調可抑制ABCG2 表達，并抑制細胞遷移、增殖，促進細胞凋亡，考慮可將miR-144-3p 作為治療靶點，以控制膀胱癌進展、降低化療藥物耐藥性，提升患者病情控制效果。