Notch 信號通路在曲安奈德治療裸鼠血管瘤模型過程中的表達

湯明生，劉強，陳俊，汪哲民

1.深圳市龍崗中心醫院普外科，廣東深圳 518116；2.深圳市龍崗中心醫院總務科，廣東深圳 518116

血管瘤是以血管瘤內皮細胞異常增殖和大量血管增生為主要病理學特征的嬰幼兒常見良性腫瘤。糖皮質激素可治療嬰幼兒血管瘤，但激素治療血管瘤的機理目前并不十分清楚，報道的臨床效果也差別很大[1]。本研究通過分子水平檢測曲安奈德干預裸鼠血管瘤模型過程中糖皮質激素受體亞型糖皮質激素受體α（glucocorticoid receptorα, GRα）、Notch 信號通路亞型Notch1 以及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGRF）和Split 多毛增強子（hairy and enhancer of split, HES1）蛋白水平，選取2022 年12 月—2023 年6 月深圳市龍崗中心醫院18 只小鼠為研究對象，探討糖皮質激素治療血管瘤敏感性的關系，特別探討細胞增殖分化的Notch 信號通路在激素治療血管瘤過程中的作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

Balb/c nude 裸鼠[許可證號：SCXK（蘇）2018-0008）]，18 只，雌性，4 周齡。普通飼料飼養于溫度20～26℃，濕度40%～70%的環境中。

1.2 試劑與儀器

小鼠血管內皮瘤（murine haemangioendothelioma, EOMA）細胞（BNCC228091），曲安奈德（KD2216） ， DH5α/Stbl3 （CS01010/CS05010） ，2xGPV8PCRMasterMix（PE06010，通用生物），胎牛血清（26050070），DMEM（11965118）， 牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）（A8020）。所使用抗體：小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（mouse anti-GAPDH），辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體（HRP conjugated goat anti-mouse IgG ）（H+L），兔抗GRα 抗體（rabbit anti GRα），兔抗Notch1 抗體（rabbit anti Notch1），兔抗HES1 抗體（rabbit anti HES1），兔抗EGFR 抗體（rabbit anti EGFR），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體（HRP conjugated goat anti-rabbit IgG）（H+L）。

PCR 儀（A100）；細胞培養箱（3111），倒置生物顯微鏡（MF52-N）；全自動酶標儀（SuPerMax 3100），全自動化學發光圖像分析系統（Tanon-5200）。普通PCR 擴增儀（TC-EA），熒光PCR 儀（CFX Connect?實時）；石蠟包埋機（HistoCore Arcadia）。

1.3 方法

1.3.1 血管瘤模型構建 動物適應性飼養約7 d 后，細胞房收集小鼠血管內皮瘤細胞EOMA，重懸為5×107個/mL 的細胞懸液。麻醉后綁定裸鼠，碘伏消毒裸鼠右側背部區域注射EOMA 細胞，輕輕吹打混勻細胞懸液，1 mL 注射器吸取0.1 mL 細胞懸液，于裸鼠右側背部皮下進針，皮下潛行5 mm 左右至裸鼠右側背部近腋下位置，注射細胞懸液0.1 mL，即每只裸鼠接種5×106個細胞，注射完成旋轉退針，棉棒按壓針孔至無液體流出。

1.3.2 分組及處理 瘤體體積長至約100 mm 時隨機分3 組，分別為Control 組、Control+TA for 7 days 處理組、Control+TA for 14 days 處理組，每組6 只，按分組同時給予相應藥物處理。曲安奈德處理組向瘤體內注射曲安奈德（triamcinolone acetonide, TA）注射液9.01 mg/kg；Control 組（對照組）瘤體內注射等量生理鹽水，給予1 次。每3 d 記錄瘤體顏色及腫瘤生長情況。在給予曲安奈德注射后第7、14 天每組隨機處死3 只小鼠，取血管瘤組織分別提取RNA 和蛋白，行WB 和qPCR 檢測GRα、Notch1、Hes1、EGFR。剩余每組對3 只小鼠血管瘤細胞做免疫組化檢測GRα、Notch1、Hes1、EGFR 的表達。

1.4 觀察指標

①檢測小鼠體重及瘤體體積改變。

②WB 實驗。取腫瘤組織，棄去培養基，用RIPA 裂解液提取總蛋白。12 000 r/min 高速離心機4℃離心10 min，取上清液，BCA 蛋白定量試劑盒對總蛋白進行定量。對蛋白樣品進行變性后，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE），后用300 mA 恒流轉膜1.5 h。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜用脫脂奶粉封閉后，一抗4℃孵育過夜，次日PVDF 膜室溫孵育二抗2 h，用發光液浸濕PVDF 膜，置于超高靈敏度化學發光成像系統中進行顯影。所使用的抗體及對應稀釋倍數見表1。

表1 抗體名稱及稀釋倍數

③實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）實驗。采用Trizon 試劑提取細胞中的總RNA，采用RNA 超純提取試劑盒提取mRNA，利用紫外可見分光光度計測定mRNA 的濃度和純度（OD260/OD280），通過RNA 逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用熒光PCR 儀進行熒光定量PCR。反應步驟如下：預變性95℃，10 min；變性95℃，10 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，30 s；40 個循環。引物序列見表2。

表2 引物序列

④免疫組化。采用免疫組化檢測GRα、Notch1、Hes1、EGFR 的蛋白表達水平。腫瘤組織切片，烤片、脫蠟、水化后，用檸檬酸緩沖液進行抗原修復。經5%BSA 抗原封閉后，用兔抗GRα 抗體（1:200），兔抗Notch1 抗體（1:200），兔抗Hes1 抗體（1:100），兔抗EGFR 抗體（1:100），辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1:100）孵育，經DAB 顯色，蘇木素復染反藍，脫水透明后，封片，在顯微鏡下觀察。

1.5 統計方法

應用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較應用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組小鼠腫瘤體積及體重變化對比

與Control 組相比，其余兩組的體重顯著下降，Control+TA for 7 days 處理組中，腫瘤體積下降最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3 組小鼠體重（A）與腫瘤體積（B）變化對比

2.2 3 組小鼠WB 檢測腫瘤組織中蛋白表達情況對比

與Control 組相比，Control+TA for 7 days 處理組和Control+TA for 14 days 處理組中GRα、Notch1 和EGFR 蛋白表達顯著下降，而HES1 蛋白顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3 組小鼠腫瘤組織中蛋白表達情況對比

2.3 3 組小鼠腫瘤組織中GRα、Notch1、Hes1 和EGFR 的mRNA 表達情況對比（qPCR）

與Control 組相比，Control+TA for 7 days 處理組和Control+TA for 14 days 處理組中GRα、Notch1 和HES1 蛋白表達顯著下降，而EGFR 蛋白顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 3 組小鼠腫瘤組織中GRα、Notch1、Hes1 和EGFR 的mRNA 表達情況對比

2.4 3 組小鼠腫瘤組織中GRα、Notch1、Hes1 和EGFR 表達情況對比（免疫組化）

與Control 相比，Control+TA for 7 days 處理組化和Control+TA for 14 days 處理組中GRα、Notch1、HES1 蛋白和EGFR 陽性細胞減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 3 組小鼠腫瘤組織中GRα、Notch1、Hes1 和EGFR 表達情況對比

3 討論

糖皮質激素治療能有效抑制血管瘤生長，促進其消退，且瘤內注射糖皮質激素較少出現因治療所致的嚴重容貌損害，有簡單易行、不良反應少、見效較快等特點[2]。有研究結果已說明糖皮質激素受體是介導糖皮質激素作用的關鍵因素[3]。GRα 是糖皮質激素受體的亞型。Notch 受體亞型中存在含有糖皮質激素反應元件，且是參與增殖發育功能的基因。哺乳動物中存在4 種Notch 基因，即Notch1～4。研究表明Notch 信號通路在血管的發育與穩定中起著關鍵作用[4-6]。本研究在前期對人體的血管瘤組織進行糖皮質激素治療敏感性研究的基礎上，通過應用血管瘤動物模型，探討了糖皮質激素治療前后糖皮質激素受體以及Notch 信號通路關鍵因子的變化的關系，并進一步探究糖皮質激素治療血管瘤敏感性及其機理。本研究首次反映細胞增殖分化的Notch 信號通路應用于激素治療血管瘤組織中糖皮質激素受體及其亞型的表達與激素治療敏感性關系的研究。

本研究結果中：WB 實驗結果顯示，與Control 組相比，Control+TA for 7 days 處理組和Control+TA for 14 days 處理組中GRα、Notch1 和EGFR 蛋白表達顯著下降，而HES1 蛋白顯著上升（P＜0.05）；qPCR 實驗結果顯示，與對照組相比，Control+TA for 7 days 處理組和Control+TA for 14 days 處理組中GRα、Notch1 和HES1 蛋白表達顯著下降，而EGFR 蛋白顯著上升（P＜0.05）；免疫組化結果顯示，與Control 組相比，Control+TA for 7 days 處理組免疫組化和Control+TA for 14 days 處理組中GRα、Notch1、HES1 和EGFR 陽性細胞減少，表明曲安奈德可使裸鼠模型血管瘤組織GRα、Notch1 表達明顯下降（P＜0.05）。

綜上所述，Notch 信號通路參與了曲安奈德治療血管瘤的作用過程。為認識嬰幼兒血管瘤發病機制及治療方法的選擇提供了新的視角。