基于數據分析及生物膜干涉探討中醫治療糖尿病腎病的用藥規律*

張圓琳,祁曉鳴,馮逸佳,衛紫琪,宋麗娟

(1.山西中醫藥大學中藥與食品工程學院,晉中 030619;2.山西中醫藥大學基于炎性反應的重大疾病創新藥物山西省重點實驗室,晉中 030619;3.國家中醫藥管理局多發性硬化益氣活血重點研究室,晉中 030619)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最嚴重的并發癥,也是導致糖尿病患者死亡的主要原因[1-2]。目前,臨床主要通過降壓、降糖的方式控制DN進展,尚無針對DN的特異治療方法[3]。中醫在辨證論治的基礎上,開發了多種防治DN的中藥復方及制劑[4-7],參芪地黃降糖顆粒、金水寶膠囊、益腎健脾湯等已被臨床廣泛使用并且取得了良好的治療效果。但是,中藥成分復雜,物質基礎和作用機制尚不明確,阻礙了中醫藥現代化的研究進程。數據挖掘[8-9]為系統地認識中醫藥治療疾病的組方規律、指導處方加減化裁、擬定新方提供了合理的解決辦法。網絡藥理學[10]為分析中藥治療DN的物質基礎及作用機制開辟了新方向。生物膜干涉[11]已被廣泛應用于中藥物質基礎的研究中,為驗證中藥活性成分與DN核心蛋白的相互作用提供了實驗依據。本研究以古今醫案云平臺DN專病醫案庫為基礎,利用數據挖掘、網絡藥理學及生物膜干涉的方法,探索中醫治療DN的用藥規律,發現核心藥對組合及其治療DN的作用機制,為臨床合理選用DN治療藥物提供新思路及新方法。

1 材料與方法

1.1材料 ForteBio Octet K2生物膜干涉儀(FortiBio公司),異鼠李素、槲皮素(含量>98%,成都曼思特公司),人重組白細胞介素(interleukin,IL)6蛋白(Sino Biological公司)。

1.2數據來源與分析 “古今醫案云平臺”由中國中醫科學院中醫藥信息研究所大健康智能研發中心設計研發,該平臺收錄醫案數據40余萬條,兼具醫案檢索與分析挖掘功能,是總結中醫藥經驗的重要工具。在該平臺的專病醫案庫中選擇疾病種類為DN,并進行嚴格篩選:西醫診斷明確為DN,不伴隨其他并發疾病,僅使用中藥治療,且中藥處方組成完整。利用平臺的數據挖掘功能,對病案中涉及的中藥進行頻次統計及藥物關聯分析。

1.3化學成分靶點篩選 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP),對核心藥對化學成分及相應靶點進行篩選,參數[10]設為:口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug like,DL)≥0.18。

1.4DN靶點篩選 以“Diabetic Nephropathy”及“Diabetic Kidney Disease”為關鍵詞在TTD、DISGENET及GENE CARD數據庫收集疾病靶基因并進行整合。在OmicShare平臺繪制DN靶基因與藥物靶基因韋恩圖,取交集得到核心藥對治療DN的潛在靶點。

1.5核心藥對治療DN蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI )網絡及化學成分-靶點-疾病網絡構建 在STRING網站構建蛋白互作網絡,選擇物種為Homo sapiens,交互作用可信度(combined score)閾值≥0.7,其余參數為默認值。運用Cytoscape 3.7.1版軟件將蛋白互作網絡可視化,獲得PPI網絡中前10的關鍵基因,其中,節點大小、顏色深淺與度值正相關,作為關鍵靶點的篩選依據,同時構建化學成分-靶點-疾病網絡圖。

1.6基因功能和通路富集分析 利用生物學信息注釋數據庫(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID),設置P<0.05為篩選條件,對篩選到的靶點進行GO生物學功能和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)富集分析。

1.7黃芪-丹參-茯苓藥對化學成分與關鍵靶點分子對接 利用Sybyl-2.1軟件的SurFlex-Dock(SFXC)模塊對該藥對中的化學成分與關鍵靶點進行分子對接研究。小分子優化選用Tripos力場,電荷類型為Gasteiger-Huckel,Gradient設為0.005,Max Iteration設為1 000次。蛋白做殘基修飾,加氫,Amber7 FF99力場下加AMBER電荷,生成口袋,進行柔性對接。

1.8生物膜干涉實驗 使用Octet K2生物分子互作儀,檢測異鼠李素、槲皮素與IL-6的結合。將人重組IL-6蛋白包被于超級鏈霉親和素(super streptavidin,SSA)傳感器,浸沒于不同濃度的化合物溶液中,結合、解離時間均為60 s。采用Data Analysis 11版軟件對數據進行收集與分析。

2 結果

2.1中藥使用頻次統計 篩選出2008—2018年間101例患者的醫案183條。涉及中藥333味,總用藥頻次1 050次。使用頻次居前10位的中藥及其用量見表1。在183條醫案所記載方劑中,黃芪出現43次,為使用頻次最高的一味中藥,而且方中重用黃芪,平均使用劑量為37 g,最大使用劑量達到了60 g;丹參與茯苓次之,使用頻次均為36次,平均使用劑量分別為23、21 g,最大使用劑量也分別達到了30、45 g。

表1 治療DN的中藥使用頻次(前10位)及劑量

2.2藥物關聯規則分析 置信度反映了前一種中藥出現時,后一種中藥也出現的概率;提升度則表明兩藥之間的相關性,提升度>1表明正相關性越高,提升度<1且越低則表明負相關性越高,提升度=1則表明無相關性。在置信度≥0.60,且提升度≥1.00的條件下,得到藥物關聯分析結果(表2)。對183條醫案所記載方劑中的中藥進行組方規律分析,方藥中以黃芪(單獨出現43次)為基礎,同時配伍茯苓、丹參的頻次分別為28次與25次,是組方中與黃芪配伍最多的2味中藥。在此基礎上,進一步分析了黃芪-丹參-茯苓同時出現的頻次為19次,具有最高的置信度與提升度。因此,選擇這3味中藥作為臨床治療DN的常用藥對,并利用網絡藥理學的方法對其作用機制進行研究。

表2 高頻中藥關聯分析

2.3黃芪-丹參-茯苓化學成分篩選 篩選到化學成分共計100個,黃芪20個,丹參65個,茯苓15個,多為三萜類、酚酸類、黃酮類及甾體類化合物。部分化合物信息見表3。

表3 黃芪-丹參-茯苓中的成分

2.4黃芪-丹參-茯苓治療DN潛在靶點預測 使用TCMSP數據庫檢索到100個化學成分對應的144個靶點,與TTD、DISGENET及GeneCards數據庫中的DN疾病靶點取交集,發現共同靶點89個(圖1),即為黃芪-丹參-茯苓治療DN的潛在靶點。

圖1 黃芪-丹參-茯苓靶點與DN靶點韋恩圖

2.5黃芪-丹參-茯苓治療DN PPI網絡及成分-靶點-疾病網絡結果分析 將“2.4節”中89個藥物-疾病共同靶點作PPI網絡圖(圖2),共包含79個節點,337條邊,平均節點度為8.53。選取節點度值大于2倍度值均數的蛋白作為黃芪-丹參-茯苓防治DN的關鍵靶蛋白。其中排名前10的靶點是IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管內皮生長因子A (vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)8、MAPK1、JUN、TP53、IL-1β、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和前列素內環氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2),為該藥對治療DN的核心靶點。藥對-化學成分-靶點-疾病網絡圖展示了100個化合物與89個靶點的作用情況(圖3)。綠色圓形代表黃芪、丹參、茯苓3種中藥,粉色圓形、亮綠色圓形及黃色圓形代表3種中藥對應的化學成分,棕色圓形代表黃芪與茯苓的共有成分,藍色圓形代表疾病,紅色圓形代表靶點。在網絡中,化合物作用的靶點數越多,度值越高,據此列出了前10個化學成分,括號里為度值:槲皮素(57)、山奈酚(29)、木犀草素(26)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(25)、刺芒柄花素(23)、異鼠李素(22)、丹參新醌(21)、二氫丹參內酯(18)、鼠尾草酚酮(17)、丹參酮ⅡA(16)。由此可見,同一種成分可以與多個靶點對應,同一個靶點亦可以與多種成分對應,說明藥材中多種成分可通過作用于多個靶點發揮協同治療作用,體現了中藥多成分、多靶點的特點。

2.6KEGG富集分析 KEGG富集分析結果根據P值列出前15條通路,并繪制高級氣泡圖(圖4)。其中包括腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signalingpathway)等。與藥物成分、靶點相關程度最高的通路為TNF炎癥信號通路,共富集到9個基因。其中,IL-6與TNF-α位于TNF炎癥信號通路最下游,是該通路激活后釋放的關鍵促炎因子。提示TNF炎癥信號通路和靶點可能是黃芪-丹參-茯苓組分抗DN的核心途徑和潛在作用靶點。

圖4 核心靶基因KEGG富集分析氣泡圖

2.7黃芪-丹參-茯苓藥對化學成分與關鍵靶點分子對接結果 將“2.5節”中列出的10個化合物與IL-6(PDB ID 4cni)、TNF(PDB ID 2az5)及VEGFA(PDB ID 4kzn)進行分子對接研究,按照Total Score得分高低進行排序(表4),Total Score≥5即認為化合物與靶點有較好結合,對接得分值>7提示具有強烈的結合作用[12]。化合物與關鍵靶點IL-6的時按得分均>5,其中7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、異鼠李素、槲皮素和丹參酮ⅡA與IL-6的對接得分均>7,具有強烈的結合活性。因此,選取這4個化合物與IL-6進行體外實驗驗證。

表4 活性成分與靶蛋白的分子對接

2.8異鼠李素、槲皮素與IL-6的結合作用 生物膜干涉實驗結果表明,在10～100 μmol·L-1濃度區間,異鼠李素、槲皮素與IL-6有較強的結合作用力,解離常數(KD)分別為56與68 μmol·L-1,這與分子對接的結果基本吻合,并且呈現出迅速結合,迅速解離的趨勢(圖5)。盡管7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇與IL-6具有最高的得分,但是化合物難以獲得;丹參酮ⅡA與SSA傳感器存在強烈的非特異性結合,導致擬合數據異常。因此,實驗中僅檢測了異鼠李素、槲皮素與IL-6的結合作用。

圖5 活性成分(異鼠李素和槲皮素)與IL-6的結合解離圖

3 討論

本研究利用數據挖掘技術對古今醫案云平臺DN專病醫案庫進行用藥規律分析。共納入有效方劑183條,涉及中藥333味。發現臨床治療DN使用次數最多的是黃芪(43次)、其次是丹參(36次)、茯苓(36次)、山藥(23次)、澤瀉(21次)等。方中重用黃芪,以加強補氣之功效;丹參活血祛瘀;茯苓兼具補氣與利水之功效,符合中醫治療DN的原則。以黃芪為基礎,通過對不同藥物進行關聯分析,發現“黃芪-丹參-茯苓”為治療DN的最基本組合。

通過網絡藥理學的方法分析了“黃芪-丹參-茯苓”治療DN的作用機制。成分靶點與疾病靶點取交集后,發現了共同靶點89個。對它們進行PPI網絡分析,篩選到節點度值>2倍平均度值的核心靶點10個,依次為IL-6、TNF、VEGFA、MAPK8、MAPK1、JUN、TP53、IL-1β、EGF和PTGS2。KEGG富集分析發現的關鍵信號通路包括TNF炎癥信號通路、MAPK信號通路、NOD樣受體信號通路以及Toll樣受體信號通路,它們在調節腎臟疾病的炎癥反應中起重要作用[13-14],而炎癥是DN發生與發展的重要病理因素[15]。TNF炎癥信號通路共富集到基因9個,包括IL-6、TNF-α及IL-1β等核心靶點,這些促炎因子均位于TNF炎癥信號通路最下游,激活后會加重炎癥反應,涉及DN的各個階段。研究發現,IL-6作為一種促炎因子,通過與IL-6受體或其他蛋白質形成復合物,激活下游的免疫、炎癥反應,損傷腎小球、系膜細胞、足細胞等腎臟細胞,使腎小球基底膜增厚,出現蛋白尿,誘發、加劇DN[16]。研究表明,重組的抗IL-6受體融合蛋白[17]通過阻斷IL-6受體,抑制了IL-6信號通路下游的免疫、炎癥反應,從而對DN起到了一定的治療作用。這也提示,通過靶向IL-6,而不是IL-6受體來阻斷IL-6信號通路引起的炎癥反應,可能是未來治療DN的一種新選擇。

通過研究中藥活性成分與靶蛋白的相互作用,有利于闡明中藥藥理作用機制。分子對接技術與生物膜干涉技術可分別在虛擬篩選及體外實驗水平分析藥物分子與靶蛋白之間的相互作用。生物膜干涉技術[18]可以實時檢測蛋白質與藥物小分子的相互作用情況,廣泛應用于中藥活性成分發現與作用機制研究。通過測定動力學常數,可以反映藥物小分子與蛋白質間的結合情況。解離常數(KD)值可反映小分子與靶蛋白的結合強度,結合速率常數(association rate constant,Kon)與解離速率常數(dissociation rate constant,Koff)可反映小分子與靶蛋白的作用特點。實驗結果表明,異鼠李素和槲皮素與IL-6的對接得分值>7,具有強烈的結合作用。生物膜干涉實驗也證實2種成分與IL-6具有較強的結合作用力,并且呈現出迅速結合,迅速解離的趨勢,預示上述2種成分具有抑制IL-6信號通路、減輕炎癥反應的潛力。

因此,TNF炎癥信號通路和IL-6可能是“黃芪-丹參-茯苓”治療DN的核心途徑和潛在作用靶點。本研究篩選到的槲皮素[19]、山奈酚[20]及木犀草素[21]已被證實對DN具有治療作用,但是作用機制尚不明確,特別是針對IL-6信號通路的研究較少。后續研究中仍需擴大分析樣本,聯合使用多種實驗技術手段,在細胞及動物水平觀察核心成分對IL-6信號通路以及細胞生物功能的調節作用。